Вирулентность – биологическое свойство микроба, харак­теризующее степень его патогенности в момент исследования. В отличие от патогенности вирулентность является не видо­вым, а индивидуальным признаком микроба, который может усиливаться или ослабляться вплоть до полного исчезновения под влиянием различных факторов внешней среды.

Для характеристики вирулентности пользуются количест­венными показателями, определяющими способность иссле­дуемой микробной культуры вызывать гибель искусственно зараженных ею подопытных животных. Изучение вирулентнос­ти бывает сопряжено с рядом трудностей, так как она опреде­ляется не только комплексом культурально-морфологических, токсигенных и биологических свойств микроба, но и резис­тентностью микроорганизма, подверженной большим колеба­ниям в связи с видом, возрастом животных, режимом их пи­тания, температурой внешней среды, а также способом зара­жения, принятым в опыте. Поэтому при установлении виру­лентности микроба очень важно вести исследование, точно соблюдая стандартность всех условий опыта.

Для определения вирулентности микробных культур чаще всего используют белых мышей. В том случае, когда белые мыши невосприимчивы к исследуемому возбудителю заболевания, пользуются другими видами животных: крысами, морски­ми свинками или кроликами.

Для определения вирулентности применяют молодую куль­туру микроба, так как старые культуры содержат большое ко­личество мертвых клеток.

Культуру микроба для заражения выращивают на агаре или другой плотной питательной среде, так как бульон, представляя собой сложный белковый субстрат, не безразличен для живот­ного организма и может извращать результаты опыта. Иссле­дуемую культуру микроба, выращенную на скошенном мясопептонном агаре, смывают изотоническим раствором хлорида натрия и стандартизуют по стандарту McFarland так, чтобы в 1 мл этого раствора содержалось определенное количество микробных тел. В зависимости от вида культуры, патогенности ее для животных, взятых в опыт, а также от цели и задач исследования количество микробных тел, содержащееся в 1 мл взвеси, может колебаться от единиц до миллиардов. В тех случаях, когда по каким-либо причинам получить агаровую культуру невозможно, пользуются суточной бульонной культу­рой. Для определения Dlm (Dosis letalis minima) из бульонной культуры готовят ряд последовательных десятикратных разве­дений: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10 000; 1:100 000 и т.д.

Исследуемую взвесь бактерий вводят различными способа­ми: внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкож­но, интраназально – в зависимости от целей и задач исследо­вания.

Отстандартизованную взвесь микробов в изотоническом растворе хлорида натрия, а также разведения бульонной куль­туры готовят с таким расчетом, чтобы различные дозы микро­ба, используемые в опыте, содержались в одинаковых объемах жидкости.

Каждую дозу культуры вводят одновременно нескольким животным. При определении минимальной смертельной дозы учитывают и отмечают в протоколе опыта следующие данные:

  • количество микробов, введенных в организм животного;
  • способ их введения;
  • массу тела зараженного животного;
  • сроки гибели после заражения.

Степень вирулентности чаще всего характеризуют тремя следующими показателями:

  • минимальная смертельная доза Dlm (Dosis letalis minima), т.е. наименьшая доза микробов, которая при определенном способе заражения, в определенных условиях опыта вызывает гибель около 95 % подопытных животных;
  • наименьшая безусловно смертельная доза Dcl (Dosis certe letalis) – наименьшая доза микробов, являющаяся смертельной для всех 100 % животных, взятых в опыт;

средняя смертельная доза микробов LD50 (Dosis letalis 50 %) – доза микробов, вызывающая гибель 50 % зараженных животных.

Показатель LD50 позволяет получить более достоверные ре­зультаты, и поэтому он чаще других используется в практике экспериментальных исследований.

В отличие от Dlm и Dcl определяемая непосредственно по результатам опыта LD50 вычисляется путем довольно сложных математических расчетов. Более прост метод Кербера, в кото­ром простота расчета удачно сочетается с достаточно высокой точностью получаемых результатов.

Метод Кербера предусматривает:

  • введение в опыт одинакового количества животных на каж­дую испытуемую дозу микробов;
  • постоянство величины отношений каждой последующей до­зы микробов к предыдущей.

При этом расчет DLi50 ведется по следующей формуле:

lgDLi50 = lgDn - δ (∑Li = 0,5);

LD50 = anti lgDLi50,

где Dn – максимальная доза микробов, взятая в опыт; δ – логарифм отношения каждой последующей дозы к предыду­щей, т.е. логарифм кратности испытанных разведений; Li – отношение числа погибших к общему числу животных, кото­рым введена данная доза; ∑Li – сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Пример. В табл. 12.4 приведены данные по установлению вирулентности культуры риккетсий цуцугамуши. В опыте ис­пользовано пять различных доз культуры, взятых в разведении 10-3, 10-4, 10-7. Каждая испытуемая доза вводилась 6 подо­пытным мышам.

Таблица 12.4. Определение вирулентности риккетсий цуцугамуши

Доза (разведение) исходной взвеси

Число погибших животных

Отношение числа по­гибших к общему числу животных, которым вве­дена данная доза (Li)

10-3

6

1

10-4

6

1

10-5

6

1

10-6

4

0,67

10-7

2

∑Li -4

Таким образом, наибольшая из испытуемых доз в этом опыте составляет 10-3, следовательно, lgDn = –3.

Кратность разведений равна 10, отсюда δ = lg10 = 1,0. Наконец, сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз, ∑Li = 4,00.

Тогда по формуле:

lgLD50 = lgDn - δ (∑hi - 0,5) = -3 - 1,0 ×(4,0 - 5,0) = -6,5;

LD50 anti lg (-6,5) = 1/3 160 000 мл.

Следовательно, в 1 мл исходной микробной взвеси содержится 3 160 000 LD50.