Основным принципом оценки результатов комплексного ис­следования иммунного статуса является определение количест­венных и функциональных параметров всех его звеньев и их сравнение с нормальными величинами. Наиболее часто встреча­ющимися изменениями являются иммунодефицит, т.е. наруше­ния нормального иммунологического статуса, обусловленные де­фектами одного или нескольких механизмов иммунного ответа.

В набор тестов для оценки состояния иммунной системы должны входить методы определения количества нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, поглотительной и бактерицид­ной активности лейкоцитов и их способности образовывать активные формы кислорода, концентрации иммуноглобули­нов классов IgA, IgG, IgM, IgE, гемолитической активности комплемента, популяций и субпопуляций лимфоцитов, цитокинового статуса.

16.2.1. Оценка клеточного звена иммунной системы

Для характеристики клеток системы иммунитета исполь­зуют:

  • определение их общего количества по наличию маркера на поверхности клеток;
  • оценку их функции по выработке цитокинов, медиаторов и других продуктов in vitro.

Для выявления клеток иммунной системы используется оп­ределение на их поверхности дифференцировочных антиге­нов – CD (Cell Differentiation antigens) с помощью монокло-нальных антител, меченных флюоресцирующими красителями. Основные маркеры лимфоцитов представлены в табл. 16.4.

Таблица 16.4. Дифференцированные антигены лимфоцитов че­ловека

Рецепторы

Определяемый тип клеток

CD3

Зрелые Т-лимфоциты

CD4

Т-хелперы/индукторы

CD8

Т-супрессоры/цитотоксические

CD16

N10-клетки

CD19

Незрелые и зрелые В-лимфоциты

CD20

Зрелые В-лимфоциты

CD25

Активированные Т-клетки

CD95

Fas-положительные клетки (рецептор, опосре­дующий апоптоз)

Для определения количества основных популяций и суб­популяций лимфоцитов используют метод визуального подсче­та клеток с помощью люминесцентного микроскопа или авто­матического проточного цитофлюориметра.

Для идентификации поверхностных структур лимфоцитов и других клеток в основном используют две группы методов: 1) розеткообразование; 2) методы иммунофлюоресценции.

16.2.1.1. Техника подготовки пробы и подсчета основных популяций лимфоцитов иммунофлюоресцентным методом

  • • Выделение лимфоцитов из цельной гепаринизированной кро­ви проводят на фиколл-верографиновом (урографиновом) градиенте плотности 1,077 г/мл (см. раздел 16.4) с помощью центрифугирования в течение 30 мин при 1500 об./мин с последующим двукратным отмыванием концентрата лимфо­цитов раствором Хенкса.
  • После подсчета количества лимфоцитов в камере Горяева (достаточным для проведения методики считается 3000– 15000кл/мкл) взвесь клеток вносят по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета. Количество лунок соответствует количеству используемых моноклональных антител против дифференцировочных антигенов лимфоцитов.
  • После осаждения к клеткам добавляют по 20 мкл соответ­ствующих антител. После инкубации при 4° в течение 35– 40 мин во все лунки добавляют по 150 мкл раствора Хенкса и отмывают клетки центрифугированием при 200 об./мин в течение 5 мин с последующим удалением супернатанта. Отмывание повторяют трижды.
  • К осадку отмытых клеток добавляют по 20 мкл ФИТЦ-ме-ченных конъюгатов (вторичных овечьих антител к мыши­ным иммуноглобулинам в разведении 1:100). Для разведения используют 0,1 % раствор азида натрия в растворе Хенкса. Клетки ресуспендируют и инкубируют 30 мин при 4 °С.
  • После двукратного отмывания клетки переносят на пред­метное стекло и подсчитывают под покровным стеклом на люминесцентном микроскопе с иммерсией. Учитывают ко­личество светящихся клеток на каждые 200 лимфоцитов. Рассчитывают относительное (%) и абсолютное (кл/мкл) число лимфоцитов. Если результаты тестов будут учитывать­ся через несколько часов, то клетки необходимо зафикси­ровать. Для этого после заключительного центрифугирова­ния и удаления супернатанта к осадку клеток добавляют 50 мкл 1% раствора параформальдегида на фосфатносолевом буфере. Фиксированные клетки сохраняют флюоре­сценцию в течение недели.

Для микроскопирования клетки в каждой лунке суспенди­руют, переносят на отдельные предметные стекла, накрывают покровными и просматривают под иммерсией на люмине­сцентном микроскопе (объектив ×90).

Выделение лимфоцитов для автоматического подсчета на проточном цитофлюориметре проводится на градиенте плот­ности, как описано выше, так и путем лизиса эритроцитов специальными стандартными реагентами, выпускаемыми фир­мами–производителями реактивов для типирования клеток в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Метод проточ­ной лазерной фотометрии является универсальным и позволяет не только получить детальные характеристики клеточных суб-популяций, но и проводить их препаративное разделение. Прежде всего на основе анализа светорассеяния в исследуемом образце определяют содержание лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов. Используя прямой или непрямой метод флюоре­сценции, определяют численность различных субпопуляций лимфоцитов в соответствии с использованными меченными флюоресцеином специфическими моноклональными антите­лами. Помимо регистрации свечения, возможна оценка его интенсивности. Обработка полученных результатов проводится по специальной программе, встроенной в прибор.

16.2.1.2. Техника определения функциональной активности нейтрофилов

Для оценки нарушений в системе фагоцитоза существуют различные методы, с помощью которых можно выявить функ­циональные нарушения на всех стадиях процесса. Однако в клинической практике в настоящее время широко применя­ются те из них, с помощью которых изучаются только три последние стадии – поглощение и переваривание микроорга­низмов, а также продукция бактерицидных метаболитов кис­лорода. Принцип этих методов состоит в подсчете лейкоцитов, фагоцитирующих микробные клетки (чаще всего S. aureus 209Р) или частицы (чаще всего латекса диаметром 0,8–1,2 р или зимозана). Для определения бактерицидной активности чаще всего применяют варианты теста восстановления нитро-синего тетразолия (НСТ-тест) и методы хемилюминесцентного анализа (ХЛ-анализ), которые позволяют определить количе­ство клеток, продуцирующих метаболиты кислорода, и дина­мику этого процесса.

В целях получения большого числа нейтрофильных гранулоцитов, что существенно ускоряет процесс их подсчета в мазках, все варианты методов оценки фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов целесообразно проводить с лейкоцитар­ным концентратом. Для его получения в пробирку вносят 0,2 мл раствора гепарина с активностью 5000 ЕД/мл, разведенного изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:9, добавляют 5 мл венозной крови и перемешивают. Затем гепа-ринизированную кровь центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин до ее разделения на клеточный и плазменный слои. Пастеровской пипеткой осторожно отсасывают плазму и снимают средний слой лейкоцитов. Полученную лейкоцитную массу используют для определения поглотительной и бактери­цидной активности нейтрофилов.

Постановку реакции удобно проводить в 96-луночных план­шетах для иммунологических исследований, что позволяет эко­номно расходовать реагенты. Для определения поглотительной активности нейтрофилов в лунку планшета вносят 50 мкл 0,1 % взвеси латекса и 50 мкл клеточной взвеси, обогащенной лей­коцитами (получают из интерфазы между плазмой и эритро­цитами после центрифугирования гепаринизированной кро­ви). Параллельно целесообразно определять активность кисло­родного метаболизма (бактерицидность) нейтрофилов с помо­щью НСТ-теста. Для этого в две соседние лунки вносят по 50 мкл клеточной суспензии, а затем в одну из них, для определения спонтанной активности кислородного метаболиз­ма, вносят 50 мкл 0,1 % раствора нитросинего тетразолия (НСТ), а во вторую, для исследования индуцированной актив­ности, – по 25 мкл 0,1% взвеси латекса с диаметром частиц 0,8–1,4 ц. и 0,2 % раствора НСТ.

Смеси тщательно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин. По окончании инкубации на предметных стеклах де­лают 3 мазка – по одному мазку из каждой лунки. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют 20 мин 96 % этиловым спиртом и окрашивают метиловым зеленым[1].

Для подсчета клеток используют масляную иммерсию и объектив ×100.

При учете результатов латекс-теста подсчитывают относи­тельное количество фагоцитирующих клеток в процентах (ко­личество нейтрофильных гранулоцитов, содержащих в цито­плазме не менее 3 частиц латекса среди 100 нейтрофилов) и абсолютное количество, исходя из абсолютного числа нейтро­филов в 1 мкл крови.

Учет результатов НСТ-теста. При определении спонтан­ной активности кислородного метаболизма нейтрофилов в маз­ке из лунки с раствором НСТ подсчитывают количество лей­коцитов с четкими сине-фиолетовыми гранулами диформазана в цитоплазме среди 100 лейкоцитов. Результат выражают в относительных (%) и абсолютных количествах НСТ-положи-тельных клеток в 1 мкл крови (кл/мкл). Абсолютное количе­ство подсчитывают по формуле:

где Лц – абсолютное количество лейкоцитов в венозной крови (в кл/мкл), Нф – относительное количество нейтрофильных гранулоцитов (в %), НСТ – относительное количество нейтро­филов с гранулами диформазана в цитоплазме (в %).

Учет результатов активированного латексом НСТ-теста про­водят аналогичным образом, подсчитывая среди 100 грануло­цитов как клетки с частицами латекса и диформазана, так и клетки только с частицами диформазана в цитоплазме (акт. НСТ+-клетки).

Результат выражают в относительном (%) и абсолютном (кл/мкл) количестве клеток. Абсолютное количество подсчи­тывают по формуле:

 
   

где Лц – абсолютное количество лейкоцитов в венозной крови (в кл/мкл), Нф – относительное количество нейтрофильных гра­нулоцитов (в %), а.НСТ – относительное количество нейтрофи­лов с гранулами диформазана в цитоплазме в активированном НСТ-тесте (в %).

Хемилюминесцентный анализ нейтрофилов цельной крови проводят с помощью хемилюминометра, например "Люцифер" (СП "Диалог", Москва), управляемого от IВМ-компьютера по специальной программе. Для анализа используют стабилизи­рованную гепарином венозную кровь, разбавленную в 11 раз раствором Хенкса без фенолового красного. Регистрацию спон­танной хемилюминесценции (ХЛ) проводят в течение 40 мин в макрокюветах с повышенной прозрачностью (СоШагсИ, Ита­лия), в которые вносят по 200 мкл 0,56 мМ раствора люминола (Аldrich, США) и по 200 мкл разбавленных образцов крови. Затем в кюветы вносят по 50 мкл суспензии опсонизирован-ного зимозана (НПО "Биохим-реактив", Олайне) и продолжа­ют регистрацию ХЛ еще в течение 40 мин. После этого содер­жимое кювет перемешивают и для подсчета количества клеток 200 мкл суспензии переносят в лунки планшета для иммуно­логических исследований, содержащих по 50 мкл 0,5 % раство­ра генцианового фиолетового в 3 % растворе уксусной кисло­ты. В камере Горяева подсчитывают общее количество лейко­цитов, лимфоцитов и нейтрофилов, фагоцитировавших зи­мозан. Определение абсолютного количества клеток в кювете проводят по формуле:

где А – число клеток в 100 больших квадратах камеры Горяева; р – разведение суспензии окрашенных клеток; w – объем сус­пензии клеток в макрокювете люминометра в мкл; b – сторона большого квадрата камеры Горяева в мм; h – глубина камеры Горяева в мм; n – количество больших квадратов, в которых подсчитаны клетки.

Для оценки функциональной активности нейтрофилов с помощью ХЛ учитывают следующие параметры:

  • количество нейтрофилов в анализируемом образце крови (КН);
  • количество фагоцитирующих зимозан нейтрофилов (КФН) в анализируемом образце крови;
  • максимальная амплитуда спонтанной ХЛ (МАсп) – интенсивность свечения в анализируемом образце крови при спон­танной активации окислительного метаболизма лейкоцитов (имп. х 5 с);
  • максимальная амплитуда индуцированной ХЛ (МАинд) – ин­тенсивность свечения в образце крови при активации (зи-мозан) окислительного метаболизма нейтрофилов (имп. х 5 с);
  • коэффициент стимуляции (КС) – отношение МАинд к МАсп;
  • удельная спонтанная ХЛ нейтрофилов (Усп) – отношение МАсп к КН за единицу времени (имп/мин/тыс. кл), рас­считывается по формуле:
  • удельная индуцированная ХЛ нейтрофилов (Уинд) – отно­шение МАинд к КФК за единицу времени (имп/мин/ тыс. кл) рассчитывают по формуле:

16.2.2. Оценка гуморального звена иммунной системы

Для обнаружения в сыворотке крови иммуноглобулинов или антител к тому или иному микроорганизму или тканевому антигену применяют различные серологические методы, по­зволяющие визуализировать образование комплекса антиген-антитело. Основным условием является специфичность анти­гена, используемого в диагностической тест-системе или для иммунизации животных в целях получения антител.

16.2.2.1. Принципы методов определения антител в биологических жидкостях

Преципитация в растворах или в геле – наиболее простые, но и наименее чувствительные методы выявления антигенов или антител. В целом преципитация в растворах служит для определения титра антител, при этом растворимый антиген в постоянной дозе добавляют к исследуемой сыворотке, взятой в последовательных двукратных разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. Картину преципитации оценивают или визуально, или с помо­щью нефелометрии по степени помутнения раствора.

При постановке метода преципитации в геле один из двух реагентов включают в агар (обычно это специфические анти­сыворотки), другой реагент (антиген) в двукратных разведени­ях вносят в лунки, откуда он диффундирует в агар. При опти­мальном соотношении антигена и антитела образуется преци­питат, видимый невооруженным глазом.

Для диагностики инфекционных заболеваний более широ­кое распространение получили методы, основанные на фено­мене агглютинации. В отличие от реакции преципитации при вррпотинации антиген представлен в корпускулярной форме (прямая агглютинация эритроцитов или бактерий) либо связан с частицами носителя (эритроциты, латекс) – непрямая, или пассивная, агглютинация. Связывание антигена на микроско­пическом носителе послужило первым шагом на пути совер­шенствования метода, в частности привело к значительному повышению его чувствительности по сравнению с общеприня­той реакцией преципитации. Было установлено, что многие антигены бактерий способны спонтанно или посредством предварительной обработки танином, бензидином или глута-ровым альдегидом адсорбироваться на эритроцитах.

Специфичность реакции агглютинации тем выше, чем чище антиген, использованный для сенсибилизации эритроцитов. Конкуренция смеси антигенов (например, в гомогенате бакте­рий) за поверхность эритроцитов снижает воспроизводимость метода и часто увеличивает вероятность неспецифических реакций. Чувствительность агглютинации значительно варьирует при использовании разных систем антиген–антитело, кроме то­го, иммуноглобулины известных классов обладают разными агглютинационными свойствами. Так, способность к агглютина­ции у молекул IgM в 60–180 раз выше, чем у молекул IgG.

При помощи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) можно определять до 3–6 нг азота антител. По чувствительности РПГА равна или значительно превосходит реакцию связывания комплемента. Учитывая, что РПГА более чувствительна в отно­шении иммуноглобулинов класса М, чем класса G, становится ясным, что изменение титра РПГА связано не только с количе­ством антител, но и с их составом. Различия результатов титро­вания высоко- и низкоаффинных антител могут быть уравнены путем большей антигенной нагрузки эритроцитов. В связи с этим очень важным параметром соединения антигена с эрит­роцитами является плотность антигенных детерминант. Опти­мальное количество антигена для "нагрузки" эритроцитов то, которое дает максимальный титр антител.

Спонтанно связываются с эритроцитами только бактериаль­ные антигены полисахаридной природы. Антигены белковой природы адсорбируются на поверхности эритроцита очень сла­бо, поэтому для обеспечения связывания крупномолекулярных белковых антигенов на эритроцитах последние предварительно обрабатывают танином. Белки, богатые тирозином и гистидином, лучше связываются с эритроцитами, обработанными бен­зидином, а для конъюгирования белков, богатых аминогруп­пами, лучше всего применять глутаровый альдегид, который, кроме того, препятствует спонтанной агглютинации эритроци­тов в процессе хранения. Во всех случаях предварительная обработка эритроцитов способствует уплотнению и модифика­ции наружной мембраны эритроцитов, повышая ее адсорбци­онные способности.

Подобно преципитации метод непрямой гемагглютинации используется как полуколичественный анализ, с помощью ко­торого определяют то максимальное разведение сыворотки, при котором еще возможна агглютинация (титры антител). Результаты можно оценить макроскопически. Реакцию прово­дят в макро- или микротитровальных планшетах. Микротит­рование требует меньшего количества времени и материалов, но оно сопряжено с большей вероятностью ошибок, особенно при использовании больших разведений антител. Для досто­верности РПГА необходимы ежедневные позитивные и нега­тивные контроли, которые исключают бактериальное загряз­нение суспензии эритроцитов и антисывороток. Техника по­становки РПГА будет описана далее.

Для выявления антигенов микроорганизмов применяется также реакция связывания комплемента (РСК), основанная на том, что комплемент принимает участие в многочисленных реакциях связывания антигена с антителом. Постановку опыта осуществляют в два этапа. На первом этапе исследуемую сы­воротку и известный антиген инкубируют с комплементом. На втором этапе к смеси реагентов добавляют индикаторную сис­тему, состоящую из гемолитической сыворотки и эритроцитов. При взаимодействии антигена с антителом на первом этапе комплемент связывается и не может участвовать в гемолити­ческой реакции на втором этапе, поэтому гемолиз отсутствует или выражен незначительно. Если комплекс антиген–антитело не образуется, комплемент полностью включается в индика­торную систему, что сопровождается полным гемолизом. Эта реакция обладает достаточно высокой чувствительностью и применяется для диагностики сифилиса, вирусных инфекций и некоторых аутоиммунных заболеваний.

Перечисленные выше методы в силу своей относительно невысокой чувствительности позволяют выявлять только вы­сокие концентрации антител. Чувствительность методов, осно­ванных на связывании антигенов и антител, существенно по­вышается при связывании последних с различными метками (табл. 16.5). Как видно из приведенных в таблице данных, существенному повышению чувствительности и качества серо­логических методов способствует использование изотопных или ферментных меток. Различные модификации этих методов в настоящее время нашли наиболее широкое применение для диагностики инфекционных заболеваний.

Применение радиоизотопной метки возможно при условии, что антитела или антигены, меченные 131I, 125I или 3Н и 14С, сохраняют способность участвовать в иммунологических реак­циях. Как жидкофазная, так и твердофазная техника радиоиммунного определения

Таблица 16.5. Чувствительность методов выявления антител

Реакция

Выявляемые количества антител (миллиграммы азота антител в 1 мл)

Преципитация в растворе

3-5

Преципитация в геле

2-18

Агглютинация бактерий

0,02-20

Связывание комплемента

0,1

Агглютинация пассивная

0,005

Радиоиммуноанализ

0,0000001

Иммуноферментный анализ

0,000001-0,00000001

антигенов или антител не нашли широ­кого применения в диагностике инфекционных заболеваний и применяются в основном для определения белков и препара­тов, присутствующих в биологических жидкостях организма в "следовых" концентрациях (гормоны, медикаменты, фермен­ты, нуклеотиды, компоненты комплемента, мембранные ре­цепторы лимфоцитов).

Наряду с радиоиммунной техникой в арсенал иммунологи­ческих методов была включена ферментная метка. Для этого метода способ отделения меченого связанного реагента от не­связанного имеет решающее значение, что стало возможным с применением иммуносорбентной техники, которая получила название иммуноферментный анализ – ИФА. Чувствительность метода позволяет определять минимальные концентрации (на-нограммы) вещества.

Известно много вариантов ИФА, среди которых различают гомогенный и гетерогенный варианты. В основе гомогенного ИФА, применяемого для определения низкомолекулярных суб­станций (гаптены), лежит ингибирование активности фермен­та, использованного в качестве метки при его соединении с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции антигена с антителом), либо, наоборот, потеря актив­ности маркерного фермента в результате реакции антиген-антитело. В связи с этим удаление свободного антигена (АГ) из смеси, содержащей АГ в связанном виде, в составе иммун­ных комплексов невозможно.

В противоположность этому при гетерогенном ИФА АГ или антитела (АТ) фиксируются на твердой фазе (как правило, это пластик), а непрореагировавшие компоненты реакции удаля­ются многократным отмыванием после каждого этапа поста­новки метода. В зависимости от использованного для метки фермента применяются разные субстратные смеси – индика­торы реакции. Учет реакции осуществляется спектрофотомет-рически.

Практическое значение имеют следующие варианты ИФА:

  • непрямой тест,
  • техника "двойных" антител (сэндвич-метод),
  • "конкурентный" тест с использованием меченых антигенов и антител.

Перечень ферментов, наиболее часто используемых для мечения специфических антител, и индикаторов для визуализа­ции реакции представлены в табл. 16.6.

Таблица 16.6. Ферменты-маркеры, наиболее часто используемые в ИФА

Фермент

Индикатор реакции

Реагент для остановки реакции

Длина волны для оценки реакции

Пероксидаза

Н2O2 ортодианизидин или ортофенилендиамин; 2,2-азино-диэтилбензтиа-золинсульфат (АБТС)

НС1 5М

H2SO4

NaOH 1М

535

405

405

Щелочная фосфатаза

Паранитрофенилфосфат

NaOH 1М

402

Глюкозоокси­даза

Н2O2 (пероксидаза)о-диа-низидин или АБТС

H2SO4 0,5М

405

D-β-галактозидаза

Паранитрофенил-β-D-галактозид

H2SO4 0,5М

366

Особенности постановки различных вариантов ИФА заклю­чаются в стандартизации используемых антигенов и антител и тщательном отмывании от непрореагировавших реагентов на всех этапах реакции. Для выявления антител к бактериальным антигенам чаще всего используют непрямой ИФА (рис. 16.3, А). Для этого фиксированный на носителе бактериальный антиген инкубируют с исследуемой сывороткой крови пациента.

При наличии в сыворотке крови соответствующих антител они связываются с антигеном, а образующийся комплекс анти­ген–антитело выявляется с помощью меченных ферментом антител против иммуноглобулинов человека (конъюгат). Фер­ментативная активность метки регистрируется по степени раз­ложения субстрата, изменение окраски которого находится в прямой зависимости от количества антител, содержащихся в исследуемой сыворотке.

Если в состав конъюгата входят антитела против IgG чело­века, то в исследуемой сыворотке определяются только анти­тела, относящиеся к этому классу иммуноглобулинов. Если же в состав конъюгата входят антитела против IgM человека, то выявляются только антитела, состоящие из иммуноглобулинов этого класса, специфичные сорбированному антигену. Чем больше антител содержится в сыворотке, тем более интенсивно окрашивается субстратная смесь.

Рис. 16.3. Методы ИФА для определения бактериальных антигенов и антител.

А – непрямой ИФА; Б – сэндвич-метод ИФА; В – конкурентный метод (тор­можение).

П – твердая фаза (носитель); пунктиром обозначена стадия сорбции антиге­нами меченных ферментом антибактериальных антител, содержащихся в ис­следуемой сыворотке.

Для выявления антигенов используются как сэндвич-ме­тод, так и варианты конкурентных реакций. Принципы вари­антов ИФА представлены на рис. 16.3.

Техника двойных антител (сэндвич-метод) подразумевает применение специфических антител против одного или не­скольких бактериальных поливалентных антигенов. При этом используют моноклональные антитела или комплекс сыворо­точных иммуноглобулинов, которые фиксируют на твердом носителе (твердая фаза) и метят ферментом (конъюгат). Ис­следуемый образец сыворотки инкубируют с твердой фазой для образования комплекса антиген–антитело. Образовавшийся комплекс антител с поливалентным антигеном после стадии многократного отмывания инкубируют с конъюгатом (см. рис. 16.3, Б), а затем с соответствующим метке субстратом. Интен­сивность окраски субстратной смеси находится в прямой за­висимости от содержания антигена в исследуемом образце сыворотки. Возможен как визуальный, так и инструменталь­ный учет результатов с помощью спектрофотометра.

Выявление бактериальных антигенов в сыворотке крови возможно с помощью торможения реакции взаимодействия фиксированного на носителе антигена с соответствующими меченными ферментом антителами. Этот вариант ИФА пред­полагает введение дополнительной стадии, которая включает взаимодействие меченых антител (конъюгата) с антигенами, содержащимися в исследуемой сыворотке (см. рис. 16.3, В). При наличии в сыворотке крови антигенов, например синегнойной палочки, они связываются с соответствующими анти­телами антисинегнойного конъюгата полностью или частично. Поэтому при последующем взаимодействии с фиксированным на полистироле антигеном лишь свободные антитела конъюга­та способны связываться с ним. При этом интенсивность ок­раски субстратной смеси будет меньше, чем при отсутствии антигенов синегнойной палочки в исследуемой сыворотке, т.е. в данном случае зависимость между интенсивностью окраски субстратной смеси и количеством антигена в исследуемом об­разце обратно пропорциональная.

Иммуноферментный анализ чаще всего проводится в мик­роплатах с плоским дном, что позволяет проводить как каче­ственный, так и количественный учет результатов реакции на вертикальных спектрофотометрах. Для определения количества антигена готовят двукратные разведения стандартного антигена в пуле донорских сывороток (референс-положительные образ­цы) и проводят с ними реакцию торможения ИФА одновре­менно с исследуемыми образцами сыворотки пациентов. На основании оптической плотности образцов в лунках, соответ­ствующих разным разведениями референс-положительных об­разцов, строят калибровочную кривую (рис. 16.4).

Величину экстинкции в исследуемом образце сыворотки проецируют на калибровочную кривую. Для определения кон­центрации антигена в образце от точки пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс.

В последнее время по экономическим соображениям стали отказываться от метода ИФА на микротитровальных планше­тах. Примером может служить новый и более удобный для потребителя набор Immunocomb System, основанный на непря­мом методе ИФА, разработанный и выпускаемый фирмой "Оrgenics" (Израиль). В нем используется пластиковая гребенка с зубцами, на которых адсорбирован антиген. Пробу добавляют в соответствующие лунки специальной кассеты, куда вставля­ют зубцы гребенки. После первичной инкубации гребенку пе­реносят в промывающее устройство и затем в раствор, содер­жащий конъюгат антииммуноглобулинов с ферментом. После повторной промывки гребенку переносят в раствор субстрата, образующего нерастворимый окрашенный продукт. Такая последовательность позволяет одновременно проводить анализ и получать калибровочную кривую.

Рис. 16.4. Калибровочная кривая для спектрофотометрического учета результатов ИФА.

Другим примером усовершенствования набора может слу­жить использование полимерной палочки с иммобилизован­ными антителами, так называемого гамма-стика. Гамма-стик входит в набор Coli-Test 99 EIA, который разработала и вы­пускает фирма Molecular Genetics Inc для обнаружения Е. coli. Конструкция гамма-стика позволяет увеличивать количество антител, которые можно иммобилизовать на твердой фазе, и отношение площади поверхности реагентов к объему реакци­онной смеси, тем самым ускорив анализ. Такой вариант идеа­лен для проведения единичных проб. Напротив, микротитро-вальные планшеты идеально подходят для выполнения боль­шого числа анализов.

В настоящее время стандартные наборы для диагностики инфекционных заболеваний на основе ИФА сопровождаются подробной инструкцией по выполнению всех этапов выявле­ния антител или антигенов, что исключает необходимость по­дробного описания техники исследования. Принцип выполне­ния любого варианта ИФА состоит в последовательном вне­сении в лунки с фиксированными антителами или антигеном исследуемых сывороток и инкубации для образования ком­плекса антиген–антитело и отмывания от непрореагировавших компонентов. Затем вносятся меченные ферментом антитела к исследуемому антигену или иммуноглобулину, входящему в состав образовавшегося комплекса, и после повторной инку­бации проводится второй цикл отмывания и внесение суб­стратной смеси для визуализации продуктов реакции. В силу высокой чувствительности метода основные требования при проведении ИФА предъявляются к дозаторам, которые долж­ны обеспечивать взятие точного объема сыворотки или другого материала, и к этапам отмывания непрореагировавших продук­тов. Поэтому при невозможности проведения анализа в автома­тическом режиме внесение проб и реагентов необходимо осу­ществлять с помощью автоматических пипеток-дозаторов, регу­лярно проверяемых метрологической службой, а промывать лун­ки с помощью специального прибора – "вошера" или много­кратно с помощью многоканальной пипетки, тщательно вытря­хивая содержимое лунок после внесения отмывающего раствора.

16.2.2.2. Техника определения концентрации иммуноглобулинов

Количественное определение неспецифических иммуногло­булинов в сыворотке крови и биологических жидкостях харак­теризует функциональную активность В-лимфоцитов. В каче­стве основных методов определения иммуноглобулинов клас­сов А, М и G эксперты ВОЗ рекомендуют радиальную имму-нодиффузию (РИД) по Манчини и нефелометрию.

Для определения иммуноглобулинов методом РИД выпус­кают наборы моноспецифических антисывороток против им­муноглобулинов отдельных классов и стандартов (сывороток с известным содержанием иммуноглобулинов).

Реакцию проводят на стекле от фотопластинок (эмульсию удаляют кипячением в растворе стирального порошка) разме­ром 10x12 см, которые покрывают равномерным слоем 1,5 % агара, содержащего специфичную для конкретного иммуно­глобулина антисыворотку. Толщина слоя агара 1–1,1 мм.

Внесение в жидкий 1,5 % агар антисыворотки проводят на водяной бане при температуре 55–56°С. Объем агара для по­лучения оптимального слоя на фотопластине равен 10 мл. Этот объем помещается в пробирку, которую выдерживают в водя­ной бане до выравнивания температуры (около 7 мин), после чего в него вносят расчетный объем антисыворотки в соответ­ствии с ее паспортными титрами. При титре коммерческой антисыворотки к IgG в РИД 1:16 объем раствора антисыворот­ки, который должен содержаться в 10 мл рабочей концентра­ции агара, – 10 : 16 = 0,63 мл, т.е. этот объем антисыворотки надо смешать с 9,37 мл 1,5% агара. В такой же последователь­ности готовится агар для определения IgA и IgM.

Для получения раствора антисыворотки в ампулу с высу­шенной антисывороткой вносят 1 мл воды; полное растворе­ние без помешивания должно произойти не более чем за 1 ч. В противном случае эта сыворотка не используется.

Стекло с застывшим агаром кладут на трафарет – план рас­положения лунок. В этих местах агар продавливают трубкой-пробойником с тонкой стенкой и внутренним диаметром 2– 2,5 мм, агар отсасывают водоструйным насосом. В лунки вно­сят образцы сывороток и четыре разведения стандарта – в 2, 4, 8 и 16 раз. Стекла инкубируют во влажной камере при комнатной температуре 18–20 ч.

Метод основан на формировании в агаре с антисыворот­кой, преципитата вокруг лунки, в которую вносят объект исследования (сыворотку крови или другую биологическую жидкость организма), содержащий иммуноглобулин. Размер коль­ца преципитации зависит от концентрации антигена (имму­ноглобулина).

Учет результатов: измеряют диаметры колец вокруг каждой лунки. Расчет концентрации проводится по калибровочной Кривой, которую строят на полулогарифмической бумаге. Для этого по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципи­тации проб стандарта, а по оси ординат – количество имму­ноглобулина в данном разведении стандарта (в мг%, МЕ, г/л). Из точки абсциссы, соответствующей каждому диаметру коль­ца, восстанавливают перпендикуляры до пересечения с уров­нем, соответствующим количеству иммуноглобулина в данном разведении стандарта. Точки пересечения соединяют между собой, получая графическое изображение зависимости кон­центрации иммуноглобулина и диаметра кольца преципита­ции.

Для определения концентрации иммуноглобулина в иссле­дуемом образце на оси абсцисс отмечают диаметр кольца пре­ципитации испытуемой сыворотки, восстанавливают перпен­дикуляр до пересечения с калибровочной кривой, точку пере­сечения проецируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина.

16.2.2.3. Техника проведения реакции пассивной гемагглютинации для определения противобактериальных антител

В настоящее время определение антител к антигенам золо­тистого стафилококка, протеев, клебсиелл, синегнойной и ки­шечной палочек, стрептококка, пневмококка проводится с по­мощью стандартных эритроцитарных диагностикумов.

Для разведения диагностикума и сывороток используют изотонический раствор хлорида натрия с формалином. Для получения нужной концентрации вносят 40 % раствор форма­лина в 0,9 % раствор №С1 в соотношении 1 : 100. Хранят в холодильнике.

Подготовка сывороток: перед ^проведением исследования все сыворотки прогревают при 56 °С в течение 30 мин.

Подготовка диагностикумов: рабочее разведение получают, смешивая 1 мл диагностикума и 5 мл изотонического раствора хлорида натрия с 1 % формалина. Необходимое количество диагностикума рассчитывается в зависимости от количества исследуемых сывороток и занятых лунок. Например, при исследовании 5 сывороток будет задействовано 12 лунок, в каж­дую из которых надо внести по 30 мкл разведенного диагнос-тикума, т.е. 1,8 мл. Для этого смешать 300 мкл (0,3 мл) кон­центрированного диагностикума и 1500 мкл (1,5 мл) изотони­ческого раствора хлорида натрия с 1 % формалина.

Постановка РПГА микрометодом: в первые лунки горизон­тальных рядов 96-луночного планшета внести по 90 мкл (0,09 мл) изотонического раствора хлорида натрия с формали­ном, в остальные – по 50 мкл (0,05 мл). В первые лунки внести по 10 мкл (0,01 мл) прогретых исследуемых сывороток. Дву­кратные разведения удобно готовить с помощью 8-канальной пипетки, перенося в последующие лунки по 50 мкл (0,05 мл). Последние лунки остаются свободными от сыворотки – кон­троль диагностикума. Во все лунки внести по 30 мкл диагнос­тикума в рабочем разведении.

Учет реакции проводится на следующий день после инку­бации при комнатной температуре. Титром считается разведе­ние в последней лунке, где есть агглютинация эритроцитов (осадок в виде колечка с неровными краями). При этом в контрольных лунках должен образоваться плотный ровный оса­док – "пуговка".

Полученные разведения сыворотки соответствуют титрам: 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120, 1/10240.

У здоровых людей уровень антител к антигенам условно-па­тогенной микрофлоры в сыворотке крови колеблется в диапа­зоне, соответствующем титрам от 0 до 1:80. Исключение со­ставляют антитела к золотистому стафилококку (до 1:320), носительство которого встречается наиболее часто.

16.2.2.4. Микрометод определения активности компонентов комплемента

Постановка реакции. Во все лунки 6 вертикальных рядов 96-луночной панели (А–Н) вносят по 25 мкл (0,025 мл) рабо­чего раствора буфера РРБ (приготовление описано в разделе 16.4). В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл иссле­дуемой сыворотки, делают двукратные разведения (в ряду А– Н). В результате получают:

  • в лунке А разведение 1:2,
  • в лунке В – 1:4,
  • в лунке С – 1:8,
  • в лунке D – 1:16,
  • в лунке Е – 1:32,
  • в лунке F – 1:64,
  • в лунке G – 1:128,
  • в лунке Н – 1:256.

Во все лунки одного вертикального ряда от А до Н вносят по 5 мкл соответствующего реагента: С1 – в ряд N° 1; С2 – в ряд № 2; С3– в ряд № 3 и т.д.

В лунки ряда № 6 (определение общей активности компле­мента) вносят по 5 мкл РРБ. После этого во все лунки всех 6 рядов вносят по 20 мкл ЕА-комплекса, т.е. сенсибилизирован­ных эритроцитов в концентрации 109 кл/мл.

Инкубация продолжается 1 ч при 37°С, затем – не менее 30 мин в холодильнике для полного оседания эритроцитов. Результаты оценивают визуально по последней лунке, где про­изошел полный гемолиз. Нормальные показатели: для общей активности – 1:16 – 1:64 (гемолиз в лунках D – F).

Для компонентов комплемента – 1:32 – 1:128 (гемолиз в лунках Е – G).

При недостаточности какого-либо компонента комплемента отмечается снижение общей комплементарной активности.

16.2.3. Оценка интерферонового статуса

По значимости система интерферонов приближается к сис­теме иммунитета, а по универсальности даже превосходит ее, что послужило основанием для предложения интегрального понятия "интерфероновый статус" (ИФ-статус). В это понятие входят параметры, определяющие состояние интерферонов (ИФ): содержание различных видов ИФ в циркулирующей крови, способность лейкоцитов вырабатывать ИФ-α и ИФ-γ при соответствующей индукции in vitro и ряд других показате­лей, из которых некоторые еще разрабатываются. Способность лейкоцитов продуцировать ИФ-α при строго стандартизован­ных условиях вирусной индукции называется интерфероновой реакцией лейкоцитов (ИРЛ) и используется как показатель неспецифической реактивности организма.

Наиболее простым и доступным суммарным показателем слу­жит количественное определение интерферона (ИФ) в сыворотке крови (сывороточный, или циркулирующий, ИФ). Другими по­казателями ИФ-статуса служат определение уровня продукции ИФ-α и ИФ-γ лейкоцитами, индуцированными in vitro.

В норме ИФ-статус характеризуется, как правило, низкими концентрациями ИФ в сыворотке крови и выраженной спо­собностью лейкоцитов продуцировать этот полипептид в ответ на адекватную индукцию. У 90 % здоровых людей уровень ИФ не превышает 4 МЕ/мл. В ответ на индукцию у 80 % здоровых лиц уровень ИФ-α и ИФ-γ колеблется между 64 и 1280 МЕ/мл.

Индивидуальный уровень ИФ в здоровом организме генети­чески детерминирован, и поэтому способность продуцировать ИФ широко варьирует. Диапазон колебаний титров ИФ-α у здоровых людей зарегистрирован в пределах 1–2500 МЕ/мл в зависимости от использованного индуктора. Заметно угнетают выработку ИФ охлаждение, понижение, питания, ионизи­рующее излучение, действие иммунодепрессантов, стероидных гормонов. Повышение температуры тела на высоте заболе­вания сопровождается увеличением уровня циркулирующего ИФ.

При патологии нарушения интерфероногенеза могут быть первичными и вторичными (приобретенными). Острые вирус­ные инфекции в большинстве случаев сопровождаются по­вышением уровня ИФ в первые часы заболевания. Параллель­но происходит активация ИФ-зависимых внутриклеточных противовирусных механизмов и иммунных реакций. Отсрочен­ная и сниженная продукция эндогенного ИФ может вести к хронизации заболевания или злокачественному прогрессированию вирусной инфекции.

Иммунный ИФ является лимфокином с выраженными иммуномодулирующими свойствами и способностью угнетать пролиферацию клеток. При нормальном функционировании систем иммунитета и интерферона существует равновесие меж­ду функциональной активностью лимфоцитов, выраженной их пролиферативной активностью, и продукцией ИФ. В табл. 16.7 представлены варианты изменения ИФ-статуса в норме и при некоторых видах патологии.

Таблица 16.7. Интерфероновый статус в норме и при патологии

Группы обследованных

Возможные варианты ИФ-статуса

Характер изменений ИФ-статуса

сыворо­точный

α

γ

Здоровые люди

N

N

N

Все показатели в пре­делах нормы (конт­роль)

Стрессы, острые вирус­ные инфекции, аллер­гические заболевания

Разная степень повы­шения сывороточного ИФ в сочетании с по­давлением α- и γ-звена

Хронические вирусные инфекции (герпес, гепа­тит, рассеянный скле­роз и т.д.)

N

Глубокое подавление всех показателей

Аутоиммунные болезни (СКВ, ревматоидный артрит и т.д.)

N или ↑

N

Подавление α-звена

Острый лимфолейкоз, опухоли, проказа

N или ↑

N

Подавление γ-звена

Показаниями к исследованию ИФ-статуса являются острые и хронические вирусные инфекции, аллергические и аутоим­мунные заболевания, рецидивирующие оппортунистические инфекции, врожденные и приобретенные дефекты системы ИФ, клинические испытания препаратов ИФ, индукторов ИФ и иммуномодуляторов.

Реакция ИФ-статуса может быть осуществлена макро- или микрометодом. Различия касаются только объемов вносимых реагентов.

1-я ступень – количественная, позволяет определить коли­чественные параметры физиологического или патологического ИФ ответа in vitro и ex vivo и включает определение:

  • количества циркулирующего в крови ИФ;
  • уровня продукции ИФ-α лейкоцитами при его индукции вирусными индукторами in vitro;
  • уровня продукции ИФ-γ при его индукции митогенами in vitro;
  • уровня продукции спонтанного ИФ (дополнительный тест).

2-я ступень определения ИФ-статуса – качественная, вклю­чает характеристику некоторых показателей 1-й ступени и тре­бует постановки дополнительных тестов для определения:

  • типа (класса) циркулирующего ИФ;
  • кислоте-лабильности циркулирующего ИФ;
  • кислотолабильности индуцированного in vitro ИФ-α;
  • типа спонтанно продуцируемого in vitro ИФ;
  • кислотолабильности спонтанного ИФ.

Совокупность тестов 1-й и 2-й ступеней позволяет выявить ИФ-избыточное и ИФ-дефицитное состояние, глубину дефек­тов ИФ-системы при различных патологических состояниях.

Постановка тестов 1-й ступени должна проводиться в день забора крови.

16.2.3.1. Техника определения ИФ-статуса

Тесты 1-й ступени. Кровь в объеме 0,5–1,0 мл помещают в стерильную центрифужную или пластмассовую одноразовую пробирку, содержащую 10–20 ЕД гепарина. Для правильной оценки результатов одновременно подсчитывают лейкоциты в 1 мкл крови (в камере Горяева) или выписывают этот показа­тель из общего анализа крови, выполненного в день исследо­вания или накануне.

Макрометод (в объеме 1 мл). В три центрифужные пробирки вносят по 800 мкл среды RPMI-1640 с глутамином (0,3 мг/мл) и гентамицином (0,08 мг/мл), 100 мкл цельной гепаринизиро-ванной крови и 100 мкл вируса болезни Ньюкасл (ВБН), фитогемагглютинин (ФГА) и среды RPMI-1640 для индукции ИФ-α, ИФ-γ и спонтанного соответственно. Конечное разве­дение крови 1:10, концентрация ВБН – 1 ЦПЕ/мл, концент­рация ФГА – 5 мкг/мл. Содержимое пробирок хорошо пере­мешивают и помещают в термостат при 37°С на 24 ч. Общий расход крови 300 мкл. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточного ИФ.

После инкубации опытных пробирок, не взбалтывая, отби­рают пробы и переносят в стерильные флаконы. В пробу с ВБН вносят 1 N НС1 до рН 2,0 для инактивации вируса, которую проводят 72 ч при 4°С. Перед титрованием в пробу с инактивированным ВБН вносят 1 N NaOH до рН 7,0. При необходимости хранения проб их можно замораживать при –70 °С.

Микрометод (в объеме 200 мкл). Тесты 1-й ступени опре­деления ИФ-статуса ставятся в стерильных 96-луночных круглодонных планшетах в трех повторах (9 лунок на каждую пробу). В каждую лунку, содержащую 160 мкл среды RPMI-1640 (с глутамином и антибиотиками), вносят: в первые три – по 20 мкл ВБН; во вторые три – по 20 мкл ФГА; в третьи – по 20 мкл среды RPMI-1640 и во все 9 лунок – по 20 мкл цельной крови. Содержимое лунок перемешивают, планшеты закрывают крышкой и инкубируют при 37 °С 24 ч в атмосфере 5 % СО2. Общий расход крови на одно тестирование – 180 мкл. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточ­ного ИФ при 800–1000 об./мин 10–15 мин.

Определение активности ИФ. Титрование ИФ проводят в 96-луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культу­рой фибробластов человека М19 в среде Игла с 10 % бычьей сыворотки (105 кл/мл). Культуру в объеме 200 мкл на 1 лунку выращивают 24–48 ч (до образования сплошного монослоя) при 37 °С в атмосфере 3 % СО2.

В качестве тест-вируса используют вирус везикулярного сто­матита (ВВС, штат Индиана). За единицу активности ИФ принимают величину, обратную его разведению, задерживаю­щую деструкцию монослоя на 50 % (МЕ/мл). В каждое титро­вание берут пробу референс-ИФ с известной активностью, выраженной в ME на мл.

Пересчет ед/мл в МЕ/мл проводится по формуле:

где Ао – активность исследуемого образца ИФ, МЕ; Ар – ак­тивность референс-ИФ, МЕ; Т0 – титр исследуемого образца ИФ в опыте, ЕД/мл; Тр – титр референс-ИФ в опыте, ЕД/мл.

При некоторых патологических состояниях количество лей­коцитов крови значительно увеличивается (или снижается), что при сохранении или снижении интерферониндуцирующей способности лейкоцитов может создать искаженное представ­ление о повышенной или нормальной функциональной актив­ности а- и у-звеньев системы ИФ. Поэтому для правильной оценки показателей ИФ-статуса рекомендуется производить пересчет единиц активности ИФ в мл, определенных по тестам 1-й ступени, в единицы активности на 1000 лейкоцитов. Тогда физиологические значения продукции ИФ-α и ИФ-γ будут иметь следующие средние значения:

ИФ-α - 0,7 - 1,4 МЕ/тыс.                  (1),

ИФ-γ - 0,14 - 0,28 МЕ/тыс.               (2),

где (1) и (2) – частное от деления единиц активности ИФ-α и -γ в 1 мл 10-кратно разведенной крови на число лейкоцитов в нем (т.е. в 100 мкл цельной крови) при максимальной норме 9-103 мкл.

Тесты 2-й ступени. Определение типа сывороточного и спон­танно индуцированного ИФ. Тест проводится с помощью анти­сывороток против ИФ-α и ИФ-γ. Выбор единиц активности антисыворотки зависит от титров сывороточного или спонтан­ного ИФ, определенного по тестам 1-й ступени. Антисыворот­ка в рабочем разведении должна иметь активность, нейтрали­зующую 50–100 МЕ/мл референс-ИФ человека соответствую­щего типа. При необходимости предварительно осуществляет­ся титрование антисыворотки.

В 3 пробирки, содержащие по 200–250 мкл референс-ИФ человека, проб сывороточного и спонтанного ИФ, вносят рав­ное количество (200–250 мкл) антисыворотки, нейтрализую­щей 50–100 МЕ/мл референс-ИФ-α. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 1 ч при 37 °С или 24 ч при 4 °С.

На монослой диплоидной культуры М19, выращенный в плоскодонных 96-луночных планшетах, после удаления культуральной жидкости вносят по 100 мкл каждой из исследуемых смесей проб и референс-ИФ-α (после контакта с антисыворот­кой). Каждую пробу вносят в 3 лунки (3 повтора). Параллельно в 3 повторах ставят контроли: контроль пробы, контроль ви­руса и контроль клеток.

Планшеты инкубируют 24 ч при 37°С в атмосфере 3–5 % СО2. После инкубации из лунок удаляют пробы, монослой отмывают средой Игла и заражают (кроме контроля клеток и контроля антисыворотки) тест-вирусом ВВС в дозе, вызываю­щей его 100 % деструкцию. Вирус инкубируют в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 3 % С02. Полная задержка цитопати-ческого действия вируса в контролях проб и референс-контролях и 100 % деструкция монослоя в опытных и референс-пробах с антисывороткой однозначно указывают на принадлеж­ность исследованного ИФ к ИФ-α. Два контроля антисыво­ротки вводят для выявления токсического действия антисыво­ротки на культуру (без вируса) и исключения возможности задержки цитопатического действия вируса антисывороткой (с вирусом).

Титрование на принадлежность к ИФ-β и ИФ-γ проводится аналогичным образом.

Определение кислотолабильности сывороточного и спонтанно­го ИФ. Пробы сывороточного и спонтанного ИФ обрабатывают 1 N НС1 (рН 2,0) в течение 24 ч при 4°С. По окончании инкубации рН проб доводят до 7,0 1 N NaOH. В контролях используют эквивалентное количество фосфатного буфера. Пробы титруют в диплоидной культуре М19 для определения активности ИФ, как это было описано выше.

Наличие защитного действия ИФ в разведениях контроль­ных проб и полное его отсутствие в опытных пробах указы­вают на кислотостабильность сывороточного или спонтанно­го ИФ. Тестирование ИФ-α и его кислотолабильности свиде­тельствуют об аномальности сывороточного (или спонтанно­го) ИФ.

Определение кислотолабильности ИФ-α. Для выявления кис­лотолабильности ИФ-α, индуцированного in vitro, его индук­цию проводят с помощью полиинозина–поли(И), полицитозина–поли(Ц). В 6 лунок вносят по 160 мкл среды RPMI-1640, содержащей, кроме глутамата и гентамицина, ДЭАЭ-декстран в концентрации 250 мкг/мл. В лунки добавляют по 20 мкл поли(И) и поли(Ц) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Во все лунки вносят по 20 мкл цельной крови. Содержимое пере­мешивают. Планшеты инкубируют при 37 °С 24 ч в атмосфе­ре 5 % СO2. После инкубации отбирают пробу ИФ-α, которую разделяют на две части. Одну часть пробы ИФ-α обрабатывают 1 N НС1 до рН 2,0 в течение 24 ч при 4 °С. Перед титрованием рН этой пробы доводят до 7,0 с помощью 1 N NaOH. После титрования обеих проб (обработанной и необработанной) срав­нивают активность ИФ-α.

Наличие активности ИФ в необработанной части пробы и его полное отсутствие в обработанной части указывают на кислотолабильность ИФ-α.

Этот тест проводят при низкой продукции ИФ-α или пол­ном его отсутствии при индукции с помощью ВБН по тестам 1-й ступени определения ИФ-статуса.

Преимущество этой методики оценки ИФ-статуса состоит в использовании малых объемов крови, простоте, легкости выполнения. Выделения лейкоцитов или лимфоцитов не тре­буется. Индукция ИФ в цельной крови наиболее приближена к условиям in vivo.

 

[1] Приготовление красителя: 1 г метилового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют и хранят в холодильнике. Недостаточно очищенный краситель имеет фиолетовый цвет, от которого можно избавиться, экстрагируя примеси хлороформом. Для этого смешать водный раствор красителя с равным объемом хлороформа и после рас­слоения аккуратно слить водную часть. Повторить 2—3 раза до получения чистого зеленого цвета красителя. Процедуру проводить в вытяжном шкафу.