Еще одним направлением диагностического применения люминесцентной микроскопии является реакция иммунофлюоресценции. Эта реакция, как и любая серологическая реакция, основана на выявлении комплекса антиген–антитело, которое в этом случае производится с помощью люминесцентной микроскопии. Преимуществами этой реакции являются ее высокая чувствительность (выявляются отдельные микробные клетки, несущие определенный антиген), возможность наблюдения локализации антигена в клетке, а также возможность обнаружения искомого антигена в присутствии других антигенов. Этот метод может быть использован также для обнаружения антител. Суть метода заключается в том, что к молекуле антитела химическим путем (ковалентно) присоединяется флюорохром, который позволяет обнаружить антитело по его свечению при люминесцентной микроскопии.
В качестве таких флюорохромов чаще всего используют флюоресцеин, светящийся ярко-зеленым, и различные соединения родамина, обладающего красной флюоресценцией. Флюо-рохромы, вернее, их соединения, реагирующие с молекулой белка (изотиоцианат флюоресцеина, тетраметилродамин изо-тиоцианат, сульфородамиц и др.), присоединяются к иммуноглобулинам.
Было разработано несколько модификаций иммунофлюоресцентного метода, однако для диагностики обычно применяют прямой и непрямой методы. В прямом методе флюорохром присоединяют к антителам против искомого антигена. Практически постановка прямого метода заключается в следующем: фиксированный мазок на обычном предметном стекле (или на стекле со специальными луночками) из исследуемого материала помещают во влажную камеру, наносят меченную флюорохромом сыворотку, инкубируют, отмывают забуференным (рН 7,2–7,4) изотоническим раствором натрия хлорида, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Бактерии, несущие на поверхности антиген, реагирующий с содержащимися в сыворотке антителами, ярко светятся на темном фоне. Особенностью специфического свечения является флюоресценция в виде ободки вокруг бактериальной клетки. При исследовании материала, с которым могут неспецифически связываться белки антисыворотки, меченной флюоресцеином, применяют контрастирование фона, добавляя к антисыворотке альбумин, меченный родамином, или синьку Эванса, обладающую красным свечением. Непрямой метод отличается от прямого тем, что он является двухэтапным. На фиксированный препарат наносят обычную, немеченую антисыворотку, инкубируют, отмывают и подсушивают. Затем на этот препарат наносят меченную флюорохромом антисыворотку, содержащую антитела против Иммуноглобулинов того вида животного, от которого была Получена специфическая сыворотка. Например, если специфическая сыворотка против искомого антигена была получена иммунизацией кролика, то в качестве второй (люминесцирующей) сыворотки используют иммунную сыворотку против иммуноглобулинов кролика. Эту сыворотку получают иммунизацией глобулинами кролика других животных (козы, ослы). Таким же способом можно получить другие антивидовые сыворотки, в том числе к иммуноглобулинам человека. Благодаря этому непрямой метод может быть использован для обнаружения не только антигенов, но и антител. Этот метод успешно применяется в диагностических целях при различных инфекциях (микоплазмозы, хламидиоз, сифилис и др.) для обнаружения антигенов и антител. В частности, при сифилисе эта реакция позволяет обнаружить специфические антитрепонемные антитела. С этой целью готовят мазок из трепонемного антигена. На этот мазок наносят сыворотку больного, затем флюоресцирующую сыворотку к иммуноглобулину человека. Если в сыворотке больного присутствуют антитела к нанесенному на мазок антигену, то при просмотре этих препаратов в люминесцентном микроскопе наблюдается яркое свечение. Яркость свечения обычно оценивают субъективно (от + до ++++).