Конец 90-х годов ознаменовался широким использованием новых методических подходов в диагностике заболеваний человека и животных. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования. Они позволили по-новому подойти к решению ряда основных вопросов инфекционной и инвазионной патологии и даже предложить новые подходы для контроля лечения заболеваний. Принципиальный шаг в диагностике, который уже сделан и получает свое дальнейшее развитие как в прикладном, так и в фундаментальном аспекте, связан с амплификационным методом выявления генетического материала инфекционных и инвазионных агентов, революционизировавшим молекулярную генетику, медицинскую и ветеринарную диагностику, а именно методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1985 г. американским биохимиком фирмы "Cetus" К. Mullís, который в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии. ПЦР стала всеобъемлющим методом. Одной из важнейших областей применения ПЦР является идентификация патогенных организмов, являющихся возбудителями заболеваний людей, животных или растений.
ПЦР – это эффективный способ получения большого количества специфических нуклеотидных последовательностей ДНК in vitro. В основе метода лежит многократное копирование (репликация) с помощью фермента ДНК-полимеразы заведомо выбранного исследователем из известной нуклеотидной последовательности определенного фрагмента ДНК, который является маркерным, т.е. уникальным для данного вида возбудителя. С внедрением этого метода отпала необходимость выделять и чистить ДНК-мишень, и даже очень небольшой по объему и необработанный материал может быть подвергнут детекции. Механизм репликации таков, что достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки (праймеры), представляющие собой специально химически синтезированные in vitro олигонуклеотиды. Праймеры комплементарны последовательностям на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n – число циклов амплификации (увеличения). Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется количеством олигонуклеотидных пар амп-лифицируемой последовательности и праймера. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. Амплификация последовательности в более чем миллион раз достигается в результате трехэтапного циклического процесса. Основными компонентами ПЦР являются: 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера (~20 нуклеотидов каждый), комплементарные районам, находящимся на противоположных нитях и фланкирующим искомую мишенную последовательность ДНК; 2) искомая последовательность ДНК в образце любой природы, в частности клинической пробе; 3) термостабильная ДНК-полимераза, которая может выдержать нагревание до 95° и выше; 4) четыре дезоксирибонуклеотида, необходимых для синтеза ДНК, комплементарной искомому фрагменту.
Рис. 14.1. Первый цикл процесса амплификации искомого фрагмента ДНК возбудителя в ПЦР.
1 – денатурация двунитевой молекулы ДНК; 2 – присоединение или отжиг стартовых блоков (или праймеров) для последующего комплементарного достраивания нитей ДНК; 3 – комплементарное достраивание нитей ДНК с помощью фермента Тед-полимеразы и дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ).
Типичный процесс ПЦР заключается в большом количестве циклов синтеза (амплификации) специфической последовательности ДНК; при этом каждый цикл состоит из трех этапов.
- Денатурация. Первый (I) этап амплификационной системы ПЦР – это тепловая денатурация образца ДНК в результате повышения температуры в реакционной пробирке до 95°С. Кроме исходной ДНК, в реакционной пробирке содержится избыточное количество двух нуклеотидных праймеров, термостабильная ДНК-полимераза (Таq ДНК-полимераза, выделенная из бактерий Thrmus aquaticus) и четыре дезоксирибонуклеотида. Высокая температура поддерживается в течение 1 мин.
- Ренатурация. На II этапе температура в смеси медленно понижается до ~55 °С. На этом этапе праймеры спариваются с комплементарными им последовательностями в исходной ДНК.
- Синтез. На III этапе температура поднимается до ~75 °С, являющейся оптимальной для каталитической активности Таq ДНК-полимеразы. Синтез ДНК инициируется с 3'-гидроксильного конца каждого праймера (рис. 14.1).
Каждый этап и смена температуры, необходимая для цикла ПЦР, обычно осуществляются в автоматическом программируемом нагревательном блоке, в котором находятся реакционные пробирки. Каждый цикл обычно продолжается 3–5 мин (рис. 14.2).
Рис. 14.2. Второй и последующие циклы процесса амплификации искомого фрагмента ДНК возбудителя в ПЦР.
В настоящее время разработкой диагностических тест-систем на основе ПЦР занимаются специалисты; готовые тест-системы, включающие все необходимые компоненты реакции для идентификации различных возбудителей инфекционных заболеваний, можно приобрести в различных фирмах.
14.1. Преимущества ПЦР как метода диагностики инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека
- • Прямое определение наличия возбудителей.
Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
- • Высокая чувствительность.
ПЦР в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим при необходимости выявлять единичные клетки возбудителей инфекционных, инвазионных заболеваний независимо от их природы, даже в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими, паразитологическими и др.) их выявление невозможно.
Чувствительность ПЦР тест-систем составляет 10–1000 клеток возбудителя в анализируемой пробе, в то время как чувствительность иммунологических, паразитологических тестов колеблется в пределах 103–105 клеток.
- • Высокая специфичность.
Высокая специфичность метода обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного вида фрагмент ДНК либо РНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью специфических праймеров и специально отрабатываемыми жесткими условиями их присоединения или "отжига" к искомой молекуле ДНК.
- • Простота исполнения, возможность полной автоматизации и быстрота получения результатов.
Диагностика с помощью полимеразной цепной реакции состоит из трех частей: обработки исследуемого материала, т.е. приготовления образца ДНК или РНК, амплификации заданного фрагмента и регистрации результатов реакции. За счет автоматизации данных процессов эти процедуры занимают около 6–8 ч.
В настоящее время для выявления возбудителей практически всех заболеваний может быть использован один набор приборов и незначительно различающиеся наборы реактивов. В связи с химическим родством нуклеиновых кислот появилась возможность выявления организмов в различных биологических жидкостях путем создания универсальной процедуры приготовления пробы, выделения ДНК, постановки реакции и учета результатов.
- • Использование для анализа непосредственно клинического и патологического материала.
Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя заболеваний непосредственно в клиническом материале (кровь, сыворотка крови, мазки, смывы, соскобы, слюна, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, биоптаты и т.д.), различном патологическом материале (образцы тканей и органов), а также в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.). Для проведения анализа не требуется выделения и выращивания культуры возбудителя. Постоянно совершенствующиеся методы обработки исследуемого материала позволяют сократить затрачиваемое время до минимума.
- Малое количество используемого материала для исследований.
Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров, так как в результате проведения ПЦР концентрация анализируемого участка ДНК (РНК) выявляемого возбудителя увеличивается в сотни и тысячи раз.
- • Полимеразная цепная реакция позволяет осуществлять диагностику острых, хронических, латентных инфекций и паразитарных инвазий.
ПЦР тест-системы особенно эффективны при диагностике, некультивируемых, труднокультивируемых или персистирую-щих форм патогенных организмов, с которыми часто приходится сталкиваться при хронических и латентных инфекциях, инвазиях, при тестировании организмов в объектах внешней среды. Особенно это важно при обследовании серонегативных пациентов на самых ранних стадиях развития патологического процесса, когда лечение наиболее эффективно. Это обусловлено тем, что ПЦР-диагностикумы позволяют избежать трудностей, связанных с размножением таких организмов в лабораторных условиях. При диагностике с помощью ПЦР достигается размножение не тестируемого организма, а только специфического фрагмента его ДНК, являющегося маркерным для данного вида.
- • Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.
Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его взятия, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.