Для обнаружения и исследования микроорганизмов приме­няют микроскопы.

Световые микроскопы предназначены для изучения микро­организмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т.п.), а электронные – для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бак­терий. Современные световые микроскопы – это сложные оп­тические приборы, обращение с которыми требует определен­ных знаний, навыков и большой аккуратности.

Световые микроскопы подразделяются на студенческие, ра­бочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микро­скопы ("Биолам", "Бимам", "Микмед") имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С – студенческие, Р – рабочие, Л– лабораторные, И – исследовательские), ком­плектация обозначается цифрой, например          МБР-1, МБИ-3.

В микроскопе различают механическую и оптическую час­ти (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Микроскопы.

а – общий вид микроскопа "Биолам"; б – микроскоп МБР-1: 1 – основание микроскопа; 2 – предметный столик; 3 – винты для перемещения предметно­го столика; 4 – клеммы, прижимающие препарат; 5 – конденсор; 6 – крон­штейн конденсора; 7 – винт, укрепляющий конденсор в гильзе; 8 – рукоятка перемещения конденсора; 9 – рукоятка ирисовой диафрагмы; 10 – зеркало; 11 – тубусодержатель; 12 – рукоятка макрометрического винта;         13 – рукоятка микрометрического винта; 14 – револьвер объектива; 15 – объективы;                         16 – наклонный тубус; 17 – винт для крепления тубуса; 18 – окуляр.

К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конден­сора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микроме­ханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конден­сора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую стороны, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввин­чиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через кото­рый наблюдают изображение, устанавливают с противополож­ной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Основную роль в получении изображения играет объектив, формирующий увеличенное действительное и перевернутое изо­бражение объекта, которое затем дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, дающий аналогично обычной лупе увеличенно мнимое изображение (рис. 2.2).

Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изо­бражения, его четкость определяется разрешающей способнос­тью микроскопа, т.е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения – минималь­ное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно, – зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура в свою оче­редь зависит от угловой апертуры объектива и показателя пре­ломления среды, находящейся между фронтальной линзой объ­ектива и препаратом. Угловая апертура – это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и пре­паратом, к показателю преломления стекла, тем выше разре­шающая способность объектива. Если считать апертуру кон­денсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

Рис. 2.2. Ход лучей в микро­скопе с настройкой освещения по Кёлеру.

а – принципиальная схема микроскопа и осветительной системы: 1 – источник света; 2 – коллектор; 3 – полевая диафрагма осветителя; 4 – зеркало; 5 – апертурная диафрагма конденсора; 6 – конденсор; 7 – препарат; Т – увеличенное действительное промежуточное изображение, образуемое объективом; 7 – увеличенное мнимое окончательное изображение, наблюдаемое в окуляр; 8 – объектив; 9 – выходной зрачок объектива; 10 – полевая диафрагма окуляра; 11–окуляр; 12 – глаз;

б – принцип освещения по Кёлеру:                 1 – источник света; 2 – коллектор;                       3 – полевая диафрагма; 4 – светофильтр;             5 – апертурная диафрагма; 6 – конденсор; 7 – объект; 8 – объектив

где R – предел разрешения; λ – длина волны; NA– числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное уве­личение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличен­ной в 500–1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

В зависимости от среды, которая находится между объекти­вом и препаратом, различают "сухие" объективы малого и среднего увеличения (до х40) и иммерсионные с максимальны­ми апертурой и увеличением (х90–100). "Сухой" объектив – это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую такой же по­казатель преломления, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллирован­ную воду, а для объективов масляной иммерсии – кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируют­ся, и оно, в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя поль­зоваться суррогатами иммерсионного масла, в частности вазе­линовым маслом.

Изображение, полученное с помощью линз, имеет недостат­ки: сферические и хроматические аберрации, кривизну поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков разли­чают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Со­ответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, получен­ное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО – апохромат и т.п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объектив масляной иммерсии – обозначение МИ и черное кольцо.

Все объективы рассчитаны на работу с покровным стеклом толщиной 0,17 мм. Толщина покровного стекла особенно вли­яет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (х40). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм, потому что толщина покровного стекла может оказаться боль­ше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае при попытке сфокусировать объектив на препарат может быть по­вреждена фронтальная линза объектива.

  • Окуляры состоят из двух линз и бывают нескольких типов, каждый из которых применяют с определенным типом объ­ектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
  • Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом мик­роскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное зна­чение для правильного освещения препарата.
  • Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и по­левой диафрагмы, от раскрытия которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить парал­лельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необ­ходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Настройка освещения и фокусировка микроскопа. Качество изображения в значительной мере зависит также от правиль­ного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее распростра­ненным является способ установки света по Кёлеру, который заключается в следующем: 1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа; 2) включают лампу осветителя и направ­ляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа; 3) помещают препарат на предметный столик микроскопа;                                  4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе; 5) убирают лист бумаги с зеркала; 6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слег­ка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние от осветителя до микро­скопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (на­блюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроско­па); 7) открывают апертурную диафрагму конденсора, умень­шают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы; 8) при малом увеличении (х10), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата; 9) слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафраг­мы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резко­го изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препа­рата (вокруг них может быть видна цветная каемка); 10) рас­крывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора; 11) при смене объектива необходимо проверить настройку света.

После окончания настройки света по Кёлеру нельзя изменять положение конденсора, раскрытие полевой и апертурной диа­фрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.

Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное – к значительному ухудшению качества изобра­жения (появлению дифракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на 1/3- Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до х10) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение, – с сильными сухими (х40) и иммерсионными (х90) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбо­ку, опускают объектив макровинтом почти до соприкоснове­ние с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом. При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверх­ности линз, зеркал и светофильтров.

Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла по­лотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чис­тым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов кси­лолом, так как это может привести к их расклеиванию.

С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нель­зя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы – это приведет к их порче. По окончании работы с микроскопом необходимо тщательно удалить остатки иммер­сионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом, затем опустить предметный столик (или кон­денсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.

Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо пе­риодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитан­ной бескислотным вазелином, и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии, существуют ме­тоды микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные мик­роорганизмы: фазово-контрастная, темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа, используют электронную микроскопию.