Питательные среды, применяемые в практике санитарно-микробиологических исследований, подразделяются на 2 группы:
• первая предназначена для определения общей обсемененности объектов среды, не предусматривая дифференциацию выделенных микроорганизмов;
• вторая специальная группа сред, учитывая физико-химические особенности исследуемых объектов окружающей среды, используется для выделения микроорганизмов, принадлежащих к определенным таксономическим группам.
При видовой или родовой идентификации выделенных микроорганизмов пользуются большей частью средами, применяемыми в клинической микробиологии для культивирования и дифференциальной диагностики определенных групп микро¬организмов.

Рецепт 87. Питательный агар (Himedia, Nutrient Agar, cat. M001)
Питательный агар общего назначения рекомендован для культивирования микроорганизмов, которые не требуют специальных питательных добавок.
Состав: г/л
Пептон 5,0
Натрия хлорид (NaCl) 5,0
Говяжий экстракт 1,5
Агар 15,0–20,0
pH 7,4±0,2
Приготовление. Суспендировать 28 г в 100 мл дистиллиро¬ванной воды. Кипятить до полного растворения частиц среды. Стерилизовать при 121 °С в течение 15 мин. Разливать, соблюдая правила асептики, в пробирки, чашки Петри.
Учет результатов. Через 24–36 ч инкубации в термостате.

Рецепт 88. Питательный агар (ФС 42-188 ВС-88)
Питательная среда предназначена для культивирования широкого спектра микроорганизмов. Может также служить в качестве агарово-белковой основы для конструирования разно¬образных питательных сред.
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
кильки 17,9
или
Панкреатический гидролизат
криля мороженного 23,1
Натрия хлорид 11,2
pH 7,3±0,2
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в колбе с 1000 мл дистиллированной воды, прокипятить 1–2 мин до полного расплавления агара, профильтровать и разлить в пробирки или флаконы. Стерилизовать при 121 °С в течение 20 мин. После стерилизации среду остудить до 45–50 °С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4–5 см.
После застывания среду (с приоткрытыми крышками), соблюдая правила асептики, подсушить в термостате при температуре 37 °С.
Готовая среда соломенного цвета, прозрачная.
Учет результатов производят через 18–20 ч инкубации при 37 °С.

Рецепт 89. Питательный агар (среда № 1 ГРМ ВФС 42-2988–97)
Среда культивирования и подсчета широкого спектра аэробных бактерий.
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
рыбной муки 15,0
Панкреатический гидролизат
казеина 10,0
Экстракт пекарных дрожжей
(или дрожжевой импортный) 2,0
Хлорид натрия (NaCl) 3,5
Глюкоза 1,0
Агар 10–20
Препарат в количестве, указанном на этикетке, для приготовления питательной среды, размешивают в 1000 мл дистиллированной воды, кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 20±5 мин, разливают в стерильные чашки Петри и после застудневания подсушивают в термостате.
Питательная среда предназначена для определения общей обсемененности лекарственных препаратов, микробиологического контроля воды, молока, пищевых продуктов. Для приготовления двукратной или какой-либо иной концентрации пользуются увеличением навески сухого препарата во столько раз, во сколько должна быть увеличена концентрация среды.

Рецепт 90. Питательный бульон (Himedia, Nutrient Agar, cat M002)

Питательный бульон общего назначения для выращивания нетребовательных микроорганизмов.

Состав:                                         г/л

Пептон                                           5,0

Хлорид натрия                              5,0

Говяжий экстракт                         1,5

Дрожжевой экстракт                    1,5

pH 7,4±0,2

Приготовление. Суспендировать 13 г в 1000 мл дистиллиро­ванной воды. Кипятить до полного растворения введенных ингредиентов среды. Стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Использование. Это очень экономичная среда для выращивания рутинных бактерий. Добавление других ингредиентов, таких как углеводы, кровь, сыворотка, делает ее подходящей для специальных целей.

Результаты. Рост на среде выявляется через 18–24 ч после инкубации при 35 °С.

Рецепт 91. Питательный бульон с 1 % раствором пепто­на (Himedia, Nutrient Broth –                1 % Pepton, cat. M244)

Питательная среда с 1 % раствором пептона используется для выращивания широкого спектра микроорганизмов.

Состав:                                         г/л

Пептон                                           10,0

Хлорид натрия                              5,0

Говяжий экстракт                         10,0

pH 7,4±0,2

Приготовление. Суспендировать 25 г в 1000 мл дистиллиро­ванной воды. Кипятить до полного растворения среды. Стери­лизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.

Использование. Среда используется для определения микроб­ной обсемененности объектов окружающей среды.

Результаты роста учитываются через 18–48 ч инкубации посевов при температуре 35 °С.

Питательный бульон в санитарной микробиологии может быть использован в виде среды стандартной прописи (одинар­ный бульон), двукратной и десятикратной концентрации.

Для приготовления двукратной, десятикратной или какой-либо иной концентрации пользуются увеличением навески су­хого препарата во столько раз, во сколько должна быть увели­чена концентрация среды.

Рецепт 92. Мясопептонный бульон. Сахарный бульон

Является средой общего назначения, используемой при ра­боте с различными видами микроорганизмов,

а) Приготовление мясной воды.

Парное говяжье или конское мясо освобождают от костей, жира и сухожилий. Пропускают через мясорубку. 1 кг полу­ченного мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды и оставляют на 12–14 ч при температуре 4–6 °С. Для ускорения процесса экстракции питательных веществ содержимое каст­рюли подогревают при 50 °С в течение 1 ч и затем кипятят 30 мин.

После кипячения бульон в горячем состоянии фильтруют через двойной бумажный или ватно-марлевый фильтр. Ко­личество фильтрата измеряют и добавляют к нему водопроводную воду до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 20 °С в течение 20 мин.

б) Приготовление бульона.

К 1000 мл мясной воды добавляют 1 % раствор пептона и 0,5 % раствор хлорида натрия. Кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавлен­ных ингредиентов.

Приготовленный таким образом бульон фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают слабощелочную реакцию (рН 7,2–7,4). Стерилизуют при температуре 120 °С в течение 15–20 мин. Если после стерилизации в среде вновь выпадает осадок, его вторично фильтруют и стерилизуют при более низкой температуре, чем предшествующая, для предотвраще­ния вторичного выпадения осадка.

Учет результатов проводят через 18–24 ч инкубирования посевов в термостате при температуре 36–37 °С.

Сахарный бульон. К МПБ нейтральной реакции добавляют глюкозу в количестве 0,25–2 %. Перед добавлением к бульону глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллирован­ной воды. Приготовленную среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или однократно в автоклаве при температуре 115 °С 30 мин.

Рецепт 93. Мясопептонный агар. Сахарный агар

Среда общего назначения. Используется для выращивания и подсчета на чашках Петри КОЕ нетребовательных микроор­ганизмов, высеянных из определенных объемов объектов внешней среды (воздуха, смывов с инвентаря, хирургического материала и пр.).

Состав:                                         г/л

Пептон                                           10,0

Хлорид натрия                              5,0

Агар микробиологический          0,5–2,0

Мясная вода                                   1000 мл

рН 7,2-7,4

Приготовление. В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г хлорида натрия, кипятят на слабом огне при постоянном по­мешивании до полного растворения добавленных ингредиен­тов.

Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают рН 7,2–7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, завися­щем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном помеши­вании до полного растворения агара. (При помутнении среды ее просветляют одним из указанных далее способов.)

Приготовленный агар фильтруют или декантируют, разли­вают в пробирки или во флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С в течение 20 мин.

Учет результатов производят через 18–24 ч инкубации в термостате при температуре 37 °С.

Сахарный агар. К расплавленному МПА прибавляют от 0,5 до 2 % глюкозы, предварительно растворенной в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизует дробно 3 дня по 30 мин или 15 мин при темпера­туре 115 °С в автоклаве.

Осветление питательных сред применяют в том случае, когда в процессе приготовления они мутнеют и приобретают темный цвет. Осветление питательных сред может быть основано на коагулировании, т.е. укрупнении взвешенных частиц, что спо­собствует более быстрому выпадению их в осадок, или на адсорбции, т.е. способности разных веществ осаждать на своей поверхности взвешенные частицы.

Существует несколько способов осветления питательных сред. Наиболее простыми, доступными и эффективными явля­ются следующие.

  1. К 1000 мл среды, охлажденной до 50 °С, прибавляют один белок свежего крупного яйца, взбитого в пену, с двойным объемом холодной воды. После добавления белка среду хорошо размешивают и кипятят на сильном огне в течение 10 мин или нагревают в автоклаве в течение 30 мин при температуре 105 °С. Белок можно заменить нормальной лошадиной сывороткой, прибавляемой в количестве 30–40 мл на 1000 мл среды. Иногда прибавление белка усиливает мутность среды, поэтому, при­ступая к ее осветлению, нужно для пробы взять 10 мл пита­тельной среды, добавить 0,3 мл белка или сыворотки и вски­пятить.
  2. В питательную среду, охлажденную до 40–45 °С, вносят на каждый литр среды 20–30 г мяса, пропущенного через мясорубку и растертого в ступке с бульоном до получения однородной массы. Среду с прибавленной к ней мясной ка­шицей тщательно размешивают и помещают на 1 ч в текучепаровой аппарат.
  3. Фильтрацию и осветление агара можно заменить декан­тацией, т.е. отделением осадка путем его отстаивания. Для этого расплавленную среду с агаром наливают в сосуд высоким слоем и ставят в горячий автоклав на ночь для осаждения взвешенных частиц, обусловливающих мутность среды. На сле­дующий день посуду с застывшим агаром слегка подогревают в водяной бане, переворачивают вверх дном, вытряхивают агар и срезают придонную часть его, содержащую осадок. Светлый надосадочный слой агара режут на куски, плавят и разливают в посуду для стерилизации.

Рецепт 94. Голодный агар

Вспомогательная среда, применяемая чаще всего для залив­ки засеянных питательных сред для создания анаэробных ус­ловий или лучшего проявления каких-либо свойств исследуе­мого микроба.

В 1000 мл дистиллированной воды растворяют на слабом огне 15 г агар-агара до закипания. Горячий агар фильтруют через ватно-марлевый или полотняный фильтр. Устанавливают рН 7,2±0,2. Разливают по надобности в пробирки или флаконы, стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин.

Рецепт 95. Лактозопептонная среда

Приготовление. 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. После растворения ингредиентов добавляют 1 мл 1,6 % раство­ра спиртового бромтимолового голубого, устанавливают рН 7,4–7,6, разливают по 10 мл в пробирки, стерилизуют при температуре 112 °С в течение 12 мин.

Для приготовления концентрированной лактозопептонной среды количество всех ингредиентов, кроме воды, увеличивают в 10 раз. Разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

В работе используют среды стандартной прописи одинар­ной, двукратной и десятикратной концентрации, когда при одном и том же объеме растворителя количество ингредиентов среды увеличивают соответственно в 2 раза и 10 раз.

Рецепт 96. Среда Эндо

Слабоселективная дифференциально-диагностическая сре­да, используемая для выделения энтеробактерий.

Приготовление. 100 мл МПА (рН 7,4) растапливают на во­дяной бане или в текучепаровом аппарате. Охлаждают до 70 °С и прибавляют 1 г химически чистой (х.ч.) лактозы, предвари­тельно растворенной в стерильной пробирке в небольшом ко­личестве дистиллированной воды.

В отдельных пробирках готовят:

  1. 2–3 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина (рецепты 16, 17).
  2. 10 мл 10 % водного раствора безводного (сохраняемого в герметической упаковке) кристаллического сульфита натрия (Na2SO3).

В стерильную пробирку отмеряют 1 мл раствора фуксина и добавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фукси­на в бледно-розовый цвет. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, хорошо перемешивают, избегая вспени­вания, и разливают в чашки Петри.

Горячий агар бледно-розового цвета, при застудневании – бесцветный или с розовым оттенком.

Учет результатов. Результаты роста учитывают через 18– 24 ч. Колонии патогенных энтеробактерии, не расщепляющие лактозу, образуют бесцветные или слаборозовые колонии. Большая часть эшерихий ферментирует лактозу до образования ацетил альдегида, который, вступая в реакцию с сульфитом натрия, окрашивает колонии в ярко-розовый, красный цвет, часто с металлическим зеленоватым блеском.

Рецепт 97. Среда Эндо (коммерческая) ФС 42-350498

Состав:                                             г/л

Панкреатический гидролизат
кильки                                               11,5

Экстракт кормовых дрожжей        0,86

Лактоза                                             12,9

Фуксин основной                            0,22

Сульфат натрия двузамещенный   0,48

Сульфит натрия                               0,83

Хлорид натрия                                 3,6

Карбонат натрия                              0,01

Агар                                                   9,6

рН 7,3±0,2

Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить до полного расплавления агара, профильтровать и снова довести до кипения. Остудить до температуры 45–50 °С и разлить в стерильные чашки Петри слоем 4–5 мм. После застудневания агара среду подсушить в термостате при температуре 37 °С. Готовая среда бледно-розового цвета.

Рецепт 98. Среда Эндо с розоловой кислотой (аурином)

В случаях, когда мембранные фильтры зарастают микрофло­рой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, на 100 мл среды Эндо добавляют 0,2 мл 5 % спирто­вого раствора розоловой кислоты. (Срок хранения раствора розоловой кислоты не более 1 мес.)

Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной фильтрации.

Среды Гисса для ферментации углеводов

Углеводные среды применяют для дифференциации бакте­рий по способности ферментировать те или иные углеводные субстраты.

Наиболее широкое применение в микробиологической прак­тике находят среды со следующими углеводами (см. табл. 9.1).

При ферментации углеводов происходит образование смеси кислот (молочной, уксусной, углекислоты и т.д.), сопровож­дающееся снижением значения рН. Конечные продукты фер­ментации углеводов и спиртов в большинстве случаев пред­ставляют собой кислоты, спирты, альдегиды и газообразные вещества (Н2 и СО2).

Для обнаружения ферментации углеводов в среды Гисса вводят индикатор рН (индикатор Андреде, ВР, водный голу­бой, розоловую кислоту, бромтимоловый голубой и др.). Для выявления газообразования в жидких средах применяют труб­ки Durhem, или поплавки (маленькие трубочки, запаянные с одного конца и заполненные средой). Образующийся газ вы­тесняет жидкость из поплавков и образует пузырьки близ за­паянного конца трубки.

В полужидких средах о процессе газообразования судят по разрывам и трещинам, появляющимся в толще среды.

Рецепт 99. Среда Гисса с лактозой или другими углево­дами (жидкая)

Состав:                                         г/л

Пептон                                           10,0

Хлорид натрия                              5,0

Лактоза или другой углевод       10,0

Дистиллированная вода              1000 мл

Приготовление. К 1000 мл дистиллированной воды добавля­ют 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Пептон и соль раство­ряют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильт­руют через бумажный фильтр так, чтобы среда была совершен­но прозрачной. Устанавливают рН 7,0–7,4, добавляют 0,5–1 г одного из необходимых углеводов (лактозу, глюкозу, маннит, целлобиозу и т.д.), а затем индикатор Андреде в объеме 10 мл на 1000 мл среды, или 1 мл 1,6 % раствора, или индикатора бромтимолового синего (рецепт 36).

Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки вместе с поплавками (трубками Дюрхема), расположенными запаянным концом кверху. Среду стерилизуют при температуре 121 "С в течение 20 мин. Во время стерилизации поплавки доверху заполняются питательной средой.

Готовая среда бесцветная или имеет розоватый оттенок с индикатором Андреде, или травянисто-зеленый с индикатором бромтимоловым синим.

Принцип и учет результатов. Питательный основой сред для определения ферментации углеводов является пептонная вода. Мясной бульон для этой цели непригоден, так как он содержит различные углеводы, что может привести к получению непра­вильных результатов.

При росте бактерий, сопровождающемся расщеплением уг­леводов с образованием кислых продуктов распада, цвет среды изменяется: в первом случае она становится ярко-розовой, а во втором – желтой.

Образование газа в среде определяется по наличию пузырь­ков, собирающихся в поплавке.

Рецепт 100. Полужидкая среда для ферментации лактозы и других углеводов
Настоящая среда, так же как среды Гисса, предназначена для идентификации различных видов бактерий на основании ферментации ими лактозы.
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
кильки 4,9
Лактоза (или вместо нее другой
нужный углевод) 3,64
Гидроортофосфат натрия
(Na2HPО4) 0,36
Хлорид натрия (NaCl) 3,64
Бромкрезоловый пурпурный 0,02
Агар микробиологический 2,4
рН 7,4±0,2
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в 1000 мл дистиллированной воды, кипятить в те¬чение 2–3 мин до полного расплавления агара. Среду про¬фильтровать, разлить в стерильные пробирки по 3–4 мл. Стерилизовать автоклавированием 20 мин при температуре 110 °С.
Готовая среда имеет фиолетовую окраску, хранится при температуре 5–10 °С в течение 5 дней.
Учет результатов производят через 18–24 ч инкубации в термостате при температуре 35–37°С. Микроорганизмы, не ферментирующие лактозу, не изменяют цвета среды. При ферментации с образованием кислых продуктов фиолетовый цвет среды изменяется на желтый или желто-коричневый. Газообразование учитывается по разрывам среды в толще геля.

Рецепт 101. Железосульфитный агар
Приготовление
1. Основная среда. В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 10г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при температуре 112 °С 12 мин.
Добавка к основной среде. Растворы: 20 % сульфита натрия (Na2SO3) и 8 % сульфата железа (FeSО4) или хлорида железа (FeCl2) готовят непосредственно перед употреблением на стерильной дистиллированной воде в стерильной посуде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед постановкой анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20 % раствора сульфита натрия, перемешивают и затем добавляют 1 мл 8% раствора железа сульфата. Готовую среду тщательно перемешивают и, соблюдая правила асептики, разливают столбиком высотой 12–15 см для работы методом мембранной фильтрации или во флаконы – для работы методом прямого посева.

Рецепт 102. Стрептомициновый агар по стандартной прописи
Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета 1000 мкг стрептомицина на 1 мл питательного агара, приготовленного по стандартной прописи.
На стерильной дистиллированной воде, соблюдая правила асептики, готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 мл. В готовый, отмеренного объема, питательный агар, остуженный до температуры 45–49 °С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара.
Среды разливают в пробирки для получения скошенной поверхности. Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином не допускается.

Рецепт 103. Селенитовая среда Leifson, модифицированная
Среда предназначена для накопления в материале сальмонелл. Готовят среду из 2 растворов.
Состав: г/л
Раствор I
Гидроселенит натрия (NaHS2O3)
без примеси теллура 4,0
Пептон 5,0
Гидроортофосфат натрия
безводный (NaH2PO4) 3,0
Лактоза 4,0
Вода дистиллированная 1000 мл
Раствор II
10 % раствор гидроселенита натрия готовят на стерильной дистиллированной воде ex tempore.
Приготовление. Предварительно определяют количественные соотношения фосфатов при используемом образце пептона и гидроселенита натрия, чтобы готовая среда имела рН 6,9–7,1. Такая подтитровка проводится каждый раз при изменении серии любого из входящих в среду основных ингредиентов. После установления количественных соотношений фосфатов к раствору добавляют пептон и лактозу.
Среду разливают во флаконы по 50 и 100 мл, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или в автоклаве столько же при температуре 112 °С.
Количество фосфатов в рецепте среды дано в расчете на безводные препараты. При отсутствии безводных препаратов заранее заготовленные навески "выветривают" в термостате в течение 15–16 сут.
Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного (I) раствора добавляют 2 мл, к 100 мл – 4 мл (II) раствора гидроселенита натрия. Дальнейшей стерилизации не требуется.
Основной (I) раствор среды можно хранить в холодильнике 1–2 мес.

Рецепт 104. Селенитовая среда (коммерческая)
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
казеина 5,26
Лактоза 4,21
Гидроселенит натрия 4,21
Динатрия фосфат 6,32
рН 7,5±0,2
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в колбе с 1000 мл дистиллированной воды, нагреть до появления первых пузырьков на дне колбы, не кипятить! Разлить по потребности. Среду не стерилизовать! Готовая среда прозрачная, светло-соломенного цвета. Хранить при темпера¬туре 5 °С не более 7 сут.
Учет результатов. После инкубации посевов в течение 6–8 ч при температуре 37 °С независимо от визуального обнаружения помутнения бульона из него производят высев по 0,1 мл на среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 20 ч.

Рецепт 105. Магниевая среда (одинарная)
Среда предназначена для накопления сальмонелл. Содержит три раствора.
Состав: г/л
Раствор 1
Пептон 4,2
Хлорид натрия 7,15
Дигидроортофосфат калия
(КН2РO4) 1,43
Дрожжевой диализат 9 мл
Вода дистиллированная 890 мл
Раствор 2
Хлорид магния (МgСl2 • 6Н2О) 35,7
Вода дистиллированная 90 мл
Раствор 3
Бриллиантовый зеленый 0,5 % 0,9
(водный раствор)
Приготовление. Все три раствора смешивают, разливают определенные объемы в колбы, флаконы или пробирки. Стерилизуют при температуре 112 °С в течение 30 мин.
Принцип действия. Пептон с дрожжевым диализатом создают питательную основу для активного размножения сальмонелл. Дигидроортофосфат калия обеспечивает буферность сред.
Бриллиантовый зеленый оказывает ингибирующий эффект, а хлорид магния – дегидрирующее действие, не влияя во взятых концентрациях на рост и размножение сальмонелл.
Магниевая среда двойной концентрации
Готовится так же, как одинарная среда, но масса всех компонентов удваивается без изменения объема растворителя.

Рецепт 106. Экспедиционная среда магниевая
Для посева больших объемов воды, облегчения транспорта и хранения можно предварительно подготовить навески реактивов и растворы ингредиентов среды в расфасованном виде, которые затем вносят в исследуемую воду в соответствии с нижеприведенной прописью.
Состав г/500 мл г/100 мл
Хлорид магния кристаллический 19,5 3,9
Хлорид натрия 4,0 0,8
Фосфорнокислый калий
однозамещенный, безводный 0,8 0,16
10 % раствор пептона 25 мл 5 мл
Дрожжевой экстракт 11 мл 2,5 мл
Бриллиантовый зеленый водный
1 % раствор 2,5 мл 0,5 мл
Все навески соединяют в одной емкости и оставляют на сутки. Получается сгущенная (кашеобразная) масса, которая в течение суток при комнатной температуре сама стерилизуется.
В результате этого ее дополнительно не стерилизуют и используют в качестве готовой питательной среды.
Техника выращивания. Посевы инкубируют при температуре 37 °С. Перед высевом на плотные питательные среды посевы тщательно перемешивают или берут материал с осадка среды для повышения высеваемости.

Рецепт 107. Тетротионатовая среда Мюллера
Тетротионатовый бульон Мюллера является средой накопления для сальмонелл.
Состав: г/л
Мел, стерилизованный сухим
жаром 45,0
или
Карбонат кальция (СаСO3) сухой,
стерильный 25,0
Бульон Хоттингера, содержащий
1,2–1,3 аминного азота 900 мл
Раствор Люголя 20,0 мл
Тиосульфат натрия (Na2S2O3 • 5Н2О)
50 % стерильный раствор 100 мл
Приготовление. В стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела (или 2,5 г карбоната кальция), стерилизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают 90 мл бульона Хоттингера. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °С в течение 30 мин. Устанавливают рН 7,4±0,2. Затем ex tempore асептически добавляют в каждый флакон по 2 мл раствора Люголя (йодид калия 20 г, йод кристаллический 25 г, вода дистиллированная 100 мл) и по 10 мл раствора тиосульфата натрия (в измерительный цилиндр насыпают тиосульфат натрия и добавляют 100 мл воды, растворяют, переливают во флакон, стерилизуют текучим паром 30 мин).
Среду хорошо перемешивают. При необходимости разлива¬ют в пробирки. Готовая среда стерилизации не подлежит.
Принцип действия. Питательные вещества в среде "обеспечивает" бульон Хоттингера. Мел или карбонат кальция выполняет функции буфера.
Добавленные к среде натрия тиосульфат и раствор Люголя образуют тетратионат натрия (Na2S4O6), который, не оказывая влияния на жизнеспособность сальмонелл, является ингибитором для эшерихий и другой микрофлоры кишечника.

Рецепт 108. Среда Мюллера–Кауфмана
Среда Кауфмана является селективной средой для накопления сальмонелл.
Состав: мл
Среда Мюллера (стерильная) 500
Желчь бычья (стерильная) 250
Бриллиантовый зеленый (0,1 %
водный раствор) 50
Приготовление. Ингредиенты смешивают, соблюдая правила асептики, разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Среду не стерилизуют!
Принцип действия. Желчные соли, не оказывая отрицательного воздействия на сальмонеллы, вместе с красителем бриллиантовым зеленым усиливают ингибиторное действие на грамположительные и грамотрицательные колиформные бактерии.

Рецепт 109. Висмут-сульфит-агар (Himedia, Bismuth Sul¬phite Agar, cat M027)
Висмут-сульфит-агар – высокоселективная среда для выделения сальмонелл, в том числе S.typhi, из клинического материала и пищевых продуктов.
Желательно выделять эти микроорганизмы после первичного обогащения проб в жидком тетратионатном, селенитовом бульоне или магниевой среде.
Состав: г/л
Говяжий экстракт 5,0
Пептон 10,0
Декстроза 5,0
Фосфат натрия (двузамещенный) 4,0
Сульфат железа 0,3
Индикатор сульфита висмута 8,0
Бриллиантовый зеленый 0,025
Агар 20,0
рН 7,7±0,2
Приготовление. Суспендировать 53,32 г в 1000 мл дистилли¬рованной воды. Нагревать до кипения и далее до растворения. Не стерилизовать, так как перегрев нарушит селективность среды. Чувствительность сильно зависит от равномерности распределения осадка сульфита висмута в готовой среде перед разливом в чашки Петри.
Использование. Перед посевом поверхность агара должна быть сухой. Принцип действия среды основан на том, что висмут, содержащийся в среде в виде основного сульфита, и бриллиантовый зеленый подавляют рост грамположительных микроорганизмов и многих энтеробактерии, в том числе шигелл.
Рост сальмонелл может несколько задерживаться.
Дифференцирующее действие среды основано на том, что образуемый бактериями из сульфата железа сероводород вызывает почернение индикатора – бесцветного сульфита висмута, вследствие перехода его в сульфид висмута – вещество черного цвета.
Поэтому бактерии, образующие сероводород, формируют на среде черные и коричнево-черные, иногда с темно-зеленым оттенком колонии, часто обладающие металлическим блеском.
При этом среда под колониями тоже окрашивается в черный цвет.
Бактерии, не образующие сероводород, растут в виде мелких, бесцветных, зеленоватых или коричневых колоний.
Учет результатов производят через 44–48 ч инкубации при температуре 37 °С.

Рецепт 110. Бактоагар "Ж" Плоскирева (коммерческий) ФС 42-193 ВС-88
Бактоагар Плоскирева – селективная среда для выделения шигелл и сальмонелл.
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
кильки 16,0
Натриевые соли желчных кислот 8,1
Лактоза 12,9
Фосфат натрия двузамещенный 2,25
Цитрат натрия 8,82
Тиосульфат натрия 6,86
Йод металлический 0,12
Карбонат натрия 1,42
Нейтральный красный 0,04
Бриллиантовый зеленый 0,02
Агар микробиологический 8,75
рН 7,2±0,1
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятить 2–3 мин до полного расплавления агара, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4–5 мм, оставить их открытыми в течение 40– 50 мин при температуре 20–25 °С для застудневания агара и подсушивания.
Готовая среда коричневато-красного цвета. Может быть использована в течение 7–8 сут при хранении в холодильнике (температура 4–8 °С).
Принцип действия. Дифференцирующая способность среды основана на изменении рН в кислую зону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые образуют колонии брусничного цвета (индикатор – нейтральный красный).
Лактозоотрицательные бактерии растут в виде бесцветных или слабоокрашенных колоний.
Вегетирующие свойства среды недостаточны для роста S.dysenteriae и некоторых сальмонелл (S.choleraesuis, S.pullorum).
Желчные соли, бриллиантовый зеленый и йод полностью подавляют рост грамположительных бактерий, значительно задерживают (первые 24 ч) развитие эшерихий и других колиформных бактерий, а также предотвращают роение протея.

Рецепт 111. Питательный агар с эозинметиленовым синим Левина ФС 42-53 ВС-88
Агар с эозинметиленовым синим Левина предназначен для выделения и дифференциации патогенных и условно-патогенных энтеробактерий. Среда может быть также использована для выделения и идентификации грибов Candida albicans.
Состав: г/л
Сухой питательный агар "КД" 23,0
Лактоза 10,0
Эозин 0,39
Метиленовый синий 0,06
Хлорид натрия 3,3
рН 7,3±0,2
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятить 2– 3 мин, профильтровать через бумажный фильтр, стерилизовать при температуре 110 °С в течение 20 мин. Затем среду остудить до 45–50 °С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4–5 мм. После застывания среду подсушить в термостате при темпера¬туре 37 °С.
Готовая среда прозрачная, сине-фиолетового цвета.
Принцип действия. Дифференцирующая способность среды основана на изменении рН под действием кислоты, образующейся при ферментации лактозы бактериями. Комплекс индикаторов выпадает в осадок при рН 4,7, окрашивая колонии кислотообразующих бактерий в темно-сине-фиолетовый, почти черный цвет, часто с зеленым блеском.
Бактерии, не ферментирующие лактозу, образуют бесцветные или розоватые колонии.
Среда оказывает некоторое ингибирующее действие на грамположительную микрофлору.

Рецепт 112. Среда Мак-Конки (II) с желчными солями (0,15 %) КФ и NaCl (Himedia, MacConkey Agar With Bile Salt (0,15 %), CV, NaCI, cat. M081 A)
Агар Мак-Конки (II) с желчными солями, кристаллическим фиолетовым и хлоридом натрия рекомендуется для непосредственного посева образцов воды с целью обнаружения колиформных бактерий.
Состав: г/л
Пептон 20,0
Лактоза 10,0
Желчные соли II 1,5
Хлорид натрия 5,0
Нейтральный красный 0,05
Кристаллический фиолетовый 0,001
Агар 15,0
РН 7,2±0,2
Использование. Среда используется для обнаружения энтерококков среди колиформных неферментирующих лактозу микробов, имеющихся в сточных водах и аналогичных пробах.
Большое количество нейтрального красного в этой среде способствует росту энтерококка в виде мелких, интенсивно красных колоний, с бледной периферией. Часто этот результат используется как показатель фекального загрязнения.

Рецепт 113. Трехсахарный агар с солями железа (TSI) в модификации НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова
Среда предназначена для дифференциации бактерий по их способности ферментировать глюкозу, лактозу и сахарозу, а также образовывать сероводород.
Состав: г/л
Мясная вода 1000 мл
Дрожжевой экстракт (жидкий) 100 мл
или
Дрожжевой экстракт (по сухой
массе) 3,0
Пептон 20,0
Хлорид натрия 3,5
Агар 15,0
Железа (II) сульфат (FеSO4 • 7Н2O)
перекристаллизованный 0,2
Тиосульфат натрия
(Na2S2O3 • 5Н2O) 0,3
Глюкоза 1,0
Лактоза 10,0
Сахароза 10,0
Феноловый красный (0,2 %
водных раствор) 12 мл
Приготовление
1. Готовят основу среды. К мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, хлорид натрия и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают рН 7,0–7,1, фильтруют, разливают во флаконы или колбы по 0,5 л. Стерилизуют при температуре 121 °С в течение 30 мин.
2. К стерильной основе добавляют остальные ингредиенты, растворяют их, хорошо размешивают, разливают асептично в стерильные пробирки по 6–7 мл. Стерилизуют текучим паром или при температуре 112 °С 30 мин. Скашивают в горячем виде так, чтобы оставить столбик высотой 2–2,5 см.
Принцип действия и учет результатов. При расщеплении Сахаров образуется кислота, в связи с чем цвет индикатора изменяется от красно-бурого до желтого, и среда обесцвечивается.
В среде глюкоза содержится в малой концентрации (0,1 %), поэтому в аэробных условиях (в скошенной части агара) бактерии ферментируют только глюкозу, полностью утилизируя ее в первые часы роста. К моменту учета реакции через 18–24 ч для своего питания они используют пептоны, имеющиеся в среде в качестве питательной основы.
Энтеробактерии, сбраживающие глюкозу или лактозу, вызывают подкисление во всей пробирке: столбике и скосе, хотя в течение первых суток инкубации лактоза (или сахароза) полностью не расщепляется и частично остается в неизмененном виде.
Бактерии, обладающие энзимом тиосульфат редуктазой, способны образовывать сероводород из неорганической серы, что является дифференцирующим признаком.
Реакция проходит в два этапа: вначале в анаэробных условиях (в столбике среды) в кислой среде под действием микробного энзима тиосульфат восстанавливается в сульфит с выделением значительного количества сероводорода, представляющего собой бесцветный газ. Затем (второй этап) в среду в качестве индикатора вводят соли железа, которые вступают в реакцию с сероводородом, образуя сульфид железа (FeSO4) в виде нерастворимого преципитата черного цвета. В результате при положительной реакции среда в столбике чернеет, и вследствие этого не всегда можно установить ферментацию лактозы (сахарозы).
При образовании газа отмечают разрывы агара.

Рецепт 114. Сальмонелла-шигелла агар (SS-aгap; Himedia, Salmonella Shigella Agar, cat M108)
SS-aгap – селективная среда, используемая для выделения сальмонелл и шигелл.
Состав: г/л
Говяжий экстракт 5,0
Пептон 5,0
Лактоза 10,0
Соли желчи 8,5
Цитрат натрия 10,0
Тиосульфат натрия 8,5
Цитрат железа 1,0
Бриллиантовый зеленый 0,00033
Нейтральный красный 0,025
Агар 15,0
рН 7±0,1
Приготовление. Суспендировать 53,32 г в 1000 мл дистиллированной воды. Нагревать до кипения с частым помешиванием до полного растворения среды. Не автоклавировать! Охладить до 50 °С и разлить в стерильные чашки Петри. Перегрев может уничтожить селективность среды.
Использование. Среда предназначена для посева материалов, подозрительных на содержание патогенных энтеробактерий.
Результаты. При наличии патогенных бактерий их рост выявляется через 18–24 ч при инкубации в термостате при температуре 35 °С.

Рецепт 115. Среда Клиглера
Среда предназначена для дифференциации бактерий по способности их ферментировать глюкозу, лактозу и образовывать сероводород.
Состав: г/100 мл
Бульон мясной 100 мл
Пептон 20,0
Лактоза 10,0
Глюкоза 1,0
Хлорид натрия 5,0
Сульфит натрия (№2803) 0,4
Тиосульфит натрия
(Na2S2O3 • 5Н2O) 0,08
Железа (II) сульфат
(FeSO4 • 7Н2O) 0,5
Агар 20,0
Феноловый красный (0,2 %
раствор в 50 % этиловом спирте) 12,0
Приготовление. К мясному бульону последовательно добавляют пептон, соли натрия, агар и кипятят до полного расплавления агара. Устанавливают рН 7,8, снова кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем добавляют остальные ингредиенты. Сульфат железа предварительно растворяют в малом количестве воды.
Готовую среду разливают в пробирки по 6–7 мл, стерилизуют при 112 °С 30 мин. Скашивают так, чтобы оставить столбик высотой 2,5–3 см. Готовая среда имеет красновато-бурый или оранжево-красный цвет.
Принцип действия. При расщеплении Сахаров образуется кислота, что улавливается с помощью индикатора (фенолового красного, окрашивающего среду в желтый цвет).
В первые часы роста (в аэробных условиях) бактерии, ферментирующие только лактозу, утилизируют ее полностью в скошенной части агара. К моменту учета реакции (18–24 ч) они используют в качестве питательного субстрата пептоны, имеющиеся в питательной среде. При этом в скошенной части среды образуется аммиак и происходит подщелачивание среды – косяк приобретает красный цвет.
В столбике желтый цвет сохраняется, хотя глюкоза за этот срок ферментирована, кислые продукты ее расщепления в анаэробных условиях еще сохраняются и поддерживают низкое значение рН. Получаются желтый столбик и красный скос.

Рецепт 116. Среда Олькеницкого Трехсахарный агар с мочевиной
Среда предназначена для дифференциации бактерий по способности ферментировать сахара: глюкозу, лактозу и сахарозу, так же как в среде Клигелера. Присутствие в среде мочевины позволяет определить наличие у бактерий уреазы.
Состав: г/л
Агар питательный сухой 25,0
Лактоза 10,0
Сахароза 10,0
Глюкоза 1,0
Аммоний железа (II) сульфат
[FеSO4(NН4)2SO4 • 6Н2O] 0,2
Тиосульфат натрия
(Na2S2O3) • 5Н2O) 0,3
Мочевина 10,0
Феноловый красный
(0,4 % водный раствор) 4,0
Дистиллированная вода 1000 мл
Приготовление. Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом, но при нагревании в водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальной воде при нагревании на огне и перемешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2–7,4. Добавляют индикатор, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6–7 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Скашивают, оставляя столбик высотой 2,5–3 см.
Готовая среда бледно-розового цвета.
Принцип работы среды такой же, как и среды Клиглера, в отношении углеводов и выявления сероводорода. Расщепление мочевины завершается выделением аммиака (NH3), щелочного соединения (рН 8,1), под воздействием которого косяк и столбик среды приобретают красную окраску. Поэтому для уреазоположительных штаммов учет ферментации углеводов на этой среде невозможен.
Бактерии, сбраживающие глюкозу и лактозу, вызывают подкисление во всей среде: желтый столбик и желтый скос.
Лактоза, концентрация которой в среде в 10 раз выше, чем глюкозы (1 %), через 18–24 ч еще не исчерпана и в скошенной части, и в столбике среды. Вследствие этого вся среда окрашена в желтый цвет.
После 48 ч инкубации посева здесь также будет наблюдаться щелочение скошенной части агара за счет расщепления пептонов и покраснение скоса.
Если бактерии при ферментации углеводов в качестве конечного продукта метаболизма образуют газ (Н2 и СО2), появляются разрывы среды и скопление газа на дне пробирки, вследствие чего столбик агара приподнимается.
Только некоторые бактерии продуцируют энзим тиосульфат-редуктазу, вследствие чего способны образовывать сероводород из неорганических соединений серы.
В агаре Клиглера в анаэробных условиях в кислой среде реакция образования сероводорода происходит в два этапа. На I этапе в анаэробных условиях в кислой среде под действием энзима тиосульфат восстанавливается в сульфит с выделением значительного количества сероводорода, представляющего со¬бой бесцветный газ. На II этапе сероводород вступает в реакцию с солями железа (индикаторы сероводорода), образуется сульфит железа в виде нерастворимого преципитата черного цвета. В результате при положительной реакции на сероводород среда в столбике чернеет.

Рецепт 117. Среда Крумвиде–Олькеницкого в модификации Ковальчука
Состав: г/л
Гипосульфит 1,0
Соль Мора 0,6
Мочевина 10,0
Лактоза х.ч. 15,0
Сахароза 3,5
Глюкоза 2,0
Растворяют все перечисленные ингредиенты в 1000 мл дистиллированной воды. Устанавливают рН 7,4±7,6.
К приготовленной смеси добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором BP. Все размешивают, нагревают на водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5– 6 мл, стерилизуют 20 мин при температуре 112 °С. Стерильную среду скашивают так, чтобы остался столбик высотой 3 мм.

Рецепт 118. Двухслойная универсальная комплексная среда (ДУКС) Калины
Среда предназначена для первичной дифференциации энтеробактерии по их способности ферментировать углеводы, образовывать сероводород, расщеплять мочевину.
Состав нижнего слоя:
Агар питательный 0,6 %
(из сухого агара) или 0,5–0,45 %
в случае готового плотного
питательного агара (стерильного) 1000 мл
Глюкоза 1,5 г
Тиосульфат натрия
(Na2S2О3 • 5Н2О) 0,2 г
Гидроортофосфат калия
(К2НРО4) 1,5 г
Феноловый красный
(1,6 % щелочной раствор) 5 мл
Метиленовый синий
(1 % водный раствор) 6 мл
Кристаллический фиолетовый
(0,01 % водный раствор) 20 мл
Приготовление нижнего слоя. Все ингредиенты смешивают, доводят до полного растворения при нагревании на водяной бане (3–5 мин). Прибавляют 8 мл 50 % водного раствора мочевины, выдержанного 2–3 сут при комнатной температуре для самостерилизации.
Среду хорошо размешивают и стерильно разливают по 2 мл в пробирки, остужают столбиком или хранят во флаконе при 4 °С до 3 нед.
Состав верхнего слоя:
Агар питательный 2 %
(стерильный) 1000 мл
Лактоза 10,0 г
Сахароза 5,0 г
Железа (III) аммония цитрат
(смесь солей 1:1): 0,2 г
а) железа (III) цитрат (FeC6H5O7)
б) аммония цитрат [(NН4)3С6Н5О3]
Гидроортофосфат калия
(К2НРO4) 1,5 г
Дигидроортофосфат калия
(КН2РO4) 0,4 г
Кристаллический фиолетовый
(0,01 % водный раствор) 20 мл
Феноловый красный (1,6 %
щелочной раствор) 5 мл
Приготовление верхнего слоя. Ингредиенты растворяют при кипячении в водяной бане (2–5 мин), разливают асептично по 4 мл поверх застывшего нижнего слоя и скашивают, оставив столбик высотой до 2 см, или хранят во флаконах при температуре 4 °С до 3 нед.
Принцип действия. Дифференцирующие свойства среды основаны на принципах, описанных для комбинированных сред Клиглера и Олькеницкого. Однако среда ДУКС имеет заметное преимущество – распределение ингредиентов в двух слоях создает возможность беспрепятственного чтения реакций.

Рецепт 119. Среда Кесслера с лактозой
Состав: г/л
Пептон 10,0
Стерильная бычья желчь 50 мл
Лактоза 2,5
Раствор генцианового (кристал-
лического) фиолетового 1 % 4 мл
Дистиллированная вода 1000 мл
К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл стерильной бычьей желчи. Смесь нагревают на водяной бане при помешивании 20–30 мин, затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют 2,5 г лактозы, доводят объем до 1000 мл.
Устанавливают рН 7,4–7,6, добавляют 4 мл 1 % водного раствора генцианового (кристаллического) фиолетового, разливают в пробирки и колбы с поплавками в необходимых количествах. Стерилизуют при 121 °С 15 мин.
Готовая среда имеет фиолетовый цвет.
Возможно также использование коммерческой сухой среды Кесслера. Подготовку ее для стерилизации и посева проводят согласно прописи на этикетке.

Рецепт 120. Среда Кесслера (модификация)
Состав: г/л
Пептон 10,0
Стерильная бычья желчь 50 мл
Лактоза 2,5
Сухую среду Кесслера помещают в колбу, доливают водопроводной воды до 1000 мл, смесь размешивают и кипятят 25±5 мин. Объем воды доводят до 1000 мл, фильтруют через вату. Разливают в пробирки с поплавками по 5 мл или колбочки с поплавками по 40–50 мл, стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин.
Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет за счет генцианового (кристаллического) фиолетового, добавляемого в дозе 2 мл концентрации 10 г/л.

Рецепт 121. Щелочно-полимиксиновая элективная среда (ЩЭС) (для выделения энтерококков из воды, сточных вод, почвы)
Основной средой является МПБ. Среда готовится в двух концентрациях для посева малых и больших объемов или количеств исследуемого материала. Состоит из трех отдельных растворов (А, В, С).
Основная концентрация Удвоенная концентрация
A. Мясопептонный бульон 40 мл 70 мл
Хлорид натрия (NaCI) 0,5 1,0
Дрожжевой экстракт
сухой 2,0 4,0
жидкий 0,2 мл 0,4 мл
B. Дистиллированная вода 25 мл 12,5 мл
Карбонат натрия (Na2CO3) 0,53 1,1
C. Дистиллированная вода 25 мл 12,5 мл
Бикарбонат натрия 0,25 0,5
Полимиксин 20 000 ЕД/мл 40 000 ЕД/мл
1,6 % спиртовой раствор
бромтимолового синего 0,5 мл 1 мл
Растворы А, В и С стерилизуют раздельно при 112 °С в течение 12 мин. После стерилизации все три раствора смешивают, устанавливают рН 10,0–10,2. Затем добавляют раствор бромтимолового синего и полимиксин.
Среду основной концентрации разливают, соблюдая правила асептики, в пробирки по 5 мл. Среду удвоенной концентрации разливают во флаконы по 10,5 и 100 мл.
Готовая к употреблению среда имеет яркий синий цвет.

Рецепт 122. Молочно-ингибиторная среда (МИС)
Среда предназначена для выделения энтерококков
Состав: мл
Агар стерильный 2 % 85
Молоко снятое стерильное 15
Кристаллический фиолетовый
водный раствор 0,01 % 1,25
Теллурит калия 2 % водный
раствор 1
Молоко доводят до кипения, оставляют на сутки в холодильнике, освобождают от сливок, вторично доводят до кипения, вновь оставляют на одни сутки в холодильнике, вторично снимают верхний слой. Обезжиренное молоко может быть приготовлено путем сепарирования.
Обезжиренное молоко разливают в стерильную посуду и стерилизуют при температуре 100°С в течение 3 сут по 30 мин или однократно при температуре (116±1) °С в течение 20 мин.
После стерилизации молоко не должно принимать коричневый цвет.

Рецепт 123. Желчная среда Турчинского (ЖСТ)
Среда применяется для выделения энтерококков из почвы, сточных вод, открытых водоемов, бассейнов для плавания.
Состав: г/л
Дистиллированная вода 600 мл
Желчь крупного рогатого скота 400 мл
Агар сухой питательный 35,0–40,0
Гидроортофосфат калия
(К2НРO4) 5,0
Дигидроортофосфат калия
(КН2РO4) 5,0
Натрий аммиак фосфата 5,0
Перечисленные ингредиенты нагревают на медленном огне до расплавления агара. Устанавливают рН 7,2–7,4. Разливают мерно в бутыли или флаконы, стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин.
Перед употреблением к расплавленному и слегка остуженному агару добавляют на 100 мл среды:
Глюкозы стерильной 5,0
Хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия
(ТТХ) водного 1 % раствора 1 мл
Метиленового синего 1 % водный
раствор 0,6 мл
Среду хранят в холодильнике не более 14 сут.
Для подавления посторонней микрофлоры к 100 мл готовой среды перед разливом ее в чашки Петри добавляют антибиотики: 30 000 ЕД полимиксина М и 1 мл 0,1 % водного раствора фурацилина.
Смесь среды с антибиотиками тщательно смешивают, разливают в чашки Петри по 20–25 мл. Хранят в холодильнике не более 7 сут.
В стерильную остывающую среду добавляют, соблюдая правила асептики, стерильный раствор сахарозы, содержащий небольшое количество воды (30 г) и глюкозу (20 г).

Рецепт 124. Азидная среда Сланетца–Бартли
В 100 мл дистиллированной воды расплавляют 30 г пита¬тельного агара, 4 г гидроортофосфата калия (К2НРO4).
Основу среды стерилизуют при 120 °С в течение 20 мин и устанавливают рН 7,0.
Перед употреблением в расплавленный и остуженный агар на каждые 100 мл среды добавляют, соблюдая правила асептики:
Дрожжевой экстракт 2 мл
Глюкозу стерильную 1,0 г
Азид натрия (NaN3) 0,04 г
Хлорид 2,3,5 трифенилтетразолия
(ТТХ) водный 1 % раствор 1 мл
Среду тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 20–25 мл.

Рецепт 125. Среда Сланетца–Бартли (коммерческая; Himedia, Slanetz Bartley Medium, cat. M 612)
Среда Сланетца – Бартли рекомендуется для выявления и подсчета фекальных стрептококков.
Состав: г/л
Триптоза 20,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Декстроза 2,0
Дигидроортофосфат
калия (КН2РO4) 4,0
Азид натрия (NaN3) 0,4
Хлорид тетразолия 0,1
Агар 15,0
рН 7,2±0,2
Приготовление. Суспендировать 46,5 г в 1000 мл дистиллированной воды. Нагревать до кипения – для полного растворения среды. Не перегревать! Среду охладить и разлить по чашкам.
Использование. Среда разработана для обнаружения и под¬счета фекальных стрептококков методом мембранной фильтрации. Однако ее можно использовать непосредственно для посева материала в чашки Петри.
Учет результатов производят через 40–48 ч инкубации посевов в термостате при температуре 43–44 °С. Все красно-бордовые колонии можно учитывать как энтерококки.

Рецепт 126. Почвенный агар
Воздушную сухую почву, отобранную из верхнего горизонта или из любой почвы, богатой органикой (торфяной, чернозем¬ной), очищают от растительных остатков и других включений, измельчают в ступке, просеивают через сито с отверстиями 1 мм2. Измельченную почву помещают в колбу, заливают дистиллированной водой в соотношении 1:9. К полученной суспензии добавляют 2 % агар и стерилизуют дважды при 120 °С по 60 мин. Простерилизованную среду охлаждают до 56–60 °С и добавляют к ней стерильный дрожжевой автолизат в количестве 1 мл на 100 мл среды.
Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри с таким расчетом, чтобы в каждую чашку вместе с агаром попали почвенные частицы.
Рецепт 127. Пептонно-декстрозный агара Ваксмана
Среда предназначена для выделения и культивирования ми-целиальных грибов.
Состав: г/л
Глюкоза 10,0
Декстроза 20,0
Пептон 5,0
Гидроортофосфат калия (К2НРО4) 1,0
Сульфат магния (MgSO4 • 7Н20) 0,5
Агар 18,0
рН 7,0+0,2
Приготовление. Все перечисленные ингредиенты суспендировать в 1000 мл дистиллированной воды. Если выявляется осадок, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют автоклавированием в течение 20 мин при температуре 116 °С.
Разливают в стерильные чашки Петри.

Рецепт 128. Крахмально-аммиачная среда
Среда обеспечивает рост различных хемоорганогетеротрофных бактерий.
Состав: г/л
Растворимый крахмал 10,0
Сульфат аммония [(NH4)2SO4] 2,0
Дигидроортофосфат калия
(КН2РO4) 1,0
Сульфат магния [MgSO4 • 7Н2O] 1,0
Хлорид натрия 1,0
Карбонат кальция (СаСО3) 3,0
Агар 15,0
Вода водопроводная 1000 мл
Среду стерилизуют при температуре 120 °С в течение 20 мин, разливают в стерильные чашки.
Учет роста производят через 36–48 ч после инкубации в термостате при температуре 32–35°С.

Рецепт 129. Бульон и агар Чапека (для грибов; Himedia, Czapek Dox Agar/Broth, cat. M075/M076)
Среда является полусинтетической с нитратом натрия в качестве единственного источника азота. Используют ее для культивирования грибов.
Состав: г/л
М075 М076
Сахароза 30,0 30,0
Нитрат натрия 2,0 2,0
Гидроортофосфат калия
(К2НРО4) 1,0 1,0
Сульфит магния (MgSО4) 0,50 0,50
Хлорид калия (KCl) 0,50 0,50
Сульфит железа (FeSO4) 0,01 0,01
Агар-агар 15,0 ---
pH 7,3±0,2
Приготовление. Размешать 49 г порошка М075 или 35 г порошка М076 в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить до полного растворения частиц. Стерилизовать при температуре 121 °С в течение 15 мин. Готовая среда имеет светло-желтую окраску.
Принцип и оценка результатов. Эта одна из наиболее широко распространенных сред общего назначения для культивирования грибов. Ее можно использовать также для определения хламидоспор у Candida albicans. На агаре растут почти все сапрофитные аспергиллы, образуя характерный мицелий и конидии.
Учет результатов производится через 48–72 ч после инкубации при температуре 37 °С.

Рецепт 130. Агар Чапека – Докса (Himedia, Czapek Dox Agar, cat. M075)
Агар Чапека – Докса – одна из лучших плотных сред, обеспечивающая обильный рост грибов из почвы с образованием характерного мицелия и конидий: Рост грибов выявляется в течение 48–72 ч при 30 °С.
Состав: г/л
Сахароза 30,0
Нитрат натрия (NaNO3) 2,0
Фосфат калия двузамещенный 1,0
Сульфит магния (MgSO4) 0,5
Хлорид калия (КСl) 0,5
Сульфит железа (FеSO4) 0,01
Агар 15,0
Окончательный рН 7,3±0,2
Все перечисленные ингредиенты суспендируют в 1000 мл дистиллированной воды, нагревают до полного растворения веществ, стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.

Рецепт 131. Сусло-агар
1. Получение солодового сусла с массовой долей сухих веществ 7,5±0,5 %. Сусло фильтруют через полотно или фильтровальную бумагу, стерилизуют при 108 °С в течение 30 мин, затем декантируют. Содержимое веществ определяют ариометром-сахарометром. Полученное сусло разбавляют дистиллирован¬ной водой до массовой доли сухих веществ 7,5±0,5 %, разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 116 °С в течение 20 мин. Солодовое сусло можно заменить виноградным суслом, которое готовят аналогичным способом.
2. Получение среды. К 100 мл солодового сусла с массовой долей 7,5±0,5 % сухих веществ добавить 30 г агара. Среду нагревают до полного расплавления агара, фильтруют через гигроскопическую вату или фильтровальную бумагу. Охлаждают до 50 °С, устанавливают рН 3,6 с применением молочной кис¬лоты. Разливают в колбы, стерилизуют в течение 20 мин при температуре 116 °С и разливают в чашки Петри по 20–25 мл.

Рецепт 132. Желточно-солевой агар
Для приготовления желточно-солевого агара готовят впрок МПА (рН 7,2–7,4) с содержанием 10 % раствора поваренной соли. После разлива во флаконы по 100–200 мл агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 120 °С. Перед употреблением растапливают, охлаждают до 45–50 °С и добавляют 20 % (по объему) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150–200 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Среду быстро перемешивают, разливают в чашки, которые продолжительное время могут сохраняться в холодильнике.

Рецепт 133. Яично-желточная взвесь и эмульсия в изотоническом растворе хлорида натрия
Яично-желточную эмульсию готовят следующим образом: свежие куриные яйца моют мылом со щеткой, ополаскивают холодной водой, опускают в раствор этилового спирта 70 % и высушивают. Соблюдая правила асептики, разбивают каждое яйцо в чашку Петри и отделяют желток от белка. Помещают желток в стерильную колбу (30 г желтка и 70 мл стерильной воды), энергично перемешивают. Нагревают смесь на водяной бане при температуре 40±1 °С в течение 2 ч, оставляют на 18–24 ч при температуре от 0 °С до 5 °С для формирования осадка.
Соблюдая правила асептики, собирают эмульсию над осадком. Эмульсию хранят при температуре от 0 °С до 5 °С не более 72 ч.

Рецепт 134. Пептонно-солевой раствор
Пептонно-солевой раствор готовят следующим образом: 8,5 г хлорида натрия и 1 г пептона растворяют в 1000 мл дистиллированной воды при медленном нагревании. Полученный раствор при необходимости фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0±0,1, разливают в колбы, пробирки или в другую посуду, укупоривают и стерилизуют при температуре 121±1 °С в течение 30 мин.
Раствор хранят в темном месте при температуре 4±2 °С не более 30 дней в условиях, исключающих испарение влаги.
Температура пептонно-солевого раствора должна соответствовать температуре анализируемого продукта.

Рецепт 135. Среда Сабуро жидкая (Himedia, Sabouraud Dextrose Broth, cat. M033)
Декстрозный бульон Сабуро рекомендуется как среда для проверки микологической стерильности, а также для выращи¬вания дрожжей и плесеней.
Состав: г/л
Специальный пептон 10,0
Декстроза 40,0
рН 5,6±0,2
Приготовление. Суспендировать 30 г в 1000 мл дистиллированной воды. Разлить в пробирки или флаконы. Стерилизовать автоклавированием в течение 15 мин при температуре 121 °С.
Использование, результаты. Декстрозный бульон Сабуро рекомендован для выращивания дрожжей, плесеней и ацидофильных бактерий. Культуральные характеристики получают через 40–72 ч после инкубации при 30 °С.

Рецепт 136. Агаризованная среда Сабуро
Среда предназначена для выделения из объектов внешней среды дрожжей и плесневых грибов.
Состав: г/л
Глюкоза 40,0
Пептон 10,0
Агар 18,0
Приготовление. К 1000 мл воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 40 г глюкозы и 10 г пептона, нагревая до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Устанавливают рН 6,5±1. Стерилизуют при 116±1 °С в течение 20 мин. При охлаждении среды до 45–50 °С разливают в чашки Петри, соблюдая правила асептики.
Для обогащения факторами роста к среде добавляют иногда дрожжевой или мясной экстракты в количестве 2–5 г на 1 л среды.

Рецепт 137. Жидкое солодовое сусло
Применяют для культивирования дрожжей и плесневых грибов.
Приготовление. К 1000 мл водопроводной воды, подогретой до 50 °С, добавляют 200 г молотого ячменного солода. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 мин, подогревают на водяной бане со скоростью 1 °С в минуту до 55±1 °С. Выдерживают паузу – 15 мин, затем вновь с такой же скоростью поднимают температуру до 63–65 °С и удерживают на этом уровне в течение 1 ч. Далее температуру поднимают со скоростью 1 °С в минуту до 72±1 °С, выдерживают сусло при этой температуре до полного осахаривания.
Степень осахаривания сусла проверяют раствором Люголя (рецепт 34). Для этого каплю сусла переносят в фарфоровую чашку и осторожно прибавляют к нему каплю раствора Люголя. Окончательно осахаренное сусло не должно изменять окраску в присутствии индикатора.
Полученное сусло фильтруют через полотно, доливают водопроводной водой до 1000 мл и стерилизуют в автоклаве при 107–110 °С в течение 30 мин. Затем сусло декантируют.
Прозрачное сусло разбавляют водой до массовой доли сухих веществ 7–8 %, разливают в стерильную посуду, стерилизуют в течение 20 мин при 116 °С.

Рецепт 138. Солодовое агаризированное сусло (для определения дрожжей и грибов в продуктах)
В 1000 мл водопроводной воды температурой 50 °С вносят 250 г ячменного неферментированного солода, ставят на водяную баню. В течение 30 мин поддерживают температуру смеси 45 °С. Затем медленно (не быстрее чем на 1 °С в минуту) доводят температуру до 63 °С и поддерживают ее до конца осахаривания (в течение 2 ч).
Осахаренный раствор фильтруют через сито, отжимают и после остывания устанавливают плотность сусла по сахаромет¬ру ЗБ или 6Б. Сусло разливают в колбы, добавляют 2 % агар и стерилизуют в автоклаве при 112 °С в течение 20 мин. (До¬пускается использование готового неохмеленного пивного сусла.)
Среды предназначены для определения дрожжей и грибов в продуктах, сильно обсемененных микроорганизмами. Сусло подкисляют стерильным раствором лимонной кислоты в концентрации 200 г/л или стерильным раствором молочной кис¬лоты с объемной долей молочной кислоты 40 % до рН 3,6±0,1, при этом в среде увеличивают количество агара до 30 г/л.

Рецепт 139. Солодовое агаризованное сусло
Применяют для культивирования дрожжей плесневых грибов.
К 1000 мл солодового неохмеленного сусла с концентрацией 7–8 % сухих веществ прибавляют 20 г агара. Среду расплавляют на водяной бане или текучим паром и фильтруют через гигроскопическую вату или фильтровальную бумагу.
Фильтрат разливают в стерильные колбы или пробирки и стерилизуют при температуре 116±1 °С. Для выявления дрожжей и плесневых грибов из продуктов, обильно обсемененных микроорганизмами, сусло перед использованием подкисляют 2–3 мл стерильного раствора лимонной кислоты в концентрации 200 г/л до рН 3,5.

Рецепт 140. Агар триптозо-сульфит-циклосериновый
Среда предназначена для выделения С. рerfringens из пищевых продуктов.
Состав: г/л
Триптоза 15,0
Ферментативный пептон 5,0
Дрожжевой экстракт 25,0
Безводный тиосульфит натрия 1,0
Цитрат аммонийного железа 1,0
Агар 20,0
Приготовление. Основу питательной среды готовят следующим образом: перечисленные выше ингредиенты растворяют в 1000 мл кипящей дистиллированной воды. Устанавливают pH с таким расчетом, чтобы после стерилизации этот показатель был 7,6±0,1.
Основу среды стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин и хранят при температуре 4±2 °С не более 14 сут.
Непосредственно перед употреблением к 100 мл основы добавляют циклосерин. Для этого среду расплавляют, охлаждают до 45–50 °С и вносят 0,4 г циклосерина на 1000 мл среды.

Рецепт 141. Агар сульфит-полимиксин-неомициновый
Среда применяется для выделения C. perfringens из пищевых продуктов.
Состав: г/л
Ферментативный пептон 17,0
Дрожжевой экстракт 15,0
Хлорид натрия 5,0
Безводный тиосульфит натрия 1,0
Цитрат аммонийного железа 1,0
Агар 15,0
Приготовление. Перечисленные ингредиенты добавляют к 1000 мл дистиллированной воды. Периодически помешивая, смесь подогревают до кипения. Кипятят до полного растворения всех составных частей. Устанавливают pH из такого рас¬чета, чтобы после стерилизации этот показатель был 7,6±0,1. Стерилизуют при температуре 121 °С в течение 20 мин. Основу среды хранят в холодильнике при 4±2 °С не более 14 сут.
Непосредственно перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45–50 °С и добавляют в нее антибиотики из расчета: неомицина – 1 мл на 1000 мл или 50 мкг/мл основной среды (из раствора основной концентрации 50 г/л) и полимиксина – 8 мл на 1000 мл или 20 мкг/мл основной среды (из раствора основной концентрации 2,5/л).

Рецепт 142. Сахарно-кровяной агар по Цейсслеру (для выделения анаэробов, в частности C.perfringens, из пищевых продуктов)
К 1000 мл расплавленного и охлажденного до температуры 50 °С МПА добавляют 10 мл глюкозы в концентрации 200 г/л и 15–20 мл свежевзятой стерильной дефибринированной крови крупного рогатого скота, лошадей или овец. Смесь осторожно взбалтывают, избегая образования пены и пузырей, разливают в чашки Петри, подсушивают в термостате. Хранят при температуре 4±1 °С. рН среды 7,2–7,4.
В агар Цейсслера можно добавлять антибиотики: полимик-син, циклосерин, неомицин и др.

Рецепт 143. Железосульфитный агар (Вильсона–Блера) для C.perfringens
Состав: г/л
Глюкоза 10,0
Сульфит натрия (Na2SО3) 5 мл
Сульфат железа закисный 8 %
(FeSО4) или хлорид железа
(FeCl2) 1 мл
рН готовой среды 7,4
В 1000 мл стерильного расплавленного питательного агара добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при 112 °С в течение 12 мин (основная среда).
Растворы: 20 % – сульфита натрия, 8 % – сульфата или хлорида железа готовят ex tempore на стерильной дистиллированной воде, в стерильной посуде. Раствор сульфита натрия стерилизуют текучим паром в течение 1 ч. Перед постановкой анализа в 100 мл расплавленной среды вносят 5 мл 20 % сульфита натрия и 1 мл 8 % сульфата железа или 1 мл хлорида железа. Готовую среду тщательно перемешивают и, соблюдая правила асептики, разливают столбиком высотой 12–15 см.

Рецепт 144. Дифференциальная улучшенная клостридиальная среда (жидкая, вязкая, плотная)
Применяют для культивирования мезофильных анаэробных микроорганизмов.
Состав: г/л
Мясная вода 800 мл
Мясной экстракт 10,0
Пептон 10,0
Дрожжевой экстракт (сухой) 1,5
или
Раствор дрожжевого экстракта 7 мл
Ацетат натрия 5,0
Растворимый крахмал 1,0
Глюкоза 1,0
Гидрохлорид цистеина 0,5
Раствор сульфита
натрия (NaSO3 • 7Н2O) 40 г/1000 мл
Раствор цитрата железа
(FeC6H5O7 • 7Н2O) 70 г/1000 мл
Приготовление среды. В 800 мл дистиллированной воды вносят 10 г мясного экстракта (допускается замена дистиллированной воды и мясного экстракта 800 мл мясной воды), 10 г пептона, 1,5 г дрожжевого экстракта или 75 мл раствора дрожжевого экстракта, 5 г ацетата натрия.
Отдельно 1 г растворимого крахмала вносят в небольшую порцию воды и при непрерывном помешивании переносят в кипящую воду, доводя объем до 200 мл. Полученный крахмальный клейстер добавляют к 800 мл смеси, содержащей остальные компоненты, и кипятят на водяной бане в течение 30 мин.
После кипячения к раствору добавляют 1 г глюкозы и 0,5 г/л цистеина гидрохлорида, рН доводят до 7,1–7,2.
Горячий бульон фильтруют через бумажный фильтр.
Для приготовления вязкой среды в раствор добавляют 2 г агара на 1 л среды.
Для приготовления плотной среды используют 15–20 г агара на 1 л среды.
Среды стерилизуют в автоклаве при температуре 121±1 °С в течение 15 мин. Используют растворы сульфата натрия Na2SO3 • 7Н2O в концентрации 40 г/л и цитрата железа FeC6H5O7 • 5Н2O в концентрации 70 г/л (готовят при нагревании).
Растворы стерилизуют фильтрованием и хранят при темпера¬туре 3–5 °С в полностью заполненных флаконах не более 14 сут.
Перед употреблением основу среды регенерируют и охлаждают. Растворы сульфита натрия и препарата железа смешивают в равных объемах и асептически добавляют в охлажденную среду из расчета 0,5 мл смеси на 25 мл основной среды.

Рецепт 145. Полужидкая питательная среда для изучения подвижности и редукции нитратов
Среда предназначена для определения подвижности культивируемых микроорганизмов и выявления у них нитратредуктазы.
Состав: г/л
Галактоза 5,0
Глицерин 5,0
Нитрат калия
(не содержащий нитрит) 1,0
Двузамещенный фосфат натрия
(безводный) 2,5
Агар 3,0
Приготовление. Перечисленные ингредиенты растворяют в 1000 мл кипящего МПБ. Устанавливают рН таким образом, чтобы после стерилизации этот показатель был 7,4±0,2. Готовую среду разливают в пробирки и стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин.
Перед употреблением среду кипятят в течение 10 мин в кипящей водяной бане и быстро охлаждают.
Для определения редукции нитрата пользуются реактивом Грисса (см. рецепт 77).

Рецепт 146. Среда Роберта в забуференном бульоне (для культивирования C.perfringens)
Состав: г/л
Двузамещенный фосфат калия 2,0
Нитрит 2,0
Агар 1,0
Желатин 30,0
МПБ 25 мл
2,3,5 -Трифенилтетразолий
хлорид в концентрации 10 г/л 10 мл
В 1000 мл дистиллированной воды вносят 2 г нитрата калия, 2 г двузамещенного фосфата калия, 1 г агара, 30 г желатина и после набухания желатина нагревают на водяной бане до полного растворения желатина и агара. Добавляют 25 мл стерильного МПБ и 10 мл 2,3,5-трифенилтетразолиума хлорида в концентрации 10 г/л, устанавливают pH 7,1±0,1. Стерилизуют 3 сут подряд при температуре 100±1 °С в течение 20 мин или одно¬кратно при температуре 110±1 °С в течение 15 мин. Среда должна быть бесцветной.

Рецепт 147. Забуференная пептонная вода (Himedia, Buf-feref Peptone Water, cat. M614)
Забуференная пептонная вода используется как среда пред-обогащения для повышения темпов восстановления поврежденных Sallmonella spp. из пищевых продуктов для селективного обогащения и выделения.
Состав г/л
Пептон 10,0
Хлорид натрия (NaCI) 5,0
Двуосновный фосфат натрия 3,5
Одноосновный фосфат калия 1,5
pH 7,2±0,2
Приготовление. Суспендировать 20 г в 1000 мл дистиллированной воды. Разлить по 50 мл или в требуемом количестве и стерилизовать автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.
Использование. Установлено, что сальмонеллы с сублетальным повреждением могут быть обнаружены во многих продуктах. В забуференной пептонной воде в течение 18 ч при 35 °С происходит репарация поврежденных клеток.
Результаты. Культуральные характеристики – через 18 ч при 35 °С.

Рецепт 148. Глюкозофосфатиый бульон
Предназначен для родовой идентификации энтеробактерии по тесту с метиловым красным и в реакции Фогеса–Проскауэра.
Состав: г/л
Панкреатический
гидролизат кормовых дрожжей 4,0
D-глюкоза 5,0
Динатрия фосфат обезвоженный 3,5
рН 7,0±0,25
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать віл дистиллированной воды, кипятить 2–3 мин, разлить в пробирки по 2 мл. Стерилизовать текучим паром при 100 °С по 20 мин в течение 3 дней.
Готовая среда прозрачная, бесцветная, допускается мелкая опалесценция. Хранить при температуре 5 °С не более 3 сут.
Постановку реакции с метиленовый красным и реакцию Фогеса–Проскауэра см. в гл.9.

Рецепт 149. Основа бульона Фрейзера (Himedia, Fraser Broth Base, cat. M1327)
Основа бульона Фрейзера с добавками рекомендуется международным комитетом стандартизации как первичная, так и вторичная среда обогащения для выделения и подсчета Listeria monocytogenes из пищевых продуктов.
Состав: г/л
Ферментативный гидролизат
казеина 5,0
Пептический перевар животной
ткани 5,0
Мясной экстракт 5,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Хлорид натрия 20,0
Дигидрофосфат калия 1,35
Гидрофосфат натрия 12,0
Эскулин 1,0
Хлорид лития 3,0
рН 7,2±0,2
Приготовление. Суспендировать 54,92 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прогреть до полного растворения среды. Стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин. Охладить до 45–50 °С и асептически добавить регидрированное содержимое 1 флакона FD1251 и 2 флаконов FD141. Для вторичного обогащения к 500 мл бульона Фрейзера добавляют содержимое 1 флакона FD1251 и 1 флакона FD141. Бульон хорошо перемешивают и разливают во флаконы или пробирки.
Селективные добавки для первичного обогащения
На флакон:
1. FD1251
Акрифлавина гидрохлорида 12,5 мг
Налидиксовая кислота 10 мл
Растворить содержимое флакона в 10 мл гидроксида натрия. Перемешать и асептически добавить к 1000 мл стерильной среды.
2. FD141
Железа аммонийного цитрат 250 мг
Растворить содержимое флакона в 1–2 мл стерильной дистиллированной воды и перемешать. Для первичного обогащения добавить содержимое 2 флаконов в 1000 мл стерильной среды.
Готовая среда имеет желтую окраску. С добавкой желтый раствор образует слабый преципитат.
ОСТОРОЖНО! Хлорид лития опасен.
Избегать контакта порошка с кожей.
Принцип и интерпретация результатов. Бульон Фрейзера применяется как первичная и вторичная среды обогащения для выделения и подсчета L.monocytogenes. Единственное различие состоит в количестве добавок. Хлорид лития, налидиксовая кислота и акрифлавин предназначены для подавления грамотрицательной и грамположительной флоры. L.monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин и глюкозу. Реагируя с цитратом железа, эскулетин образует коричнево-черный комплекс, что приводит к потемнению среды.
Исследуемые образцы для первичного обогащения иноку-лируют в среду в объеме 0,1 мл при температуре 30 °С, для вторичного обогащения – в течение 18 ч при температуре 35–37°С. Обогащенную культуру высевают на Оксфордский агар или на РАLСАМ-агар для дальнейшего выделения и под¬счета колоний.

Рецепт 150. Основа бульона вторичного обогащения для листерий (Himedia, Fraser Secondray Enrichment Broth Base, cat. M1083)
Среду со специальной добавкой рекомендуют для выделения, культивирования и обогащения L.monocytogenes из пищевых продуктов и объектов внешней среды.
Состав: г/л
Протеозопептон 5,0
Гидролизат казеина 5,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Мясной экстракт 20,0
Хлорид натрия (NaCl) 20,0
Хлорид лития 3,0
Гидрофосфат натрия 12,0
Дигидроортофосфат калия 1,35
Эскулин 0,50
Цитрат железа аммонийного 0,50 Конечное значение рН 7,2±0,2
Ингредиенты размешать в 990 мл дистиллированной воды. Подогреть до кипения для полного растворения Частиц. Стерилизовать при 121 °С в течение 15 мин. Остудить до 45–50°С и асептично добавить растворенное в воде содержимое 1 флакона с одной из добавок Фрейзера (FD064 или FD065). Тщательно размешать и разлить в мерные колбы или флаконы (добавки прилагаются фирмой к основе среды).
Готовая среда желтого цвета, прозрачна, с легким преципитатом. После введения добавки среда флюоресцентно-желтая. Преципитат сохраняется.
Антибактериальная добавка:
FD065 (содержимое флакона в 10 мл среды)
Гидрохлорид акрифлавина 25 мг
Налидиксовая кислота 40 мг
Растворить содержимое флакона в 10 мл 0,2 N гидроксида натрия. Перемешать и асептически добавить к 990 мл основы бульона вторичного обогащения.
Принцип и оценка результатов. Протеозопептон, гидролизат казеина, дрожжевой и мясной экстракты являются источника¬ми питательных веществ для роста листерий. Хлорид лития подавляет рост энтерококков. Все листерий гидролизуют эскулин до эскулетина, который с ионами железа формирует коричнево-черный или черный комплекс. Цитрат аммонийного железа стимулирует рост L.monocytogenes.
Этот бульон засевают со сред первичного обогащения. Все обогащенные на бульоне культуры отсевают на плотные среды для подтверждения присутствия листерий.

Рецепт 151. Агар для идентификации листерий (Himedia, Listeria Identification Agar (PALCAM), cat. M1064)
Агар для идентификации листерий (ПАЛКАМ) используют для селективного выделения и идентификации Listeria.
Состав: г/л
Пептон 23,0
Крахмал 1,0
Хлорид натрия 5,0
Маннит 10,0
Цитрат аммонийного железа 0,50
Эскулин 0,80
Глюкоза 0,50
Хлорид лития 15,0
Феноловый красный 0,08
Агар 13,0
рН 7,0±0
Приготовление. Суспендировать 69 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить до полного растворения среды. Стерилизовать в автоклаве при 121 °С в течение 15 мин. Охладить до 50 °С и асептически добавить регидратированное содержимое селективной добавки для листерий (FD061). Тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри.
ВНИМАНИЕ! Хлорид лития опасен. Избегать контакта с кожей. При контакте с кожей немедленно обильно промыть поверхность кожи водой.
Селективная добавка (PALCAM-агар) FD061
Полимиксин В 50 000 ЕД
Цефтазидим 10 мг
Гидрохлорид акрифлавина 2,5 мг
Растворить содержимое флакона в 5 мл стерильной дистиллированной воды и асептически добавить в 500 мл стерильной расплавленной среды. Готовая среда красного цвета, прозрачна, со слегка опалесцирующей поверхностью.
Принцип действия и оценка результатов. PALCAM-агар рекомендуется для выделения листерий из пищевых продуктов.
Среда высокоселективна из-за наличия в ней хлорида лития, цефтазидима, полимиксина В и акрифлавина.
PALCAM-агар – дифференциально-диагностическая среда.
Используются две индикаторные системы – эскулиновая и маннитоловая. L.monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин и глюкозы. В реакции с цитратом железа эскулетин образует коричневый комплекс, что приводит к потемнению среды вокруг колонии. Листерин не ферментируют маннита, поэтому сбраживающие маннит энтерококки и стафилококки формируют колонии от желтого до красного цвета. Микроаэрофильные условия ограничивают рост аэробов, подобных представителям родов Bacillus и Pseudomonas. Добавление среды с кровью поверх PALCAM-arapa позволяет дифференцировать и подсчитывать количество гемолитических листерий.

Рецепт 152. Основа Оксфордской среды для листерий (Himedia, Listeria Oxford Medium Base, cat. M1145)
Основа Оксфордской среды с добавками рекомендуется для выделения листерий из патологического материала.
Состав: г/л
Пептон специальный 23,0
Хлорид лития (LiCl) 15,0
Хлорид натрия (NaCl) 15,0
Крахмал кукурузный 1,0
Эскулин 1,0
Цитрат железа аммонийного 0,5
Агар 10,0
pH 7,0±0,2
Приготовление. Суспендировать 27,75 г порошка в 500 мл дистиллированной воды. Прокипятить до полного растворения среды. Стерилизовать автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин. Охладить до 50 °С и асептически добавить регидратированное содержимое селективной добавки FD071. Тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри.
Готовая среда темно-янтарной окраски с голубым отблеском.

Селективная добавка FD072
Содержимое флакона рассчитано на 500 мл среды (в мг):
Амфотерицин В 5,0
Колистина сульфат 10,0
Гидрохлорид акрифлавина 2,5
Цефотетан 1,0
Фосфомицин 5,0
Растворить содержимое одного флакона в 5 мл 50 % раствора этанола, энергично размешать до полного растворения и асептично добавить к 500 мл среды.
Принцип и учет результатов. Хлорид лития и антибиотики подавляют рост грамотрицательной микрофлоры и большей части грамположительной флоры (отдельные штаммы рода Sta¬phylococcus образуют эскулиннегативные колонии).
L.monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин, образует коричнево-черный комплекс, что приводит к потемнению среды вокруг колоний.

Рецепт 153. Триптонсоевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)
Триптонсоевый агар используется для получения изолированных колоний, которые подлежат дальнейшему изучению.
Состав: г/л
Ферментативный гидролизат
казеина 17,0
Пептон соевый 3,0
Хлорид натрия 5,0
Фосфат калия однозамещенный 2,5
Глюкоза 2,5
Дрожжевой экстракт 6,0
Агар микробиологический
(для TSYEA) 15,0
Перечисленные выше ингредиенты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,1–7,5 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Рецепт 154. Среда для определения лецитиназной активности листерий (коммерческая среда)
Готовится среда ГРМ-1
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
рыбной муки 15,0
Панкреатический гидролизат
казеина 10,0


Экстракт пекарных дрожжей
или
Экстракт дрожжевой (импортный) 2,0
Хлорид натрия 3,5
Глюкоза 1,0
Агар 10,0
Приготовление. Препарат в количестве, указанном на этикетке, размешивают в 1000 мл дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
В полученный фильтрат среды ГРМ-I добавляют активированный уголь, растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5 % (масса/объем). Желток куриного яйца раз¬водят в 150 мл изотонического раствора хлорида натрия и добавляют 5 % по объему к стерилизованному и охлажденному до 45–50 °С питательному агару. Среду разливают в чашки Петри, но не более 20 мл на чашку, и подсушивают при 37 °С. Аналогично готовят агар с добавлением желтка, но без активированного угля.

Рецепт 155. Солевой бульон для накопления стафилококков
К 100 мл расплавленного бульона с pH 7,2–7,4 (в колбе вместимостью 200 мл) добавляют хлорид натрия от 6,5 до 10 г. На слабом огне среду доводят до растворения соли, кипятят в течение 2–3 мин и разливают в пробирки по 10 мл. Стерилизуют в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин.

Рецепт 156. Агар Байрда–Паркера (Himedia, Baird Parker Agar Base, cat. M043)
Состав: г/л
Триптон 10,0
Говяжий экстракт 5,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Глицин 12,0
Пируват натрия 10,0
Хлорид лития 5,0
Агар 15,0
Окончательная pH 7,0±0,2
Суспендировать все ингредиенты среды в 1000 мл дистиллированной воды. Нагреть до кипения, продолжать нагрев до растворения частиц. Стерилизовать при 121 °С в течение 15 мин.
Охладить среду до 50–55 °С и добавить 50 мл эмульсии желтка куриного яйца FD045 и 3 мл стерильного 3,5 % раствора теллурита калия ED046 или добавить 50 мл FD047. Перед разливкой хорошо размешать.
Это специфическая среда для выделения S.aureus, рост которых выявляется на этой среде в течение 24 ч. Чашки со средой должны быть использованы в течение 48 ч.

 

Рецепт 157. Среда Хейфеца
А. Приготовлениерозоловой кислоты: 0,5 г порошка заливают 10 мл ректифицированного спирта, через 24 ч раствор готов к употреблению (можно использовать в течение месяца).
Б. Приготовление метиленового синего: 0,1 г порошка заливают 100 мл дистиллированной воды, через 24 ч раствор готов к употреблению. При хранении свойства его не изменяются, срок хранения не ограничен. Краски хранить в темном месте при комнатной температуре.
Состав: г/л
Пептон 10,0
Хлорид натрия 5,0
Маннит 5,0
Растворить в 1000 мл водопроводной воды, установить рН 7,4–7,6, нагреть до кипения, профильтровать, добавить 1 мл 50 % спиртового раствора розоловой кислоты и 2,5 мл 0,1 % раствора метиленового синего, простерилизовать однократно, нагревая 20 мин в текучепаровом аппарате, или прокипятить в колбе, закрытой ватной пробкой, в течение 5 мин.
Среду разливают по 7–9 мл в стерильные пробирки размером 19x180 мм. Цвет готовой среды красно-фиолетовый.
Среду двойной концентрации готовят аналогичным образом, уменьшив количество воды до 500 мл. Среду разливают в пробирки по 10 мл. Применяется для выделения колиформных бактерий.

Рецепт 158. Среда хинозол-бромкрезол-пурпурная "ХБ"
Предназначена для выделения колиформных бактерий и энтеропатогенов из пищевых продуктов и объектов внешней среды.
Состав: г/л
Пептон 10,0
Хлорид натрия (NaCl) 5,0
Маннит 5,0
Перечисленные ингредиенты кипятят 15–20 мин, устанавливают рН 7,4–7,6, фильтруют через бумажный фильтр, вновь кипятят 10 мин и охлаждают до температуры 60 °С.
Стерильно добавляют:
Дрожжевой автолизат (А) 30 мл
Желчь крупного рогатого скота 15 мл
Раствор хинозола (1:1000) (Б) 10 мл
Спиртовой раствор 1,6 % бром-
крезолового пурпурного (В) 10 мл
Среду разливают в стерильные пробирки по 7–8 мл. Цвет готовой среды – фиолетовый.
A. Приготовление дрожжевого автолизата: в 600 мл стерильной воды растворяют 1 г однозамещенного фосфата калия и 0,1 г сульфата магния, затем добавляют 100 г прессованных хлебных дрожжей и взбалтывают до получения суспензии. В колбу с суспензией наливают 8–10 мл хлороформа, закрывают ватной пробкой и накрывают колпачком из парафиниро¬ванной бумаги (для предотвращения испарения).
Колбу помещают в термостат при температуре 45–47 °С на 10 сут. Затем ставят на водяную баню и кипятят в течение 20 мин, фильтруют и стерилизуют при 121±10 °С в течение 15 мин.
Дрожжевой автолизат хранят в холодильнике при темпера¬туре 4–6 °С в течение 2 нед.
Б. Приготовление раствора хинозола: 0,1 г порошка растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды. При хранении свойства его не изменяются. Срок хранения не ограничен. Краски хранить в темном месте при комнатной температуре.
В. Для приготовления раствора бромкрезолового пурпурного: 0,8 г порошка заливают 50 мл этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению. Раствором можно пользоваться в течение месяца со дня приготовления.

Рецепт 159. Питательная среда для выделения и дифференциации энтеробактерии (среда Кода)
Предназначена для выделения энтеробактерии и их дифференциации по признаку ферментации лактозы (при санитар¬ном исследовании пищевых продуктов и объектов внешней среды – воды, смывов и пр.).
Состав: г/л
Питательный бульон 8,0
или
Пептон 13,0
Сульфанол (алкилбензолсульфанат) 10,0
Хлорид натрия 3,63
Лактоза 10,0
Бромтимоловый синий 0,05
Карбонат натрия безводный 0,32
рН 7,8±0,2
Приготовление. Навеску препарата, указанную на этикетке, размешать в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятить 1– 2 мин, профильтровать, повторно довести до кипения и раз¬лить по 5 мл в стерильные пробирки.
Готовая среда должна быть прозрачной, зеленого цвета. Среда может храниться 7 сут при температуре 5 °С.
Учет результатов. Наличие в посевном материале лактозоположительных бактерий определяется по изменению цвета среды от зеленого к желтому и помутнению среды. Помутнение среды без изменения цвета указывает на рост сальмонелл, шигелл, некоторых энтеропатогенных эшерихий, не разлагающих лактозу. Такие пробы должны быть подвергнуты дальнейшему бактериологическому исследованию. Среда ингибирует рост стафилококков и протея.

Рецепт 160. Тиогликолевая среда
Используется для определения стерильности биологического материала, фармакологических препаратов и объектов внеш¬ней среды, а также для культивирования анаэробных микро¬организмов.
Состав: г/л
Пептон 20,0
Глюкоза 6,0
Хлорид натрия 2,5
Тиогликолят натрия 0,5
Сульфит натрия 0,1
Бикарбонат натрия 1,0
Агар-агар 0,7
рН 7,2±0,2
Приготовление. Перечисленные ингредиенты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды на слабом огне до полного растворения частиц, доводят до кипения. Кипятят в течение 2–3 мин. Затем стерилизуют при 121 °С в течение 20 мин.
Перед употреблением среду расплавляют, затем дают остыть до 40–45 °С и вносят, соблюдая правила асептики, на 1 л среды витамина К – 0,0001 г, гемина – 0,005 г и сыворотку крови животных – 100 мл. После внесения добавок среду осторожно перемешивают, чтобы не произошло вспенивания, и разливают в стерильные чашки Петри по 20–25 мл.
Результаты посева учитывают через 24–48 ч инкубирования в термостате при 35–36 °С.

Рецепт 161. Среда Китта–Тароцци
Применяют для культивирования мезофильных и термо¬фильных анаэробных микроорганизмов.
Состав: г/л
Глюкоза 10,0
Агар 1,5
МПБ 1000 мл
Приготовление. В МПБ вносят 10 г глюкозы, разведенной в нескольких миллилитрах дистиллированной воды, и 1,5 г агара. Смесь при частом помешивании нагревают на слабом огне до полного расплавления агара.
В стерильные пробирки перед заполнением средой кладут кусочки (1–1,5 см3) вареной печени или мяса, пробирки заполняют средой. Высота слоя бульона в обычных пробирках 12–13 см, в высоких – 15–18 см. Заполненные пробирки стерилизуют в течение 20 мин при температуре 121 °С.
Величину рН проверяют до и после стерилизации. Готовая среда должна иметь рН 7,1±0,1.
При посевах в свежеприготовленную среду (не более 3 сут от момента приготовления) наслаивать на ее поверхность стерильное вазелиновое масло не обязательно.