Белковой основой всех сред является питательный буль­он; в зависимости от состава среды остальные ингреди­енты добавляют к питательному бульону. Существует два спо­соба приготовления основного питательного бульона: 1) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так на­зываемый мясопептонный бульон; 2) на переварах продук­тов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трип­сина - бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена) или кислоты.

Приготовленные в лабораторных условиях гидролизаты раз­водят до нужного значения аминного азота (от 120 до 200 мг%) и добавляют входящие в рецептуру среды ингредиенты, пред­варительно отвешенные на лабораторных весах.

Растворение. Подготовленные навески ингредиентов поме­щают в стеклянную колбу или кастрюлю, доливают требуемое количество бульона или дистиллированной воды, кипятят на электрической плитке до растворения всех компонентов, уста­навливают необходимое значение рН: сначала с помощью ин­дикаторной бумажки, а затем потенциометра.

Фильтрование. Жидкие питательные среды фильтруют через двойной складчатый фильтр из фильтровальной бумаги, пред­варительно смоченной водой, или через фильтровальное по­лотно, которое накладывают на стеклянную воронку. Полот­няные фильтры значительно практичнее бумажных, так как годны к употреблению в течение длительного времени, в то время как бумажные фильтры употребляются лишь однократ­но. Рекомендуется иметь отдельные полотняные фильтры для каждого вида среды.

Агаровые среды в расплавленном состоянии лучше всего фильтруются через ватно-марлевый фильтр: стеклянную во­ронку покрывают марлевой салфеткой такого размера, чтобы концы салфетки были перекинуты через края воронки наружу; затем на марлю кладут слой гигроскопической ваты, фильтр смачивают горячей дистиллированной водой. Агар наливают на фильтр горячим.

Желатиновую среду фильтруют через бумажный фильтр, предварительно смоченный дистиллированной водой. Жела­тельно фильтрацию производить быстро в теплом помеще­нии.

Розлив сред. После осветления и фильтрации питательные среды разливают в колбы, флаконы, пробирки, бутыли или матрацы.

Для разливки жидких питательных сред пользуются одной из описанных ниже установок.

  • На конец воронки, закрепленной в кольце штатива, наде­вают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным на­конечником. На резиновую трубку накладывают зажим Мора. Под воронку подставляют сосуд для приема про­фильтрованной среды.
  • • Для отмеривания и разливки определенных объемов среды пользуются градуированной бюреткой или собирают специ­альную установку (рис. 7.2). Стеклянную воронку и граду­ированную бюретку соединяют резиновыми трубками с двумя коленами стеклянного тройника, на третье его колено надевают резиновую трубку, заканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновые трубки, соединяющие ворон­ку с тройником, и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный ци­линдр жидкостью, затем, открыв второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Первые порции жидкости до вы­теснения воздуха из трубок не учитываются.

При розливе сред края посуды нельзя смачивать питательной сре­дой, так как ватно-марлевые пробки, Приклеиваясь к стеклу во время сте­рилизации, вынимаются с трудом и оставляют в просвете отверстия сосу­да остатки ваты. Попадая в среду, они могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.

Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными сре­дами надевают бумажные колпачки.

Разливка плотных стерильных пи­тательных сред в чашки Петри. Плот­ную питательную среду (агар, жела­тин) во флаконах или пробирках рас­тапливают в водяной бане (сняв предварительно бумажные колпач­ки). Среду охлаждают до температуры 45–50 °С, сосуд берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку и держат ее между мизинцем и ладонью, а края флакона или пробирки обжигают. Открытую посуду со средой держат в на­клонном положении, чтобы избежать попадания в среду мик­робов из воздуха. В асептических условиях вносят стерильную кровь, сыворотку или другие необходимые добавки, тщательно перемешивают содержимое сосуда. Левой рукой приподнимают с одной стороны крышку чашки Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15–20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по ее поверхности (рис. 7.3).

В настоящее время ряд фирм изготовляют приборы-авто­маты для разливки агаризованных сред в чашки Петри, обес­печивающие высокую стерильность и точное дозирование разливаемых сред. Один из таких приборов изображен на рис. 7.4.

При застудневании агара образуется большое количество конденсационной воды, которая оседает на внутренней сторо­не крышки и увлажняет поверхность среды. В связи с этим перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз. Чтобы избежать образования конденсированной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после заливки накрывают листом фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чаш­кой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда окончательно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

  • Синтетические среды и все жидкие и агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре 121 °С.
  • Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 110 – 112°С.
  • Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыво­ротка крови, асцитическая жидкость или антибиотики и другие добавки), стерилизуют фильтрованием или стериль­ные вещества добавляют в питательные среды ex tempore.

Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мем­бранные фильтры, изготовляемые различными фирмами.

Приготовленные к употреблению стерильные питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термо­стат при температуре 37 °С. Среды, простерилизованные в ав­токлаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные текучим паром – 3 сут.