Конец 90-х годов ознаменовался широким использованием новых методических подходов в диагностике заболеваний че­ловека и животных. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования. Они позволили по-новому подойти к решению ряда основных вопросов инфек­ционной и инвазионной патологии и даже предложить новые подходы для контроля лечения заболеваний. Принципиальный шаг в диагностике, который уже сделан и получает свое даль­нейшее развитие как в прикладном, так и в фундаментальном аспекте, связан с амплификационным методом выявления ге­нетического материала инфекционных и инвазионных агентов, революционизировавшим молекулярную генетику, медицин­скую и ветеринарную диагностику, а именно методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1985 г. американским биохимиком фирмы "Cetus" К. Mullís, ко­торый в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии. ПЦР стала всеобъемлющим методом. Одной из важнейших областей применения ПЦР является идентификация патогенных организмов, являющихся возбудителями заболева­ний людей, животных или растений.

ПЦР – это эффективный способ получения большого ко­личества специфических нуклеотидных последовательностей ДНК in vitro. В основе метода лежит многократное копирова­ние (репликация) с помощью фермента ДНК-полимеразы за­ведомо выбранного исследователем из известной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК, который является маркерным, т.е. уникальным для данного вида возбу­дителя. С внедрением этого метода отпала необходимость вы­делять и чистить ДНК-мишень, и даже очень небольшой по объему и необработанный материал может быть подвергнут детекции. Механизм репликации таков, что достраивание ни­тей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки (праймеры), представляю­щие собой специально химически синтезированные in vitro олигонуклеотиды. Праймеры комплементарны последователь­ностям на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осущест­вляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение коли­чества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n – число циклов амплификации (увеличения). Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется количеством олигонуклеотидных пар амп-лифицируемой последовательности и праймера. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. Амп­лификация последовательности в более чем миллион раз до­стигается в результате трехэтапного циклического процесса. Основными компонентами ПЦР являются: 1) два синтетичес­ких олигонуклеотидных праймера (~20 нуклеотидов каждый), комплементарные районам, находящимся на противополож­ных нитях и фланкирующим искомую мишенную последова­тельность ДНК; 2) искомая последовательность ДНК в образце любой природы, в частности клинической пробе; 3) термоста­бильная ДНК-полимераза, которая может выдержать нагрева­ние до 95° и выше; 4) четыре дезоксирибонуклеотида, необхо­димых для синтеза ДНК, комплементарной искомому фраг­менту.

 
   

Рис. 14.1. Первый цикл процесса амплификации искомого фрагмента ДНК возбудителя в ПЦР.

1 – денатурация двунитевой молекулы ДНК; 2 – присоединение или отжиг стартовых блоков (или праймеров) для последующего комплементарного до­страивания нитей ДНК; 3 – комплементарное достраивание нитей ДНК с помощью фермента Тед-полимеразы и дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ).

Типичный процесс ПЦР заключается в большом количест­ве циклов синтеза (амплификации) специфической последо­вательности ДНК; при этом каждый цикл состоит из трех этапов.

  1. Денатурация. Первый (I) этап амплификационной систе­мы ПЦР – это тепловая денатурация образца ДНК в результате повышения температуры в реакционной пробирке до 95°С. Кроме исходной ДНК, в реакционной пробирке содержится избыточное количество двух нуклеотидных праймеров, термо­стабильная ДНК-полимераза (Таq ДНК-полимераза, выде­ленная из бактерий Thrmus aquaticus) и четыре дезоксирибонуклеотида. Высокая температура поддерживается в течение 1 мин.
  2. Ренатурация. На II этапе температура в смеси медленно понижается до ~55 °С. На этом этапе праймеры спариваются с комплементарными им последовательностями в исходной ДНК.
  3. Синтез. На III этапе температура поднимается до ~75 °С, являющейся оптимальной для каталитической активности Таq ДНК-полимеразы. Синтез ДНК инициируется с 3'-гидроксильного конца каждого праймера (рис. 14.1).

Каждый этап и смена температуры, необходимая для цикла ПЦР, обычно осуществляются в автоматическом программи­руемом нагревательном блоке, в котором находятся реакцион­ные пробирки. Каждый цикл обычно продолжается 3–5 мин (рис. 14.2).

 
   

 

 

 

 

Рис. 14.2. Второй и последующие циклы процесса амплификации искомого фрагмента ДНК возбудителя в ПЦР.

В настоящее время разработкой диагностических тест-сис­тем на основе ПЦР занимаются специалисты; готовые тест-системы, включающие все необходимые компоненты реакции для идентификации различных возбудителей инфекционных заболеваний, можно приобрести в различных фирмах.

14.1. Преимущества ПЦР как метода диагностики инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека

  • Прямое определение наличия возбудителей.

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являю­щиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфек­ции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя ме­тодом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

  • Высокая чувствительность.

ПЦР в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим при необходимости выявлять единичные клетки возбудителей инфекционных, инвазионных заболеваний независимо от их природы, даже в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бакте­риологическими, микроскопическими, паразитологическими и др.) их выявление невозможно.

Чувствительность ПЦР тест-систем составляет 10–1000 кле­ток возбудителя в анализируемой пробе, в то время как чувст­вительность иммунологических, паразитологических тестов ко­леблется в пределах 103–105 клеток.

  • Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода обусловлена тем, что в ис­следуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида фрагмент ДНК либо РНК. Специфич­ность задается нуклеотидной последовательностью специфи­ческих праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения или "отжига" к искомой моле­куле ДНК.

  • Простота исполнения, возможность полной автоматизации и быстрота получения результатов.

Диагностика с помощью полимеразной цепной реакции со­стоит из трех частей: обработки исследуемого материала, т.е. приготовления образца ДНК или РНК, амплификации задан­ного фрагмента и регистрации результатов реакции. За счет автоматизации данных процессов эти процедуры занимают около 6–8 ч.

В настоящее время для выявления возбудителей практичес­ки всех заболеваний может быть использован один набор при­боров и незначительно различающиеся наборы реактивов. В свя­зи с химическим родством нуклеиновых кислот появилась воз­можность выявления организмов в различных биологических жидкостях путем создания универсальной процедуры приго­товления пробы, выделения ДНК, постановки реакции и учета результатов.

  • Использование для анализа непосредственно клинического и патологического материала.

Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя заболеваний непосредственно в клиническом материале (кровь, сыворотка крови, мазки, смывы, соскобы, слюна, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, биоптаты и т.д.), различном патологическом материале (образцы тканей и орга­нов), а также в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.). Для проведения анализа не требу­ется выделения и выращивания культуры возбудителя. Посто­янно совершенствующиеся методы обработки исследуемого материала позволяют сократить затрачиваемое время до мини­мума.

  • Малое количество используемого материала для исследований.

Количество исследуемого материала может составлять не­сколько десятков микролитров, так как в результате проведе­ния ПЦР концентрация анализируемого участка ДНК (РНК) выявляемого возбудителя увеличивается в сотни и тысячи раз.

  • Полимеразная цепная реакция позволяет осуществлять диа­гностику острых, хронических, латентных инфекций и пара­зитарных инвазий.

ПЦР тест-системы особенно эффективны при диагностике, некультивируемых, труднокультивируемых или персистирую-щих форм патогенных организмов, с которыми часто прихо­дится сталкиваться при хронических и латентных инфекциях, инвазиях, при тестировании организмов в объектах внешней среды. Особенно это важно при обследовании серонегативных пациентов на самых ранних стадиях развития патологического процесса, когда лечение наиболее эффективно. Это обусловле­но тем, что ПЦР-диагностикумы позволяют избежать труднос­тей, связанных с размножением таких организмов в лаборатор­ных условиях. При диагностике с помощью ПЦР достигается размножение не тестируемого организма, а только специфи­ческого фрагмента его ДНК, являющегося маркерным для дан­ного вида.

  • Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

Исследуемый материал может быть дезинфицирован хими­ческой или термической обработкой в момент его взятия, следовательно, исключается возможность инфицирования пер­сонала в процессе проведения ПЦР.