Водородный показатель рН. Кислотно-основная реакция среды определяется балансом содержащихся в ней водородных и гидроксильных ионов. Для воды ионное произведение явля­ется константой и имеет следующий вид:

КН2О = [Н3О+] х [ОН-] = 10-14 моль2/дм6,

где [Н3О+] – концентрация ионов гидроксония, [ОН-] – кон­центрация гидроксидионов.

Водородный показатель рН (введен датским биохими­ком С.-П. Соренсеном в начале XX в.) используют для указа­ния концентрации ионов гидроксония в растворе. рН – это десятичный логарифм обратной величины концентрации ио­нов гидроксония:

pН = 1g (1 / [Н3O+])= -1g [Н3O+].

В связи с тем, что в нейтральном растворе концентрация [Н3О+] равна концентрации [ОН-] и составляет 10-7 моль/дм3, показатель рН для нейтрального водного раствора (а также воды) будет равен 7,0. При повышении основного раствора (увеличении концентрации [ОН-] и уменьшении концентра­ции [Н3O+]) показатель рН увеличивается, а при повышении кислотности (уменьшении концентрации [ОН-] и увеличении концентрации [Н3O+]) уменьшается.

В микробиологических лабораториях определение рН про­водится либо с применением специальных устройств – ионометров (рН-метров), либо при помощи специальных индикаторных полосок. Второй способ носит характер качественной или полуколичественной оценки, так как позволяет получить не точное значение рН, а диапазон значений.

Ионометрическое определение рН. При измерении рН рас­творов потенциометрическим (ионометрическим) методом общий принцип измерения такой. Берут два электрода: один электрод, чувствительный к концентрации ионов гидроксония (например, стеклянный или водородный электрод), а другой – электрод сравнения (каломельный электрод). Вводят электроды в исследуемый раствор и измеряют электродвижущую силу (ЭДС), которая возникает между электродами. После этого ЭДС соотносится с рН раствора (шкала измерения ЭДС трансформируется в шкалу измерения рН). Таким образом, прин­ципиальная схема любого рН-метра будет включать два электро­да – водородзависимый электрод и электрод сравнения – и высокоомный вольтметр со шкалой, отградуированной по зна­чениям рН (или ЭДС в мВ). На рис. 7.1 представлена прин­ципиальная схема ионометра/рН-метра (ионометр позволяет помимо рН и окислительно-восстановительного потенциала определять активность и концентрацию разновалентных анио­нов и катионов в водных растворах). Температура анализиру­емого раствора влияет на правильность измерения рН, поэтому необходима термокомпенсация показаний, что в современных приборах осуществляется автоматически. Приводить в настоя­щем издании изображение конкретного прибора нецелесообразно по причине многообразия марок и типов оборудования (выбор полностью предоставлен лаборатории, его следует осу­ществлять исключительно исходя из поставленных задач, области применения, технических характеристик приборов и материальных возможностей). Схема каждого конкретного при­бора помещается в инструкции к нему. Описания процедур измерения рН и калибровки также изложены в инструкциях к приборам и могут сильно отличаться друг от друга в зависимости от марки прибора. Тем не менее следует отметить ос­новные этапы работы с рН-метром/ионометром.

При рутинном измерении концентрации ионов необходимо:

  1. Подсоединить электроды к прибору.
  2. Включить прибор в электросеть.
  3. Установить нужный режим измерений (рН, рХ, темпера­тура, ЭДС и т. д.).
  4. Погрузить электроды в исследуемый раствор и произвес­ти измерения.
  5. Выключить прибор.
  6. Отсоединить электроды от прибора или, не отсоединяя от прибора, поместить их в раствор для хранения.

При калибровке прибора следует:

  1. Подготовить калибровочные буферные растворы по ин­струкции.
  2. Откалибровать прибор по инструкции.

ВНИМАНИЕ! Соблюдение условий хранения электродов прибора (в соответствии с инструкцией к нему) имеет прин­ципиальное значение для сохранения оборудования в рабо­тоспособном состоянии длительное время. Не следует до­пускать пересыхания электродов, в случае пересыхания их следует некоторое время выдержать в специальном растворе (если такая операция допускается в инструкции к прибору). Необходимо периодически промывать электроды при помо­щи рекомендованных в инструкции растворов с целью сня­тия отложений и загрязнений различной природы.

Существует возможность использования различных прибо­ров для определения рН растворов. Это и универсальные ионометры (типа ЭВ-74 – устаревшая модель, но все еще широко используется в лабораториях; И-160; Эксперт-001 и др.), и специализированные рН-метры – например рН-150 М бело­русского производства, Статус-2 и Экотест российского про­изводства и др.), так и импортные (к примеру, производства немецкой фирмы HANNA Instruments, швейцарской фирмы Меtrohm и др.). В России наибольшее распространение полу­чил рН-метр белорусского производства рН-150 М.

Современные приборы (типа рН-150 М и др.) в отличие от более ранних моделей не требуют проведения сложной кали­бровки, она осуществляется автоматически по одной или двум точкам (используются буферные растворы с точно известными значениями рН). Зарубежные производители, как правило, комплектуют свои приборы буферными растворами для калибровки.

Все приборы обязательно должны иметь сертификат Гос­стандарта, должны быть внесены в Государственный реестр средств измерений и периодически проверяться органами Госстандарта.

Определение рН при помощи индикаторных полосок с кислот­но-основными индикаторами (КОИ). КОИ – это вещества, ко­торые изменяют свою окраску в зависимости от рН среды, в которую они помещены. КОИ – это, как правило, либо слабые кислоты, либо слабые основания (в водных растворах они слабо диссоциированы). Так, слабая кислота – индикатор Hin (например, бесцветный фенолфталеин) при растворении в воде будет стремиться к следующему равновесию:

Hin (водный) + Н2О = Н3О+(водный) + In- (водный).

Кислота (бесцветный) → Сопряженное основание (розовый цвет).

В кислотной среде равновесие между индикатором – фе­нолфталеином (Hin) и его анионом (In-) сдвинуто влево, кон­центрация анионов In- слишком низка и их розовая окраска не заметна. В основной среде равновесие сдвигается вправо, концентрация анионов In-становится высокой и начинает обнаруживаться их розовая окраска. Таким образом, при низких значениях рН фенолфталеин полностью находится в форме Hin и раствор будет бесцветным. По мере же увеличения рН интенсивность розовой окраски, присущей In-, будет возрас­тать. Такое изменение окраски происходит в некотором диа­пазоне изменения значений рН (для фенолфталеина – от 8,2 до 10,0). Индикатор наиболее эффективен в том случае, если четкое изменение окраски происходит именно в узком диапа­зоне.

Для быстрого определения рН можно использовать готовые к применению индикаторные полоски. Основа-матрица (как правило, это фильтровальная бумага) таких тест-полосок про­питана индикатором, который при опускании в исследуемый раствор изменяет свой цвет в зависимости от его рН. Наиболее распространенные индикаторы и их характеристики представ­лены в табл. 7.1.

Для полуколичественного определения рН можно исполь­зовать хорошо зарекомендовавшие себя индикаторные полоски со сравнительной шкалой (полоски ФАН-рН и универсальные индикаторные полоски) и без сравнительной шкалы для опре­деления рН водных растворов производства чешской фирмы PLIVA-Lachema. Индикаторные полоски ФАН-рН предназначены для определения рН растворов в определенном диапазоне величин рН (0,4-1,4; 1,0-2,3; 1,9-3,4; 2,9-4,4; 3,9-5,4; 5,2-6,7; 6,0-7,5; 6,6–8,1; 7,3-8,8; 8,2-9,7; 10,0-11,0) и представля­ют собой полоски фильтровальной бумаги размером 85 х 10 мм, импрегнированные (пропитанные) различными индикаторами. На таких полосках имеется шесть цветовых зон, в середине полоски находится зона индикации для оценивания величины рН испытуемого водного раствора. Полоски упакованы в пластмассовый контейнер, на контейнере имеется шкала срав­нения для адекватного определения значения рН.

Таблица 7.1. рН-индикаторы

Индикатор

Окраска индикатора

рН-диапазон изменения окраски

в форме кислоты

в форме основания

Тимоловый синий (первое изменение)

Красная

Желтая

1,2-2,8

Тимоловый синий (второе изменение)

Желтая

Синяя

8,0-9,6

Бромтимоловый синий

»

»

6,0-7,6

Бромкрезоловый зеленый

»

»

3,8-5,4

Метиловый оранжевый

Красная

Желтая

3,2-4,4

Метиловый красный

Желтая

Красная

4,8-6,0

Феноловый красный

»

»

6,8-8,4

Фенолфталеин

Бесцветная

Розовая

8,2-10,0

Универсальные индикаторные полоски (импрегнированные универсальным индикатором) в отличие от полосок ФАН-рН позволяют определять рН в интервале от 0 до 12,0, они также упакованы в контейнеры со шкалой сравнения. Достаточно поместить на некоторое время (указывается в инструкции к каждому виду полосок) индикаторную полоску в раствор и затем определить рН, сравнивая проявившийся цвет полоски со шкалой сравнения на контейнере. В том случае, если необходимо определить лишь область значений рН (основная или кислая), можно использовать специальные полоски без шкалы сравнения. Так, полоска, импрегнированная фенолфталеином, служит для индикации основной реакции среды.

Вода. Вода необходима клеткам для их метаболизма и роста. Однако просто присутствие воды еще не означает, что она доступна для клетки. Доступность воды определяется ее активностью в среде (аw,). Величина аw отражает лишь доступную часть всех молекул воды и численно равна отношению давле­ния водяных паров к чистой воде (р/р0).

Минимальное давление аw при котором бактерии способны расти, значительно варьирует, однако для большинства видов оно превышает 0,99. Некоторые галофильные бактерии нужда­ются в ионах натрия и лучше всего растут в присутствии высоких концентраций хлористого натрия (аw - 0,80). Колеба­ния величины aw, могут оказывать влияние на скорость роста бактерий, их состав и метаболическую активность. Лучший способ стандартизации аw и осмотического давления бактерио­логических сред заключается в добавлении таких компонентов, как хлористый натрий, хлористый калий, сульфат натрия или смесь этих солей.