Многочисленные исследования свидетельствуют, что на поверхности ячменя всегда в изобилии присутствуют разнообразные микроорганизмы: бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты. Хотя львиную долю в этом заражении занимают бактерии, решающую роль в порче зерна играют мицелиальные грибы, составляя в среднем менее 1% всей микробиоты.
Бактериальная обсемененность солода, по сведениям разных авторов, составляет 1-7 млн. клеток/г, но может достигать 98 млн. клеток/г, причем максимальная величина приходится на долю молочнокислых бактерий (до 14 000/г) – представителей родов Lactobacillus и Pediococcus. Из грамотрицательных бактерий, кроме этого, присутствуют в основном не влияющие на вкус пива бактерии родов Erwinia и Pseudomonas. Из грамположительных – представители родов Micrococcus и Bacillus.
Количество дрожжей в солоде лежит в пределах от 720 штук до 11 000 клеток/г. Преобладают представители p. Sporobolomyces, p. Rhodotorula.
Из грибов чаще всего встречаются представители родов Aspergillus, Rhizopus, Pénicillium, Fusarium, Alternaria. Количество мицелиальных грибов достигает 10 000/г.
Количество актиномицетов незначительно. Наиболее часто встречаются Streptomyces spp.
Загрязнение зернового материала микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности происходит в различное время:
- в период вегетации растений;
- при уборке урожая, особенно в условиях повышенной влажности, во время обмолота или послеуборочной подработки зерна;
- в период хранения вследствие нарушения его режима, а также при закладке зерна на хранение.
Классификация микробиоты зерна, предложенная Е. Н. Мишустиным и Л. А. Трисвятским, предполагает деление на три группы в зависимости от типа взаимоотношений микроорганизма с растением.
1. Эпифитные микроорганизмы – микроорганизмы, заселяющие поверхность вегетирующих растений и зерен и питающиеся продуктами жизнедеятельности растительных клеток и различными поверхностными загрязнениями. В нормальных условиях они не внедряются во внутренние ткани и не причиняют особого вреда. Нередко эти микроорганизмы играют положительную роль – подавляют развитие ряда патогенных микроорганизмов. В основном из эпифитных микроорганизмов состоит микробиота свежеубранных растений при условии нормального развития и своевременной уборки, а также доброкачественного зерна.
Видовой состав эпифитных микроорганизмов довольно однообразен, специфичен и состоит в основном из неспорообразующих бактерий, которые составляют 80-90% общего количества микроорганизмов, и грибов, представленных некоторыми видами родов Alternaría, Mucor, Dematium, Cladosporium и другими. Наличие на зерне ячменя типичных эпифитов, например бактерий Erwinia herbicola, свидетельствует о хорошем его состоянии. Источниками эпифитных микроорганизмов являются почва и прорастающее зерно, а состав и их развитие всегда зависят от климатических условий, температуры и влажности среды. Однако иногда (при снижении жизнеспособности семян, а также в условиях высокой влажности) эпифитные микроорганизмы способны причинять значительный вред, вызывая порчу зерна, способствуя процессу самосогревания зерновой массы вследствие выделения большого количества тепла при дыхании.
На поверхности ячменя при теплой влажной погоде преобладают палочковидные бактерии, не образующие спор, а в сухую жаркую погоду вместо них появляются спорообразующие представители рода Bacillus и др. В условиях влажной прохладной погоды часто развиваются мицелиальные грибы родов Fusarium, Rhizopus.
2. Фитопатогенная (патогенная) микробиота представлена микроорганизмами, способными поражать только живые растения. Проникнув во внутренние части растений, они развиваются и вызывают заболевания семян и проросших из них растений. Грибные болезни зерновых культур (микозы) довольно широко распространены в природе и наносят большой ущерб сельскому хозяйству. Микозы не только резко снижают урожайность, ухудшают качество зерна и продуктов его переработки, но нередко придают им ядовитые свойства. Из числа фитопатогенных грибов наиболее частыми возбудителями микотоксикозов являются Claviceps purpurea, грибы родов Fusarium, Helminthosporium, Septoria и т. д.
Микроорганизмы первой группы являются сапрофитами, но необходимо отметить, что строгого разграничения между сапрофитами и паразитами нет, т. к. многие сапрофиты при определенных условиях (например, при снижении устойчивости растения) способны заражать растения и вызывать заболевания. Так, к факультативным сапрофитам можно отнести некоторые виды родов Alternaria, Cladosporium.
3. При случайном контакте ячменя с зараженными поверхностями сельскохозяйственного оборудования, складов или с пылью и брызгами дождя, частицами почвы и растительных остатков на семена попадают микроорганизмы, относящиеся к третьей группе. Микроорганизмы этой группы являются непостоянной, случайной микробиотой, но при благоприятных для них условиях хранения они способны бурно развиваться и размножаться, принося иногда большой ущерб.
Кроме вышеуказанного деления, микроорганизмы, и главным образом микроскопические мицелиальные грибы, встречающиеся на зерне, условно можно разделить на полевые грибы и грибы хранения. Первые попадают на зерно в период вегетации растений ячменя, вторые – в ходе уборки, транспортировки и хранения зерна. Грибы хранения все являются сапрофитами, т. е. в своем развитии не нуждаются в живых растениях, а вот полевые грибы могут быть как сапрофитами, так и паразитами. Заражение полевыми грибами поверхности зерна происходит с ветром, дождем и пылью, переносящими обрывки мицелия и споры грибов. Многие грибы, составляющие поверхностную (наружную) микрофлору зерна, могут проникать внутрь зерна и образовывать внутреннюю микрофлору.
После уборки, в процессе хранения и переработки ячменя, происходят изменения в составе микробиоты. При хранении зерна количество полевых грибов уменьшается и заметно возрастает количество грибов хранения. Это связано с тем, что полевые грибы для своего развития требуют более высокой влажности (около 25%), а влажность ячменя, направляемого на хранение, составляет 14-15%. Грибы же хранения способны развиваться даже при влажности субстрата ниже 12-13%. К наиболее часто встречающимся грибам хранения, относятся отдельные виды родов Pénicillium и Мисоr, представители рода Aspergillus – Asp. niger, Asp. flavus, Asp. fumigatus, Asp. clavatus, Asp. glaucus, а также Rhizopus nigricans.
Именно грибы хранения играют главную роль в порче зерна, в ухудшении органолептических показателей ячменя, снижении его прорастаемости, изменении пивоваренных свойств сырья и загрязнении микотоксинами.
Заражение грибами хранения, как правило, происходит с поверхности зерна при попадании на нее спор мицелиальных грибов. И лишь потом, начав развиваться, мицелиальные грибы постепенно проникают и во внутренние ткани зерна, к зародышу.
Быстрому развитию в зерновой массе грибов хранения способствуют наличие поврежденных, уже зараженных зерен, а также плохое санитарное состояние хранилищ, нарушение температурного режима и влажности при транспортировке и хранении.
При солодоращении, а именно при замачивании ячменя, создаются условия для развития бактерий и грибов. При недостаточной аэрации возможно закисание зерна вследствие развития молочнокислых и уксуснокислых бактерий, дрожжей. В некоторых случаях на стадии проращивания замоченного ячменя наблюдается обильное развитие некоторых полевых грибов, а именно: Fusarium spp.; Botrytis cinérea, Bipolaris sorokiniana, Mucor spp.
В готовом солоде полевые грибы не встречаются, и заметно изменяется общая картина микробной контаминации, т. к. сушка солода приводит к частичной гибели имеющихся микроорганизмов и появлению ряда новых специфических бактерий и грибов, представляющих микробиоту солода. Необходимо отметить, что солод, так же как и ячмень, подвержен заражению микроскопическими грибами и бактериями, причем порча солода происходит быстрее, т. к. солод не имеет полевой микробной колонизации, являющейся естественной конкурентоспособной преградой для развития грибов хранения.
Представители микроскопических грибов, встречающиеся на зерне ячменя. Альтернария (Alternaría). Относится к числу полевой микробиоты зерен ячменя, и ее присутствие свидетельствует о свежеубранном зерне. От мицелия гриба отходят короткие конидиеносцы, на концах которых находятся конидии заостренно-вытянутой или округло-грушевидной формы. Колонии грибов на сусло-агаре сначала светлые, пушистые, затем зеленовато-серые или оливково-черные, бархатистые или ворсистые, часто с ярко выраженной концентрической зональностью. Отдельные виды имеют колонии с самого начала сажисто-черные, причем пигмент может диффундировать в среду. При обильном развитии альтернарии на зерне она может вызывать почернение его (появление так называемых «черных кончиков»).
Кладоспориум (Cladosporium). Мицелий гриба окрашен в оливково-зеленый цвет, на концах воздушных нитей расположены овальные споры в виде гроздей, окрашенных в тот же цвет, что и мицелий. Эти грибы способны выделять темный пигмент, который окрашивает субстрат, на котором они находятся.
Фузариум (Fusarium). Среди грибов рода Fusarium есть сапрофита, питающиеся растительными остатками, и паразиты, вызывающие различные заболевания ячменя и других злаковых культур. Гриб широко распространен во всех регионах земного шара с влажным умеренным и теплым климатом. При росте гриба на сусло-агаре колонии отдельных видов очень разнообразны по структуре: они могут быть рыхлыми, ватообразными, пышными, плотными. Колонии бывают белого или различных тонов розового или желтого цвета. Нередко сама питательная среда тоже окрашивается в разные цвета и оттенки от розового до коричневого.
При неблагоприятных погодных условиях, при снижении иммунитета растения фузариум может выступать в роли паразита и вызывать ряд заболеваний, объединенных в группу фузариозов. В этом случае существенно меняется внешний вид зерна. При фузариозе колоса на зернах можно обнаружить налет красно-розового или лососевого цвета – результат развития мицелия гриба и образования спор. При интенсивном поражении фузариумом на зернах развивается сумчатая стадия гриба в виде поверхностного, хорошо локализованного сажистого налета.
Большинство видов – потенциальные продуценты широкого спектра микотоксинов (фумонизины, комплекс трихоценовых микотоксинов – дезоксиниваленол, ниваленол, Т-2 токсины, зеараленон). Наличие фузариозного зерна в пивоваренном ячмене не допускается.
Аспергилловые грибы (p. Aspergillus). Насчитывают более 200 видов. У разных видов гриба конидии окрашены различно. Например, у Aspergillus niger конидии окрашены в черный цвет, Aspergillus oryzae имеет конидии желтого или желто-зеленого цвета, Aspergillus glaucus – зеленовато-голубого цвета. Грибы имеют хорошо развитый мицелий. Конидиеносцы на вершине образуют головку с радиально расходящимися цепочками конидий, причем они располагаются по радиусам шара и напоминают струйки воды, выливающиеся из лейки, поэтому иногда эти грибы называют леечной плесенью. Многие представители рода синтезируют афлатоксины.
Пеницилловые грибы (p. Pénicillium). Споры гриба имеют разный цвет, чаще всего колония имеет зелено-голубой окрас. Молодая колония обычно белого цвета, а характерное окрашивание проявляется с возрастом гриба. При микроскопировании можно установить, что гриб имеет многоклеточный мицелий, а конидиеносцы – кистевидные разветвления на концах. Многие виды образуют микотоксины.
Мукоровые грибы. Ризопус (р. Rhizopus). Гриб имеет подобие корневых волосков, с помощью которых он прикрепляется к субстрату. Спорангии вначале белоснежны, а через некоторое время приобретают черный цвет. Зерно, зараженное ризопус нигриканс, имеет серый цвет с черными кончиками, с темным налетом в бороздке и/или на поверхности.
М у к о р (р. Мисоr). Развивается в виде войлочного белого или серого налета. Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и стелется по поверхности. Вверх от грибницы (мицелия) отходят воздушные гифы-спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Вздутия представляют собой спорангии с находящимися внутри эндоспорами.
Влияние загрязнения мицелиальными грибами на показатели брожения, качество сусла и пива. Развитие на зерне ячменя мицелиальных грибов имеет целый ряд отрицательных моментов и приводит к следующему:
- изменению цвета зерна;
- гибели зародыша;
- потере сухой массы зерна;
- снижению прорастаемости (с частичной или полной ее потерей) ячменя;
- появлению у зерновой массы затхлого и плесневелого запаха;
- к белковому перерастворению (увеличению количества низкомолекулярных белковых веществ), повышению кислотности, т. к. грибы обладают системой мощных протеолитических ферментов, разрушающих ткани зерна;
- изменению технологических параметров, поскольку некоторые продукты метаболизма грибов могут отрицательно влиять на пивоваренные дрожжи, угнетая процесс брожения. В зерновой массе при интенсивном их развитии возможно накопление ядовитых продуктов жизнедеятельности – микотоксинов, которые оказывают негативное действие на зародыш зерна и дрожжи.
Наибольшая токсичность микотоксинов проявляется в свежеобмолоченном зерне; при хранении его в сухом состоянии токсичное действие ослабевает, но токсины сохраняют свою активность в ячмене в течение нескольких лет. Будучи устойчивы к нагреванию, большинство микотоксинов лишь в небольшой степени разрушается при кипячении сусла, и значительная их часть переходит в пиво.
Влияние мицелиальных грибов на качество сусла неоднозначно. Например, обнаружено, что грибы р. Fuzarium влияют на процессы, происходящие при замачивании, на активность α-амилазы и диастатическую силу (ДС). Причем некоторые виды гриба усиливают активность фермента и ДС, другие не влияют на ДС, третьи снижают эти показатели. Однако во всех случаях увеличивается содержание в сусле белка. Среди микроорганизмов, влияющих на содержание азота в сусле, необходимо отметить также Helminthosporium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus и др.
Таким образом, химические процессы, происходящие в ячмене и солоде под воздействием микроскопических грибов, оказывают влияние на качество сусла и получаемого из него пива:
- в сусле изменяется вязкость;
- повышается цветность;
- возрастает количество растворимого азота;
- увеличивается число Кольбаха;
- снижается конечная степень сбраживания.
Качество готового пива резко снижается вследствие появления грубого, специфически грибного вкуса и аромата.
Значительные изменения органолептических свойств пива происходят в результате контаминации зерна Asp. niger, Asp. ochraceus, R. arrhizur, Cladosporium sp., Coniothyrium sp. и Fuzarium spp. Первые три представителя придают пиву привкус жженой мелассы, а три последних – грубоватый винный привкус. Исследование влияния мицелиальных грибов на аромат и вкус пива выявило, что в пиве, изготовленном из солода, зараженного культурами Absidia, Trichothecium (Cephalothecium), Cladosporium и Rhizopus, появляется слабый посторонний привкус, в то время как развитие Aspergillus fumigatus придает пиву выраженный терпкий затхлый привкус.
Контаминация солода и пива микотоксинами представляет важную проблему и привлекает к себе внимание не только производителей и органов санитарного контроля, но и представителей здравоохранения и широкие научные круги.
Проблемы возможного обнаружения в пиве микотоксинов связаны в первую очередь с использованием в технологиях несоложеного сырья – пшеницы, кукурузы, риса.
Загрязнение зерновых культур микотоксинами приводит к тому, что продукты зернопереработки содержат в своем составе остаточное их количество. Например, фумонизины В1 и В2, продуцируемые Fusarium moniliforme, попадают в пиво из зараженного зерна и остаются стабильными в условиях ферментации при получении пива и этанола.
В течение четырех лет – в период с марта 1998 г. по март 2002 г. – исследователями из Канады было проанализировано на содержание афлатоксинов В1, В2, G1, G2 304 образца пива, как поступающего на их рынок, так и произведенного у них. В 20 образцах содержание афлатоксинов было повышено; 4 образца пива из Мексики, 2 – из Испании и 1 – из Португалии содержали афлатоксин В1; 4 образца из Индии содержали два афлатоксина – В1 и В2. Содержание афлатоксинов в других образцах не превышало допустимые концентрации.
Высокий уровень зеараленона (0,92 мг/л) был обнаружен в Замбии в кукурузном пиве. Зеараленон выявили в 11% исследованных образцов готовых к употреблению напитков местного производства в Свазиленде (8–53 мг/кг) и в 12% образцов пива в Лесото (0,3–2 мг/л).
В настоящее время немалое число исследований направлено на изучение сохранения микотоксинов в процессе солодоращения и ходе технологического процесса приготовления пива, влияния их на бродильную активность дрожжей. Однако результаты работ далеко не однозначны и порой даже противоречивы.
Анализируя работы по содержанию в ячмене токсинов Т-2, зеараленона (ЗЕА) и дезоксиниваленола (ДОН), Фланниган с коллегами сделали вывод, что большая часть ЗЕА и трихотеценового токсина Т-2 теряется или деградирует при солодоращении, а 77% ДОН исчезает при проращивании. Однако снижение концентраций токсинов в ходе солодоращения оспаривается отдельными исследователями. В частности, показано, что концентрация ДОН и ЗЕА даже повышается в процессе приготовления солода и эти токсины переходят в пиво. Известно, что попадание микотоксинов из ячменя в пиво зависит от степени растворимости микотоксинов и их температурной стабильности. Несмотря на то, что ДОН растворим в воде, при замачивании ячменя его содержание существенно не уменьшается, а напротив, может возрастать, т. к. создаются благоприятные условия для роста грибного мицелия и синтеза микотоксина. Но образование ДОН в процессе соложения значительно различается и, возможно, зависит как от сорта ячменя, так и от технологических параметров соложения, чем можно объяснить полученные противоречивые данные разных исследователей. При сушке солода ДОН не исчезает и не разлагается. Основное разрушение ДОН происходит при затирании, благодаря чему в пиве он практически не обнаруживается.
Наиболее часто развитие на ячмене мицелиальных грибов р. Fusarium и присутствие в пиве различных метаболитов этого гриба, в том числе и микотоксинов, связывают с возникновением гашинга пива (спонтанное вспенивание с выбросом пива из бутылки); это может также приводить к снижению его прозрачности, появлению в нем коллоидной мути.
Пока точно не установлено, что вызывает гашинг. Одна из возможных причин этого – присутствие в пиве микотоксина зеараленона (ЗЕА). Вместе с тем необходимо заметить, что, по-видимому, существует зависимость между эффектом подобного вспенивания и способностью того или иного микроорганизма синтезировать микотоксин ЗЕА, т. к. возникновение гашинга связано с заражением зерна грибами не только р. Fusarium, но и, например, Aspergillus, Rhizopus, Pénicillium и др.
В работах немецких исследователей показано, что эффект гашинга могут вызывать Fusarium graminearum и Fusarium culmorum, причем, вероятно, это связано с присутствием микотоксина дезоксиниваленола (ДОН) в соложеном ячмене, хотя в некоторых случаях при гашинге присутствие ДОН доказано не было. Позднее было сделано заключение, что содержание ДОН – это не единственный критерий возможности эффекта гашинга и его возникновение зависит от присутствия не менее двух инициирующих соединений, одним из которых является пептидосодержащее вещество с низкой молекулярной массой.
Контаминация ячменя и солода Fusarium проявляется и в других отрицательных явлениях, происходящих при изготовлении пива, как, например, флокуляция дрожжей, приводящая к преждевременному окончанию брожения.
В настоящее время (данные 2006 г.) для пивоваренного ячменя в ЕС установлены следующие предельные уровни содержания микотоксинов (в мкг/кг):
- охратоксин – 5;
- зеараленон –100;
- дезоксиниваленол – 1250.