Дифференциация и идентификация возбудителей (опреде­ление родовой, видовой и типовой принадлежности микроор­ганизмов) – наиболее ответственный этап микробиологичес­кого исследования. Он осуществляется на основании изучения целого комплекса свойств микроорганизмов: морфологичес­ких, тинкториальных, культуральных, ферментативных и анти­генных.

Широкий спектр микроорганизмов, играющих роль в воз­никновении инфекционного процесса, требует изучения фер­ментативной активности выделенных микроорганизмов путем постановки большого количества различных биохимических реакций, позволяющих по сочетанию полученных результатов в комплексе с другими данными определить вид микроорга­низма. Этот раздел работы наиболее трудоемкий, проводится в несколько этапов, требует приготовления большого количе­ства питательных сред, дефицитных реактивов, посуды и т.д. При переходе от классических методов к современным ориен­тир следует смещать от многоступенчатых исследований к уни­фицированной процедуре с приданием большего значения стандартизации, ускорению, воспроизводимости, миниатюри­зации и автоматизации.

Коммерческие микротест-системы или слайды для биохими­ческой идентификации микроорганизмов различных групп – это готовые к использованию полистироловые панели (или планшеты) с сухими дифференциальными средами. В нашей стране такие тест-системы производят в Ставрополе (ФГУП "Аллерген"), Махачкале (НПО "Питательные среды"), Ниж­нем Новгороде (НПО "Диагностические системы"), Санкт-Пе­тербурге (НИИЭМ им.Л.Пастера). Достаточно известны в на­шей стране диагностические панели API (фирма "bioMerieux", Франция), BBL Crystal (фирма "Becton Dickinson", США), тест-панели "Bio-Rad" (Франция), MICRO-LA-TEST (фирма "PLIVA-Lachema", Чехия) и др. для идентификации различных микроорганизмов.

Для работы широкого круга микробиологических лаборато­рий с практической точки зрения наилучшим образом себя зарекомендовали тест-системы мультимикротестов для биохи­мической идентификации энтеробактерий (ММТ El и ММТ Е2) и коринебактерий (ММТ D) производства ФГУП "Ал­лерген", а также диагностикумы MICRO-LA-TEST фирмы "PLIVA-Lachema" для идентификации широкого спектра воз­будителей, ответственных за возникновение гнойно-воспали­тельных и инфекционных заболеваний (энтеробактерий и виб­рионы, стафилококки, стрептококки, энтерококки, нефермен-тирующие грамотрицательные бактерии, анаэробы, нейссерии). Данные микротест-системы представляют собой цельнолитую или стрипованную (разделенную на 8-луночные стрипы) пластмас­совую пластинку-планшет размером 8,5 х 12,5 см с 96 лунками. В лунках содержатся высушенные питательные среды и суб­страты для биохимических реакций, которые растворяются по­сле добавления суспензии микроорганизмов (инокулята испы­туемых штаммов). Дифференциальные биохимические тесты-ре­акции в тест-системах подобраны таким образом, чтобы про­вести идентификацию наибольшего количества таксонов за один этап. В течение времени инкубации во время размноже ния микроорганизмов происходят биохимические реакции, ре­зультаты которых можно зарегистрировать либо визуально, либо при помощи приборов-фотометров по изменению цвета индика­тора (рис. 17.1). В дальнейшем техника работы с тест-системами будет рассмотрена на примере указанных тест-систем.

 
   

Рис. 17.1. Микротест-система для идентификации микроорганизмов.

17.1.1. Общие правила работы с микротест-системами для идентификации микроорганизмов

Методика проведения микробиологических исследований с использованием микротест-систем должна полностью соответ­ствовать инструкциям, прилагаемым к каждому виду тест-сис­тем. Качество тест-систем контролируют с помощью контроль­ных референтных бактериальных культур, перечень которых приводится в инструкциях к тест-системам. Тем не менее суще­ствует общий унифицированный подход к идентификации мик­роорганизмов при помощи микротест-систем, техника работы с которыми достаточно проста и состоит из следующих этапов.

  1. Выделение культуры.

При идентификации микроорганизмов необходимо работать только с чистой культурой, поскольку присутствие посторон­них микроорганизмов может исказить результаты исследова­ния и послужить поводом для ошибочного заключения. Выде­ляют чистые культуры общепринятыми в микробиологии ме­тодами. Особое внимание следует уделять качеству питатель­ных сред, используемых для выделения возбудителей инфек­ционного процесса. От этого зависят и количество идентифи­цируемых видов, и успех идентификации.

По результатам первичного посева и данных микроскопии проводится дифференциация культур на грамположительные и грамотрицательные кокки и палочки.

  1. Приготовление бактериальной суспензии:
  • бактериальную суспензию готовят в суспензионной среде (прилагается к тест-системе или указывается в инструк­ции) из чистой 18–24-часовой культуры бактерий опре­деленной степени мутности по стандарту МсFarland (для отечественных тест-систем – стандарт ОСО). Тщательно гомогенизируют суспензию. Слишком густая или жидкая суспензия может привести к ложным результатам;
  • параллельно делают контрольный высев суспензии куль­туры на кровяной агар для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и(или) для постановки дополнитель­ных тестов;
  • эту же суспензию используют для постановки дополни­тельных тестов с диагностическими полосками.1
  1. Инокуляция:
  • суспензию бактерий тщательно встряхивают и в необхо­димом объеме (указывается в инструкции) инокулируют в ячейки в соответствии с инструкцией к тест-системе;
  • после инокуляции в определенные лунки для создания анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое (или парафиновое) масло.
  1. Инкубация:
  • инокулированные тест-системы в полиэтиленовых паке­тах или прикрытые крышками инкубируют в термостате при температуре 30–37 °С в течение 4–48 ч (в зависи­мости от вида тест-системы).
  1. Оценка результатов:
  • по окончании инкубации проверяют чистоту культуры по контрольному посеву;
  • при отсутствии роста в лунках следует увеличить время (продолжительность) инкубации;
  • добавляют в определенные лунки необходимые реактивы;
  • учитывают результаты биохимических реакций визуально с помощью таблиц "Интерпретация реакций" и(или) цветовых шкал и заносят их в бланки.
  1. Идентификация:

– идентификацию проводят с помощью таблиц биохими­ческой активности, профильных индексов, диагностичес­ких регистров (книг кодов) или компьютерной про­граммы.

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре микроорганизма (микроскопию, характер роста колоний, наличие пигмента, подвижность, источник выделения и т. д.). При идентифика­ции с помощью таблиц биохимической активности проводят поиск вида культуры с аналогичными результатами реакций. Такой метод пригоден и достаточно достоверен для групп с малым количеством тестов и таксонов. Идентификацию с ис­пользованием профильных индексов применяют для определе­ния вида бактерий путем вычисления их цифрового профиля. Это позволяет проводить интерпретацию результатов по стан­дартной процедуре. В профильные индексы включено боль­шинство возможных комбинаций тестов, с их использованием возможна идентификация типичных культур, включенных в "Идентификационную таблицу" тест-системы.

Методика расчета профиля культуры. Результаты срабатыва­ния биохимических реакций переводят в цифровой код – про­филь. Для этого всю последовательность тестов в тест-системе (от первого до последнего) разбивают на триады. В каждой из триад положительно сработавшим тестам присваивают число­вые значения: первый тест в триаде –"1", второй тест в триаде – "2", третий тест в триаде – "4". Всем отрицательным результатам присваивается "0".

Суммируют числовые значения в триадах. Полученный чис­ловой код соответствует профилю исследуемого микроорганизма.

Например:

1.

Фер­мента­ция глю­козы

(GLF)

2.

Аце­тоин (VРТ)

3.

Фе-

нил-

ала-

нин

(РНЕ)

4.

Индол (IND)

5.

Саха­роза (SUC)

6.

Уреаза (URE)

7.

Лизин (LYS)

8.

Орни-

тин

(ORN)

Био­хими­ческий ряд

+

+

 

+

+

+

 

Оцен­ка тес­тов

1

2

0

0

2

4

1

0

Чис­ловые значе­ния

3

6

1

Про­филь

В книге кодов полученный профиль (код) 361 соответствует культуре вида Klebsiella pneumoniae/pneumoniae.

На практике аналогично рассчитанный профиль использу­ется при идентификации с помощью книг кодов, при этом для каждого таксона определяются два следующих показателя:

▲ процент идентификации (%id) – показывает, насколько по­лученный профиль соответствует идентифицируемому мик­робу по сравнению с другими таксонами, включенными в банк данных (%id – критерий отличия микроба от других таксонов);

▲ Т-индеке (Tin) – показывает соответствие профиля полу­ченной культуры большинству типичных реакций для иден­тифицированного таксона. Значение этого показателя ва­рьирует от 0 до 1 и обратно пропорционально количеству атипичных для таксона тестов.

Книги кодов позволяют получать достоверную идентифика­цию и в случае выявления 1–2 атипичных для исследуемого таксона результатов (тестов).

Идентификация микроорганизмов семейства Enterobacteriaсеае. Идентификацию микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae следует проводить с использованием микротест-систем: ММТ El и ММТ Е2 (ФГУП "Аллерген"), ENTEROtest 24, ENTEROtest 16, ENTERO-Rapid 24, ENTERO-Screen, а также диагностических полосок COLItest и SALMtest ("PLIVA-La­chema") и других диагностикумов.

Применение систем мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2. Системы мультимикротестов ММТ El и ММТ Е2 предназна­чены для определения биохимической активности и последую­щей идентификации наиболее распространенных представите­лей семейства энтеробактерий и дифференциации их от неко­торых бактерий из семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ММТ El позволяет определить 12 ключевых тестов: образова­ние сероводорода, индола, наличие лизиндекарбоксилазы, ор-нитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, ути­лизация цитрата натрия, малоната натрия, маннитола, сахаро­зы, лактозы и сорбита. ММТ Е2 позволяет определить 12 дополнительных биохимических свойств, которые в сочетании с 12 ключевыми тестами, определяемыми в ММТ El, служат для видовой идентификации энтеробактерий: наличие арги-ниндегидролазы, бета-галактозидазы, нитратредуктазы, утили­зация инозитола, дульцита, арабинозы, рамнозы, мальтозы, адонита, раффинозы, салицина, глюкозы.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глю­козы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментирующих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциа­ции энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.

Применение микротест-системы ENTEROtest 24. ENTERO­test 24 предназначен для определения биохимической актив­ности и идентификации наиболее важных для патологии чело­века микроорганизмов семейства энтеробактерий и дифферен­циации их от некоторых представителей семейства вибрионов в течение 18–24 ч. ENTEROtest 24 позволяет провести для каждой культуры 24 биохимических теста, размещенных в трех­рядных стрипах (3×8 лунок): индол, сероводород, лизин, орнитин, уреаза, аргинин, цитрат Симмонса, малонат натрия, фенилаланин, бета-галактозидаза (ONPG), инозит, адонит, цел-лобиоза, сахароза, трегалоза, маннитол, ацетоин (Фогес– Про-скауэр), эскулин, рамноза, сорбитол, мелибиоза, раффиноза, дульцит, глюкоза.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо или кровяного агара. Ставят тест на ферментацию глю­козы (O/F-тест) на среде Хью–Лейфсона для установления принадлежности выделенной культуры к группе ферментиру­ющих микроорганизмов и тест на оксидазу для дифференциа­ции энтеробактерий от вибрионов и других оксидазоположи-тельных культур.

Применение микротест-системы ENTEROtest 16. ENTEROtest 16 предназначен для определения биохимической активности и последующей идентификации наиболее важных для патоло­гии человека микроорганизмов семейства энтеробактерий в течение 18–24 ч. Система представляет собой двухрядный стрип (2×8 лунок) с высушенными питательными средами и реагентами для определения 16 ключевых тестов: сероводород, лизин, индол, орнитин, уреаза, фенилаланин, эскулин, цитрат Симмонса, малонат, инозит, адонит, целлобиоза, сахароза, сор­битол, трегалоза и маннитол. Идентификация должна быть дополнена тестами на бумажных полосках для определения цитохромоксидазы, бета-галактозидазы и продукции ацетоина (VP-тест).

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, кровяного агара или агара MacConkey. Следует также поставить тест на ферментацию глюкозы для установления факта принадлежности выделенной культуры к группе фермен­тирующих микроорганизмов. Ставят тест на выявление цито­хромоксидазы с помощью полосок OXI-тест для выявления оксидазоположительных микроорганизмов из родов Aeromonas, Plesiomonas и Vibrio. Биохимическую идентификацию сальмо­нелл, шигелл и кишечной палочки, выделенной у больных с гастроэнтеритами, подтверждают серологически.

Ускоренные методы идентификации некоторых энтеробактерий

Применение микротест-системы ENTERO-Screen. ENTERO-Screen предназначен для ускоренной (в течение 4 ч) иденти­фикации энтеробактерий, наиболее часто встречающихся при мочевых и других инфекциях, а также для выявления сальмо­нелл и кишечной палочки в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Система представляет собой стрип (8 лунок) с субстратами для определения 8 ключевых тестов: глюкоза в анаэробных условиях, ацетоин, фенилаланин, индол, сахароза, уреаза, лизин, орнитин. Идентификация должна быть допол­нена тестами на бумажных полосках: OXI-тест, PYR-тест на выявление пиразы, SALMtest для обнаружения присутствия сальмонелл и COLItest для обнаружения присутствия E.coli.

Для идентификации используют чистую культуру со среды Эндо, агара MacConkey, кровяного агара, ставят тест на цито-хромоксидазу (OXI-тест).

Следует обращать внимание на то, что некоторые культуры сальмонелл могут показывать отрицательную или замедленную реакцию в тестах на лизин или орнитин. В случае подозрения на принадлежность к роду сальмонелл выполняют расширен­ную идентификацию при помощи набора ENTEROtest 16 или ENTEROtest 24. Аналогично поступают с культурами, которые не удалось идентифицировать при помощи ENTERO-Screen. При окончательной идентификации учитывают всю дополни­тельную информацию (характер роста колоний, микроскопию, утилизацию лактозы, подвижность, источник выделения и т.д.). При отрицательном тесте ферментации глюкозы в анаэ­робных условиях можно предположить отнесение данной куль­туры к неферментирующим бактериям.

Применение микротест-системы ENTERO-Rapid 24. Набор ENTERO-Rapid 24 предназначен для быстрой идентификации наиболее важных для патологии человека энтеробактерий за 4 ч при помощи 24 тестов, размещенных в трехрядных стрипах (3x8 лунок): индол, лизин, орнитин, уреаза, сахароза, сорбитол, трегалоза, глюкоза, пираза, эскулин, целлобиоза, мелибиоза, салицин, манноза, мальтоза, раффиноза, ацетоин (Фогес– Проскауэр), фенилаланин, малонат натрия, бета-галактозидаза (ONPG), бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, бета-кси-лозидаза, ^ацетил-бета-О-глюкозаминидаза.

Использование диагностических полосок для ускоренной ори­ентировочной идентификации сальмонелл и кишечной палочки (SALMtest, COLItest). Диагностическая полоска SALMtest пред­назначена для обнаружения типичного для рода сальмонелл признака – активности фермента С8-эстеразы. Высокая чувст­вительность теста по отношению к роду сальмонелл вместе с несложной методикой выполнения и быстротой получения результатов реакции позволяют применить SALMtest в скринин-говых исследованиях для обнаружения сальмонелл не только в клинике, но и в пищевой промышленности и т.п.

Принцип действия SALMtest фермент С8-эстераза гидро-лизирует 4-метилумбеллиферил каприлат, содержащийся в тес­товой зоне полоски. Освобожденный 4-метилумбеллиферрон под воздействием ультрафиолетовых лучей (применяется УФ-лампа с длиной волны испускаемого света около 360 нм) флюоресцирует синим светом, что регистрируется как положи­тельная реакция.

Методика постановки SALMtest:

∆ для тестирования используют 24-часовую культуру, подо­зрительную на сальмонеллы, со среды Эндо, агара с брил­лиантовым зеленым, агара МасСоnкеу, агара с эозин-метиленовым синим1;

∆ добавляют на тестовую зону полоски приблизительно 10 мкл специального реактива для SALMtest;

∆ при помощи микробиологической петли распределяют про­веряемую культуру по зоне; в случае чистой культуры (или же достаточно хорошо изолированных друг от друга коло­ний на агаровой среде) можно снимать культуру с поверх­ности агара, приложив к ней непосредственно полоску;

∆ полоску инкубируют 10–15 мин при комнатной температуре;

∆ по истечении упомянутого времени учитывают реакцию под УФ-лампой; положительная реакция проявляется возникно­вением синей флюоресценции в зоне полоски;

∆ штаммы с положительной реакцией в последующем иден­тифицируют, например, при помощи набора ENTERO-Screen.

Примечания к методике постановки SALMtest:

∆ при проведении теста всегда используют отрицательный контроль: реактив добавляют на зону полоски и инкубируют без нанесения бактериальной культуры;

∆ считывание реакции под УФ-лампой выполняют в темноте, лучше всего в специальной установке, предназначенной для оценки флюоресценции (например, шкаф Гансена);

∆ несмотря на то, что SALMtest дает ложноположительные реакции у некоторых микроорганизмов, он дает положи­тельный результат у 100 % сальмонелл.

Диагностические полоски СОLItest предназначены для бы­строй идентификации кишечных палочек и дифференциации их от других грамотрицательных оксидазоотрицательных бактерий, выделенных из клинического материала, пищевых про­дуктов, воды и т.д. Идентификация основана на определении глюкуронидазной активности и образования индола. Результа­ты анализов учитываются через 4 ч инкубации в термостате.

Принцип метода: фермент бета-глюкуронидаза расщепляет 4-метилумбеллиферил-D-глюкуронид с высвобождением при этом 4-метилумбеллиферона, который в ультрафиолетовых лу­чах флюоресцирует голубым светом. Продукция индола из L-триптофана определяется по появлению красного окраши­вания после добавления специфического реагента на индол (р-диметиламинобензальдегид).

Методика постановки СОLItest:

∆ для проведения исследования используют культуру коли-формных бактерий и(или) грамотрицательных оксидазоот-рицательных палочек;

∆ готовят 0,5–1,0 мл суспензии тестируемого микроорганизма в стерильном физиологическом растворе, мутность суспен­зии должна соответствовать номеру 3 по шкале McFarland;

∆ помещают полоску СОLItest в пробирку с суспензией (бу­мажная зона полоски должна быть полностью погружена в суспензию);

∆ инкубируют пробирки с полосками при температуре 37°С в течение 4 ч (предварительный результат теста на глюку-ронидазную активность может быть получен через 1 ч).

Учет результатов:

∆ сначала учитывают результаты глюкуронидазной реакции в темном месте с использованием УФ-лампы (длина волны 360 нм);

∆ затем в пробирку с суспензией добавляют 4–5 капель реак­тива на индол.

Оценка результатов:

у типичных штаммов кишечной палочки – глюкуронидаза (+), индол (+). У некоторых штаммов кишечной палочки мо­жет быть глюкуронидаза (–), индол (+) или глюкуронидаза (+), индол (–). Такие штаммы подлежат дальнейшей идентифика­ции при помощи микротест-систем1.

Идентификация неферментирующих микроорганизмов при по­мощи микротест-системы при помощи микротест-системы NEFERMtest 24. NEFERMtest 24 предназначен для биохимической идентификации грамотрицатель­ных неферментирующих бактерий, прежде всего из клиничес­кого материала. При помощи этой тест-системы можно также выполнить идентификацию встречающихся в клинической практике представителей ферментирующих оксидазоположи-тельных грамотрицательных палочек. Тест-система представля­ет собой трехрядный стрип (3x8 лунок) с субстратами для проведения 24 тестов: индол, аргинин, уреаза, лизин, глюкоза, фруктоза, инозитол, сахароза, фосфатаза, бета-галактозидаза, бета-глюкозидаза, М-ацетил-бета-Б-глюкозаминидаза, манни-тол, ксилоза, целлобиоза, галактоза, нитраты, нитриты, эскулин, гамма-глутамилтрансфераза, лактоза, мальтоза, трегалоза и цитрат Симмонса.

Чистую культуру следует выделять на кровяном агаре (агар с кровью барана). С чистой 24-часовой культурой ставят тест на выявление цитохромоксидазы (полоска OXI-тест). При окон­чательной идентификации следует учитывать всю дополнитель­ную информацию (источник выделения бактерий, характер роста колоний, микроскопию и другие характеристики: нали­чие пигмента или флюоресценции, рост при температуре 42 °С, гемолиз, рост на агаре MacConkey, наличие каталазной ак­тивности, подвижности, гидролиза желатина, результаты O/F-теста).

Идентификация стафилококков при помощи микротест-систе­мы STAPHYtest 16. STAPHYtest 16 предназначен для быстрого и надежного отличения стафилококков от других грамположительных кокков (Micrococcus, Stomatococcus и Aerococcus), про­стой и быстрой идентификации клинически важных видов стафилококков. Тест-система представляет собой двухрядный вертикальный стрип (2x8 лунок) с субстратами для проведе­ния 16 тестов: уреаза, аргинин, орнитин, бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидониларила-мидаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, маль­тоза, манноза, глюкоза/новобиоцин. Дополнительно следует использовать бумажные полоски для определения ацетоина (VP-тест) и определения цитохромоксидазы (OXI-тест).

Выделяют чистую культуру на кровяном агаре в соответст­вии с инструкцией к тест-системе.

Идентификация стрептококков при помощи микротест-систе­мы STREPTOtest 16. STREPTOtest 16 предназначен для опре­деления биохимической активности и идентификации стреп­тококков по 16 биохимическим тестам, расположенным в двух­рядном стрипе (2x8 лунок): гиппурат, фосфатаза, лейцинами-нопептидаза, бета-глюкуронидаза, альфа-галактозидаза, эску­лин, аргинин, уреаза, маннитол, сорбитол, трегалоза, лактоза, раффиноза, инулин, мелибиоза и рибоза. Идентификацию сле­дует дополнить тестами на бумажных полосках для выявления пирролидонилариламидазы и образования ацетоина.

Чистую культуру выделяют на агаре с кровью барана. Ин­кубацию посевов производят в атмосфере с содержанием 5 % углекислого газа. Для выявления каталазной активности мик­роорганизмов ставят тест на предметном стекле с 3 % раство­ром перекиси водорода.

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию о культуре (микроскопию, ха­рактер роста колоний, наличие пигментообразования, гемолиз, источник выделения и т.д.).

Идентификация энтерококков при помощи микротест-системы EN-COCCUStest. EN-COCCUStest позволяет идентифициро­вать клинически значимые виды энтерококков при помощи восьми биохимических тестов (стрип из 8 лунок): аргинин, сорбоза, арабиноза, маннитол, сорбитол, мелибиоза, раффино­за и мелецитоза. Для выявления типичного для энтерококков теста – активности пирролидонилариламидазы – следует ис­пользовать тест-полоску PYR-тест.

Для идентификации используют чистую культуру, выращен­ную на агаре с кровью барана. Ставят другие тесты для под­тверждения принадлежности изолята к роду энтерококков. При окончательной идентификации следует учитывать всю допол­нительную информацию (источник выделения, микроскопию, характер роста колоний и т.д.). Образование желтого пигмента и подвижность являются важными признаками при идентифи­кации энтерококков.

Идентификация нейссерий при помощи микротест-системы NEISSERIAtest. Тест-система NEISSERIAtest предназначена для определения биохимической активности оксидазоположи-тельных, грамотрицательных кокков и коккобацилл, позволяет идентифицировать патогенные нейссерий (N.gonorrhoeae, N.me­ningitidis) и Moraxella (Branhamella) catarrhalis и дифференциро­вать их от сапрофитирующих нейссерий. Тест-система содер­жит субстраты для определения 7 ключевых биохимических тестов (один стрип из 8 лунок): глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, гамма-глутамилтрансфераза, трибутирин, синтез по­лисахаридов. 8-я лунка стрипа содержит высушенную пита­тельную среду для постановки контроля. Дополнительно сле­дует провести тест на наличие бета-галактозидазы (при помо­щи полоски ONP-тест).

Чистую культуру следует выделять на шоколадном агаре или сывороточном агаре. Чашки с агаром перед посевом нагревают до 35–37 °С. Чашки после посева инкубируют при повышен­ном содержании углекислого газа и в атмосфере повышенной влажности воздуха при температуре 35–37°С в течение 18–24 ч. Из чистой культуры делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют, ставят тесты на наличие оксидазы и ката-лазы. Грамотрицательные кокки и диплококки с положитель­ной реакцией на оксидазу и каталазу следует идентифицировать с помощью NESSERIAtest (исключение составляет N.elongata, представляющая собой каталазоотрицательную па­лочку).

При окончательной идентификации следует учитывать всю дополнительную информацию (микроскопию, характер роста колоний, гемолиз, пигментацию и т.д.).

Идентификация коринебактерий при помощи микротест-сис­темы ММТ D. Тест-система предназначена для определения биохимической активности и определения токсигенности ко­ринебактерий дифтерии и дифференциации их от других ко­ринебактерий, встречающихся в клиническом материале. Тест-система содержит субстраты для определения 5 ключевых био­химических тестов: глюкоза, сахароза, крахмал, уреаза, нит­раты – и диагностические бумажные диски для определения токсигенности.

Чистую культуру выделяют на среде мартеновский агар или питательный агар с добавлением 20 % сыворотки крупного рогатого скота или нормальной лошадиной сыворотки.

Учитывают результаты планшетных тестов и теста на ток-сигенность. Идентификацию следует проводить с учетом дан­ных по характеру роста, морфологии колоний, микроскопии, наличия цистиназы (проба Пизу), источников изоляции и др.

Идентификация анаэробов при помощи микротест-системы ANAEROtest 23. ANAEROtest 23 предназначен для биохимичес­кой идентификации анаэробных бактерий, прежде всего из клинического материала и из пищевых продуктов. Тест-систе­ма представляет собой тройной стрип (3x8 лунок) с реагентами для проведения 23 тестов: индол, глюкоза, мальтоза, фруктоза, галактоза, лактоза, мелецитоза, уреаза, нитраты, сахароза, са­лицин, трегалоза, маннитол, рамноза, N-ацетил-бета-D-глюко-заминидаза, бета-глюкозидаза, эскулин, манноза, раффиноза, целлобиоза, ксилоза, арабиноза и сорбитол.

Выделяют чистую культуру с использованием сред, реко­мендованных для изоляции и культивирования анаэробных бактерий, например агар Wilkins-Chalgren. Из чистой культу­ры готовят мазок и окрашивают по Граму, учитывают морфо­логию (форму и агрегацию клеток, наличие спорообразования). Окраску по Граму в сомнительных случаях можно дополнить тестом со щелочью (3 % раствор КОН). Грамположительные палочки следует проверить на терморезистентность (выдержи­вание в течение 15 мин при температуре 80 °С). Для контроля проводят культивирование каждого штамма в аэробных усло­виях.

Особенности приготовления бактериальной суспензии и инокуляции планшета:

  • • в соответствии с инструкцией к тест-системе из чистой 48-часовой культуры следует приготовить суспензию в суспензионной среде для ANAEROtest 23. Мутность суспензии должна соответствовать номеру 3 по стандарту мутности Мсrland. При гомогенизации ампулу с суспензионной средой держат в вертикальном положении и двигают петлей по ее внутренней поверхности, предупреждая попадание воздуха в суспензионную среду. Инокулирование тест-сис­темы не должно превышать 20 мин.

ANAEROtest 23 следует инкубировать с индикатором анаэ­робной атмосферы.

Идентификация. По микроскопии относят идентифицируе­мую анаэробную культуру к одной из четырех групп:

∆ грамотрицательные палочки;

∆грамположительные спорообразующие палочки;

∆ грамположительные неспорообразующие палочки;

∆ кокки.

При окончательной идентификации анаэробных бактерий следует учитывать всю дополнительную информацию (источ­ник выделения, характер роста колоний, результаты тестов на патогенность и токсигенность, а также другие характеристики).

Наиболее частые причины неудач при идентификации мик­роорганизмов с использованием коммерческих микротест-сис­тем следующие:

∆ наличие смешанной культуры;

∆использование суспензий микроорганизмов с недостаточ­ной мутностью или в недостаточном объеме;

∆ перекрестная контаминация суспензий в расположенных рядом лунках;

∆ соответствующие лунки не заполнены парафиновым мас­лом;

∆ попадание реактивов в лунки соседнего ряда; Д нарушение инструкции к тест-системе при проведении ис­следования;

∆ недостижение анаэробной атмосферы при культивировании

   анаэробных бактерий;

∆ возможно выделение штамма с нетипичными свойствами или

его данные не заложены в идентификационные таблицы.

17.1.2. Применение микротест-систем для оценки антибиотикочувствительности

Оценка антибиотикочувствительности микроорганизмов требует тщательной стандартизации всех этапов исследования, наличия качественных питательных сред и антибиотиков (это относится как к методу серийных разведений, так и к диско-диффузионному методу). Одним из удобных и достаточно эко­номичных путей преодоления описанных проблем является использование готовых мик­ротест-систем, действие кото­рых основано на принципе метода серийных микроразве­дений в варианте погранич­ных концентраций (тест по­граничных концентраций – ТПК). Их применение избав­ляет от проведения наиболее трудоемких подготовительных этапов исследования (приготовления и стандартизации пита­тельных сред с растворами антибиотиков), врач получает воз­можность сконцентрировать свое внимание на получении чис­той культуры микроорганизма и стандартизации суспензии. В Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА, Москва) выпускаются тест-системы ТПКтест, которые разра­ботаны на основе стандартных 96-луночных планшетов, что позволяет проводить как визуальный учет результатов, так и автоматизированный с использованием планшетных фото­метров.

Рис. 17.2. Микротест-система ТПК-тест для определения анти­биотикочувствительности мик­роорганизмов.

ТПК-тест – это микротест-система однократного примене­ния, позволяющая определить чувствительность четырех ис­следуемых микроорганизмов одновременно к 11 или 12 анти­биотикам Или шести микроорганизмов к 8 антибиотикам. В на­стоящее время выпускаются 5 типов тест-систем с оптималь­ными наборами антибиотиков для групп микроорганизмов: энтеробактерий, грамположительных бактерий, псевдомонад, возбудителей уроинфекций, стафилококков. ТПКтест (рис. 17.2) представляет собой полистироловый планшет (8x12 лу­нок), в котором содержатся 4 или 6 аналогичных наборов высушенных растворов антибиотиков в питательной среде. Каждый антибиотик представлен двумя пограничными кон­центрациями, позволяющими дифференцировать микроорга­низмы по степени чувствительности на три категории: "чувст­вительные", "умеренно-устойчивые" и "устойчивые". Большая концентрация соответствует минимальному значению МПК (минимальная подавляющая рост микроба концентрация) для устойчивых штаммов, малая концентрация соответствует мак­симальному значению МПК для чувствительных штаммов. Пример расположения и концентрации антибиотиков в лунках планшета ТПКтест на 4 культуры и 11 антибиотиков приведен на схеме-таблице.

Пример расположения антибиотиков на планшете ТПК-тест

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

32

64

32

64

64

8

32

8

32/16

32

4

Кр

В

8

8

8

16

8

4

16

4

8/4

8

1

Кр

С

32

64

32

64

64

8

32

8

32/16

32

4

Кр

D

8

8

8

16

8

4

16

4

8/4

8

1

Кр

Е

32

64

32

64

64

8

32

8

32/16

32

4

Кр

F

8

8

8

16

8

4

16

4

8/4

8

1

Кр

G

32

64

32

64

64

8

32

8

32/16

32

4

Кр

H

8

8

8

16

8

4

16

4

8/4

8

1

Кр

 

амп

цфс

цфд

цфп

цфр

тоб

ами

ген

а/с

фрк

цип

 

Вертикальные ряды имеют цифровое обозначение. Горизон­тальные ряды имеют буквенное обозначение. Антибактериаль­ные препараты: амп – ампициллин, цфс – цефотаксим, цфд – цефтазидим, цфп – цефоперазон, цфр – цефтриаксон, тоб – тобрамицин, ами – амикацин, ген – гентамицин, а/с – ампициллин/сульбактам, фрк – цефуроксим, цип – ципрофлоксацин, Кр – контроль роста. Концентрации антибактериальных препаратов выражены в мкг/мл.

В тест-системе ТПКтест на 6 культур в одной культуре отводится два вертикальных ряда: в нечетных рядах – макси­мальные концентрации препаратов, в четных – минимальные.

Методика проведения исследования унифицирована для всех типов тест-систем и предполагает поэтапное выполнение следующих операций.

  • • Выделение культуры:
  • выделение чистой культуры следует проводить общепри­нятыми в микробиологии методами;
  • для инокулирования тест-системы следует использовать чистую 18–24-часовую культуру с плотной питательной среды или чистую бульонную культуру.
  • • Приготовление бактериальной суспензии:
  • из изолированной колонии готовят суспензию в дистил­лированной воде и доводят мутность до номера 0,5 стан­дарта мутности по МсFarland;
  • полученную взвесь разводят в 1000 раз стерильной дис­тиллированной водой;
  • полученная суспензия содержит приблизительно 105 микробных клеток в 1 мл.
  • • Инокулирование тест-системы:
  • суспензию бактерий тщательно встряхивают;
  • инокулируют по 100 мкл суспензии в лунки горизонталь­ных рядов в тест-систему ТПК-тест на 4 культуры или вертикальных рядов в ТПКтест на 6 культур.
  • • Инкубирование:
  • после инокулирования накрывают планшет крышкой;
  • инкубируют планшеты в течение 18–24 ч в термостате при температуре 36±1 "С.
  • • Учет результатов:

– проводят визуально по наличию или отсутствию роста испытуемых микроорганизмов, который оценивается по помутнению питательной среды в лунках или фотомет­рически с применением планшетного фотометра и про­граммного обеспечения; использование автоматизиро­ванной системы позволяет получить результаты антибио-тикочувствительности большинства культур уже через 6 ч от момента выделения чистой культуры.

  • • Интерпретация результатов:
  • культура "чувствительна" к антибиотику при отсутствии роста в обеих лунках с большой и малой концентрациями антибиотика;
  • культура "устойчива" к антибиотику при наличии роста в обеих лунках;
  • культура "умеренно-устойчива" к антибиотику при нали­чии роста в лунке с меньшей концентрацией и отсутст­вии роста в лунке с большей концентрацией.