В бактериологической лаборатории для проведения исследований, хранения реактивов, взятия и транспортирования биологических материалов и других задач используют самую разнообразную посуду. Она может быть изготовлена как из стекла, так и из различных полимерных материалов. Все чаще вместо традиционной стеклянной посуды используют пластиковую посуду промышленного изготовления (как правило, однократного применения и в индивидуальной упаковке).
Мытье и обработка лабораторной посуды. Посуда для бактериологических исследований должна быть чистой и в большинстве случаев стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению искаженных или неправильных результатов. Пластиковая посуда однократного применения, как правило, поступает в лабораторию чистой, в индивидуальной упаковке и в большинстве случаев в стерильном виде. Следует ориентироваться на применение такой посуды для ежедневных работ. После использования и дезинфекции пластиковая посуда однократного применения подлежит утилизации.
Для мытья лабораторной посуды многократного применения из стекла и пластмасс в микробиологических лабораториях отводят отдельное помещение – моечную комнату или специальное рабочее место, которое оборудуется большой раковиной с подводом горячей и холодной воды, нагревательными приборами – газовой или электрической плитой. В моечной комнате необходимо иметь кастрюли, тазы, ведра, ерши, щетки и доски (или пластины из полимерных материалов) с колышками для сушки чистой посуды. На дно раковины кладут густую металлическую или инертную полимерную сетку, чтобы предупредить засорение канализации частицами агара, ватой, бумагой, попадающими в воду при мытье посуды. Для мытья посуды может быть использована специальная моечная машина (рис. 5.1), которая также размещается в моечной комнате. Мытье лабораторной посуды в такой машине осуществляется в соответствии с инструкцией производителя используемой моечной машины.
В процессе мытья на посуду воздействуют химическими и механическими факторами. К числу последних относится удаление загрязнений с помощью щеток и ершей. При отсутствии ершей или невозможности их использования, например в случае несоответствия ерша размеру сосуда, посуду моют с помощью мелко нарезанных кусочков бумаги. При этом загрязнение, имеющееся на внутренних стенках, удаляется механически. Наилучшие результаты мытья посуды отмечаются в тех случаях, когда воздействие механических факторов сочетается с действием химических веществ. Поэтому ерши, которыми моют посуду, предварительно погружают в соду, полужидкое мыло, мыльный раствор или раствор моющего средства. Для мытья посуды не следует применять абразивные материалы, царапающие стекло, так как поцарапанное стекло утрачивает присущую ему прочность и во время стерилизации на месте едва заметных изъянов – царапин – могут образоваться трещины, посуда может разрушиться. Для мытья посуды необходимо применять нейтральные моющие средства, лучше всего жидкое моющее средство "Прогресс". Можно также использовать нейтральные синтетические моющие средства, не содержащие биодобавок (например, "Лотос", "Кристалл", "Эра").
Надписи, сделанные на стекле восковым карандашом или маркером, удаляются щеткой либо кусочком влажной марли с меловым порошком или содой.
Для устранения налета белого цвета, нередко появляющегося на стекле, посуду помещают на 30–40 мин в 5–10 % раствор хлористоводородной кислоты.
Сильно загрязненную стеклянную посуду со следами жировых отложений обрабатывают в хромовой смеси. Хромовая смесь, будучи сильным окислителем, разрушает органические вещества с образованием растворимых в воде или газообразных продуктов. Перед использованием хромовую смесь подогревают до температуры 45–50 °С, а затем заливают ею загрязненную посуду.
Мытье новой лабораторной посуды из стекла. Новую посуду из стекла перед использованием моют мыльной водой или 0,5 % раствором моющего средства. После этого посуду ополаскивают проточной водопроводной водой и кипятят в 1– 2 % растворе соляной кислоты в течение 15–20 мин. После кипячения в растворе кислоты посуду прополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой.
При мытье стеклянной посуды, предназначенной для постановки серологических реакций, кислоты и щелочи использовать не следует, так как даже следовые количества этих веществ, оставшиеся на стенках, могут исказить результат реакции. Такую посуду моют горячей водой, кладут на сетки, чтобы из нее стекла вода, затем несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу.
Мытье и обработка посуды, бывшей в употреблении. Загрязненная посуда, а также посуда, в которой содержался инфицированный материал, поступает в мойку после предварительной дезинфекции, гарантирующей гибель находящихся в ней патогенных микроорганизмов. Загрязненная посуда помещается в специальные биксы или ведра с крышками, после чего автоклавируется при 126 °С в течение 60 мин или при 132 °С в течение 20 мин. Нельзя освобождать от содержимого использованную посуду без предварительного обеззараживания. В исключительных случаях допускается обеззараживание материалов кипячением в 2 % растворе пищевой соды или 0,5 % растворе нейтрального моющего средства в течение 60 мин с момента закипания. Кипячение в этом случае должно происходить в закрытой емкости с полным погружением в раствор. Отработанные пипетки обеззараживают в высоком сосуде с полным погружением в дезинфицирующий раствор. Продолжительность обеззараживания зависит от типа применяемого дезсредства.
При выборе методов обеззараживания следует руководствоваться СП 1.2.731–99 "Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности и гельминтами". Допускаются также к использованию новые дезинфицирующие средства, получившие разрешение Министерства здравоохранения РФ на применение. В этих случаях следует руководствоваться рекомендациями производителя.
Перед мытьем из пробирок, чашек, матрацев и т.п. обеззараженные материалы по возможности выливают в канализацию. Для облегчения дальнейшего процесса мытья после автоклавирования обеззараженную посуду замачивают в 1 % растворе моющего средства "Прогресс" в горячей воде на 1–2 ч, тщательно промывают при помощи щеток и ершей и ополаскивают в проточной водопроводной воде (8–10 раз при использовании моющего средства "Прогресс" и до 15 раз при использовании других средств). Не слишком загрязненную посуду моют ершом в горячей воде с мылом или содой. Посуду со следами агара, желатина или иных компонентов питательных сред за сутки перед мытьем можно залить 2–5 % раствором едкого натра или едкого кали. Очень загрязненную жирную посуду, не поддающуюся мытью обычным способом, следует залить на 30–40 мин хромовой смесью, а затем обильно промыть проточной водопроводной водой и ополоснуть дистиллированной водой (3–4 раза). Затем посуду сушат при комнатной температуре или в сушильном шкафу.
Мытье градуированной посуды. Градуированная посуда должна быть абсолютно чистой и хорошо обезжиренной. На стенках плохо обезжиренной посуды при вливании в нее жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, которая указана на шкале деления. Это особенно важно при мытье градуированных пипеток объемом 1–2 мл и менее.
Мытье новых, не бывших в употреблении, градуированных пипеток нужно проводить следующим образом. С помощью резинового баллона, надетого на пипетку, всасывают в нее горячую мыльную воду, а затем помещают пипетку целиком в сосуд с таким же мыльным раствором. Чтобы вода из пипеток не вытекала, уровень жидкости в сосуде должен соответствовать высоте пипеток. Выдержав пипетки в мыльном растворе в течение 20–30 мин, их следует прополоснуть проточной водопроводной водой и перенести в сосуд с 1–2 % раствором соляной кислоты. Сосуд затем нужно поставить на слабый нагрев и постепенно довести раствор до кипения. Затем пипетки обрабатывают аналогично остальной стеклянной посуде.
Перед мытьем бывших в употреблении обеззараженных пипеток из них удаляют "ватики" (внутреннюю поверхность пипеток можно протереть при помощи плотно накрученного на конец тонкой упругой проволоки кусочка ваты или марли в виде оливы, закупорившийся канал пипетки прочищают мандреном от тонких игл шприцев или тонкой упругой проволокой), промывают теплой водопроводной водой под давлением и кипятят в 1% растворе бикарбоната натрия в течение 45 мин, многократно промывают водопроводной, затем дистиллированной водой. После этого пипетки высушивают, вставляют новые "ватики" и, поместив в оберточную бумагу или пенал, стерилизуют в суховоздушном стерилизаторе.
Сильно загрязненные пипетки также очищают вначале ершом с раствором моющего средства или соды, а затем погружают в хромовую смесь, налитую в ванночку или высокий сосуд. Объем смеси по высоте должен соответствовать длине обрабатываемых пипеток. В хромовой смеси пипетки выдерживают 20–30 мин, затем в течение нескольких минут промывают проточной и дважды ополаскивают дистиллированной водой.
Для наиболее ответственных работ можно также использовать импортные градуированные пипетки однократного применения из пластмасс. Такие пипетки, как правило, упакованы индивидуально и уже простерилизованы производителем при помощи ионизирующего излучения.
Мытье предметных и покровных стекол. Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренную поверхность стекла, растекается равномерно. Если же стекло недостаточно обезжирено, то капля распадается на множество мелких капель. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи.
Покровные и предметные стекла, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после ополаскивания заливают смесью Никифорова. Если стекла, вынутые через 2–3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, то их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2–5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый нагрев и кипятят в течение 20–30 мин после закипания. Затем стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опускают на 10–15 мин в 5–10 % раствор хлористоводородной кислоты и затем промывают проточной водой.
Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении и загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатывают следующим образом:
- опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой;
- заливают стекла 5 % раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкий натр или едкое кали), ставят на слабый нагрев и кипятят в течение 30–40 мин.
Силиконирование лабораторной посуды. Силиконирование посуды, пробок и т.п. осуществляют с целью придания поверхности посуды водоотталкивающих (парафиноподобных) свойств. Тщательно вымытую и обезжиренную посуду высушивают и при комнатной температуре заливают на несколько Минут раствором силиконовой эмульсии (например, КЭ-10-16, ПМС-200А или ПМС-400, с массовой долей силикона 0,05– 0,5 %). После этого жидкость сливают (силиконовую эмульсию можно использовать многократно) и подсушивают посуду в речение 20–30 мин при комнатной температуре. При этом на поверхности стекла образуется тончайшая органосиликоновая Пленка с хорошими гидрофобными свойствами. Обработанную таким образом посуду помещают на 1,5 ч в сушильный шкаф при температуре 120–140 °С. Затем промывают посуду дистиллированной водой и сушат в течение 1,5 ч при указанных выше условиях. После этого посуда готова к использованию. Пленка не смывается водой и не разрушается кислотами. Для ее удаления необходимо в течение 2 ч кипятить посуду в 10 % растворе щелочи. Качество силиконирования во многом зависит от качества мытья посуды и ее обезжиривания. Работу по силиконированию посуды проводят в лабораторном вытяжном шкафу.
Обработка резиновых пробок. Новые пробки кипятят 30 мин в 2 % растворе бикарбоната натрия, многократно промывают горячей проточной водопроводной водой (кипячение и промывание проводят дважды). Затем пробки кипятят 30 мин в дистиллированной воде, промывают и высушивают.
Пробки, бывшие в употреблении, после кипячения в 2 % растворе бикарбоната натрия ополаскивают проточной водопроводной водой, кипятят 30 мин в дистиллированной воде, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают.
Резиновые пробки для флаконов заворачивают в крафт-бумагу (или плотную упаковочную бумагу) либо фольгу и стерилизуют автоклавированием.
Проверка качества мытья лабораторной посуды. Контроль чистоты мытья посуды осуществляют путем осмотра и выборочного проведения тестов. Стекло вымытой и высушенной посуды должно быть прозрачным, без подтеков, пятен и посторонних включений. Перед сушкой для проверки чистоты посуды ее ополаскивают водой. Вода должна стекать, оставляя на поверхности стекла равномерную пленку. Плохо обезжиренную посуду обязательно моют повторно. Наличие остаточных жировых загрязнений может быть определено при помощи реактива, содержащего судан III (в 70 мл 90 % этилового спирта, нагретого до 60 °С, растворяют по 0,2 г измельченной краски судан III и метиленового синего, затем добавляют 10 мл 20–25 % раствора аммиака, 20 мл дистиллированной воды и взбалтывают; такой раствор пригоден для использования в течение 6 мес.). Для этого внутреннюю поверхность вымытой и подсушенной посуды смачивают 3–5 мл красящего раствора, распределяют его по исследуемой поверхности в течение 10 с, затем быстро смывают обильной струей воды. На внутренней поверхности посуды не должно оставаться желтых пятен и подтеков.
При обработке и мытье стеклянной посуды используются моющие и дезинфицирующие средства, содержащие вещества, которые могут повлиять на рост микроорганизмов, поэтому контроль на наличие остаточных количеств моющих средств также имеет большое значение. Качество удаления моющих и моюще-дезинфицирующих средств оценивают по величине рН. Для этих целей используют рН-индикаторную бумагу с шагом измерительного диапазона не более 0,3 единицы. Предварительно определяют рН воды, применяемой для ополаскивания посуды на конечном этапе. Контрольные измерения рН проводят путем прикладывания рН-индикаторной бумаги к поверхности вымытого мокрого стекла, прошедшего обработку. Для контроля произвольно выбирают 3–10 емкостей. Значение рН воды, полученное в результате контроля, должно соответствовать рН дистиллированной воды, применяемой для ополаскивания.
При использовании нового моющего средства методика проверки качества мытья посуды от моющих средств и подбор режима мытья посуды осуществляется в соответствии со стандартом ИСО 9998:1991Е.
Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре (холодная сушка) или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 80–105 °С. Для холодной сушки в лаборатории используются специальные доски из дерева или пластмассы с колышками, прикрепленными к ним под углом. Высушенную посуду просматривают на свет, поверхность стекла должна быть совершенно прозрачной, без матового налета и пятен.
Чисто вымытую и высушенную посуду, закрытую ватно-марлевыми (с бумажными колпачками или без них), резиновыми, силиконовыми пробками или металлическими крышками-колпачками, хранят в местах, надежно защищенных от пыли. Для этих целей лучше всего подходят шкафы с плотно закрывающимися дверцами, ящики столов. Для размещения чистой сухой посуды на полках шкафов можно использовать фанерные ящики или клееные коробки из плотного картона, внутрь которых следует положить фильтровальную бумагу. Посуду также следует укрыть фильтровальной бумагой от попадания пыли и грязи.
Стерилизация и подготовка лабораторной посуды к использованию. Лабораторную посуду (флаконы, пробирки, бутыли, колбы и т.п.) закрывают пробками, поверх которых надевают бумажные (или фольгированные) колпачки. Колпачки обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым кольцом. Перед стерилизацией чистую посуду при необходимости монтируют в крафт-бумагу (плотную оберточную бумагу). Чашки Петри и пипетки стерилизуют, завернув в оберточную или крафт-бумагу, либо в пеналах.
При выборе режима стерилизации специальной посуды и расходных материалов (флаконы с завинчивающимися пробками, металлические или силиконовые колпачки, выдерживающие автоклавирование, микробиологические пробки многократного применения и другие материалы) следует руководствоваться рекомендациями производителя.
Стерилизацию посуды осуществляют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 ч (или 180 °С в течение 60 мин) или текучим паром под давлением (1 атм) при температуре 121 °С в течение 30 мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу при отсутствии в автоклаве вакуумной сушки.
После стерилизации посуду хранят до использования в закрытом шкафу или ящиках с крышками не более 10 сут при ненарушенной упаковке или невскрытом пенале.
Контроль обсемененности лабораторной посуды для отбора проб. Цель – выборочный контроль качества подготовки посуды в отношении различных по устойчивости микроорганизмов, учитываемых при проведении анализа. При проведении контроля режимов суховоздушной стерилизации в полном объеме биологический, термический, химический) с рекомендуемой периодичностью контроль обсемененности стеклянных флаконов для отбора проб в зависимости от объема стерилизуемых партий проводят не реже 1 раза в квартал. Контролю подвергаются все емкости, используемые для отбора проб: стеклянные многоразового использования после стерилизации, а также пластиковые одноразового использования, поступающие в стерильном виде от производителя. Контролируется общая обсемененность (стерильность) посуды и наличие спор сульфитредуцирующих клостридий.
Условия проведения испытаний в значительной мере обусловливают качество данного вида контроля. В связи с этим его неотъемлемой частью является следующий комплекс мероприятий:
- анализ проводят в боксе для разливки сред или в посевных комнатах (боксах);
- непосредственно перед исследованием проводят дезинфекционную обработку помещения (мытье бокса). После дез-обработки включают дополнительно бактерицидные лампы на 1,5–2 ч;
- спецодежду для проведения анализа (халат, шапочку, четырехслойную марлевую маску) стерилизуют. Режим стерилизации спецодежды: автоклавирование при 120±1 °С в течение 45 мин или при 132±2 °С в течение 20 мин.
Перед входом в бокс сотрудник, проводящий испытания, тщательно моет руки теплой водой с мылом и щеткой, вытирает их стерильным полотенцем, надевает стерильный халат, шапочку, маску, надевает перчатки, обрабатывает их 70 % этиловым спиртом. При наличии ламинарного бокса исследование выполняют в спецодежде с использованием стерильных перчаток.
Во время испытаний обязательно проводят контроль воздуха на обсемененность микроорганизмами.
Для каждого вида анализа отбирают не менее 1 % флаконов от общего количества партии простерилизованной посуды. Партией флаконов считают все флаконы, прошедшие стерилизацию за один цикл работы одного стерилизатора.
В случае получения результата, свидетельствующего о нестерильности хотя бы одного флакона, все партии флаконов, прошедшие обработку в данном стерилизаторе, бракуют. Забракованные партии флаконов подлежат повторной стерилизации. Выясняют возможные причины нарушения стерильности. Проводят комплексную проверку стерилизатора с одновременным использованием химического, термического (в 5 точках) и биологического контроля.
При проведении контроля используются следующие материалы:
- жидкая полноценная неселективная среда (питательный бульон, ГРМ-бульон и др.) проверенной ранее серии;
- плотная полноценная неселективная среда (питательный агар, ГРМ-агар и др.) проверенной ранее серии;
- железосульфитный агар, приготовленный согласно МУК 4.2.10181–01, либо зарубежные аналоги;
- стерильные чашки Петри диаметром 90 мм;
- стерильная водопроводная вода;
- спирт ректификат 96° для фламбирования;
- спирт ректификат 70° для дезинфекции.
Питательный бульон предварительно проверяют на стерильность. Для этого две пробирки от приготовленной партии бульона инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч – учитывают наличие (отсутствие) пророста среды. При наличии пророста партию среды выбраковывают. Контроль стерильности питательного агара и железосульфитного агара проводят в процессе исследования путем постановки отрицательного контроля.
Контроль на общую обсемененность. В исследуемые флаконы вносят питательный бульон в количестве 20 % от объема флакона (например, во флакон 500 мл вносят 100 мл бульона). Флаконы закрывают стерильными резиновыми (силиконовыми) пробками. Переворачиванием или встряхиванием флаконов трехкратно омывают всю внутреннюю поверхность флакона, включая пробку. Инкубацию посевов проводят в этих же флаконах при температуре 37±1 °С в течение 48±2 ч. При видимом росте (помутнение бульона) в каком-либо флаконе результат учитывают как "не стерильно". При сохранении прозрачности бульона проводят контроль пророста бульона: из каждого флакона отбирают по 1 мл содержимого, вносят в две Стерильные чашки Петри и заливают питательным агаром. Параллельно для контроля стерильности используемого питательного агара стерильную чашку Петри заливают тем же питательным агаром (отрицательный контроль). Чашки с посевами инкубируют при 37 °С в течение 48 ч. Наличие пророста при условии отсутствия роста микроорганизмов в отрицательном контроле свидетельствует о нестерильности флакона. Результаты заносят в протокол исследования.
Контроль на наличие спор сульфитредуцирующих клостридий проводят при помощи мембранной фильтрации. В исследуемые флаконы вносят стерильную водопроводную воду в количестве 20 % от объема флакона, флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками. Переворачиванием или встряхиванием флаконов трехкратно омывают (смачивают) всю внутреннюю Поверхность флакона, включая пробку. Фильтровальную установку фламбируют, после чего производят фильтрацию 100 мл стерильной водопроводной воды (отрицательный контроль), затем через другой мембранный фильтр без дополнительного обжига установки фильтруют весь объем смыва с флакона. Дальнейшие исследования обоих фильтров (смыва и контроля) выполняют аналогично по схеме анализа на выявление спор сульфитредуцирующих клостридий согласно МУК 4.2.1018–01. Наличие роста колоний клостридий при отсутствии роста в отрицательном контроле свидетельствует о нестерильности флакона. Результаты заносят в протокол исследования.