Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре E.coli с последующим выявлением зон лизиса га­зона E.coli на питательном агаре.

Для проведения качественного анализа в исследуемую пробу воды объемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратного (концентриро­ванного) питательного бульона (рецепт 91) и 1 мл подготов­ленного смыва тест-культуры или 2 мл 4-часовой бульонной культуры.

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий Е.coli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром (рецепты 88, 89).

Исследуемую пробу воды (100 мл) и чашку Петри с контро­лем E.coli инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18±2 ч. После инкубации из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа для освобож­дения от бактерий. Для этого пробирку закрывают стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 15 мин до полного осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий E.coli из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара.

В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки перено­сят 1 мл воды, обработанной хлороформом (не касаясь хлоро­форма), и заливают смесью расплавленного и остуженного до 45–49 °С питательного агара и E.coli объемом 12–15 мл. Этой же смесью агара и E.coli заливают дополнительную чашку Пет­ри для контроля культуры E.coli. После застывания чашки переворачивают дном вверх и помещают в термостат на 18±2 ч при 37 °С.

Учет результатов. Просмотр посевов осуществляют в про­ходящем свете.

Проба считается положительной при наличии полного ли­зиса, появления нескольких или одной бляшки просветления на чашке с пробой воды и при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 мл воды.

При наличии зон лизиса в контроле результат считается недействительным.

Для проведения количественного анализа исследуемую пробу воды в количестве 100 мл делят на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавляют 5 мл десятикратного питательного бульона (рецепты 90, 91) и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E.coli. В каждые 10 мл пробы вносят по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E.coli.

Посевы инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18±2 ч.

После инкубации из объема 50 мл отливают в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавляют по 1 мл хлороформа. Пробирки закрывают стерильными резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхивают и остав­ляют при комнатной температуре на 15 мин для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45–49 °С питательный агар добавляют приготовленный смыв бактерий E.coli из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разливают в чашки Петри: одну чашку для контроля культуры E.coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ста­вится один контроль для культуры E.coli.

После застывания агара чашки, предназначенные для посе­ва проб, делят на 6 секторов, маркируют их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствую­щей пробирки наносят пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле (без хлороформа) исследуемой воды.

После подсыхания капель чашки с анализируемыми проба­ми и контрольную чашку помещают в термостат при 37±1 °С на 18±2 ч.

Учет результатов. Результаты посева просматривают в про­ходящем свете. Учет проводится по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газона Е.соli.

При применении капельного способа посева пипеткой об­разуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха.

Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на кон­трольной чашке.

Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ) (табл. 18.3). В про­токоле анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел – верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный.

18.5.2. Прямой метод определения колифагов

Определение колифагов в питьевой воде заключается в ис­следовании нормируемого объема воды (100 мл) путем его прямого посева и последующего учета зон лизиса (бляшек) на газоне Е.соli в чашках Петри с питательным агаром.

Прямой метод выделения колифагов из воды проводят па­раллельно с титрационным при исследованиях по эпидемичес­ким показаниям.

Для этой цели в питательный агар двойной концентрации (рецепт 89), расплавленный и остуженный до 45–49 °С, добав­ляют смыв E.coli из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на каждые 100 мл агара и перемешивают. Исследуемые 100 мл воды делят по 20 мл в большие пробирки, нагревают до 35–44 °С и немедленно (не более чем через 5 мин по достижении требуемой температуры) разливают в 5 чашек Петри; сразу же вносят в каждую чашку по 20 мл смеси агара с культурой Е. coli.

Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри необхо­димо внести 20 мл стерильной водопроводной воды, предва­рительно прогретой до 35–44 °С, залить 20 мл приготовленного агара с Е.coli.

Содержимое чашек осторожно перемешивают и оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застыв­шим агаром помещают дном вверх в термостат и инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18±2 ч.

Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятна­ми на фоне газона тест-культуры в виде круглых изолирован­ных бляшек от 1 до 5–7 мм в диаметре с четко выраженными либо стертыми границами. При высоких концентрациях фага наблюдается разная картина лизиса.

Слияние негативных колоний дает "ажурный" газон E.coli, рост единичных колоний Е.coli на фоне сплошного лизиса либо полное отсутствие роста Е. coli на чашке.

Предварительный учет результатов можно проводить через 5–6 ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутст­вии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева про­водят через 18±2 ч. Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть вы­дан качественный результат.