Как отмечено выше, все работы по обоснованию критериев чувствительности проводят с использованием стандартизованного метода серийных разведений. Необходимость стандартизации связана с тем, что при различных условиях культивирования микроорганизмов величина МПК антибактериальных препаратов и диаметры зон задержки роста могут изменяться. Очевидно, что как на этапе разработки критериев чувствительности, так и при проведении исследований в практических целях используемые методы должны обеспечивать полную воспроизводимость результатов.
При использовании принятых значений пограничных концентраций и диаметров зон ингибиции роста даже незначительные отклонения от условий проведения исследований могут привести к получению ошибочных результатов. Например, если в стандартных условиях МПК препарата "X" в отношении микроорганизма "Y" составляет "Z", то при изменении условий проведения исследований эта величина может составить "2Z", в результате штамм будет ошибочно оценен не как "чувствительный", а как "промежуточный" или "устойчивый".
Стандартизация методов оценки антибиотикочувствительности осуществляется по следующим параметрам:
- • состав питательной среды:
- ионы Са2+ и Mg2+ являются антагонистами некоторых АБП, при повышении концентрации этих ионов величина МПК может существенно повышаться. В стандартных питательных средах концентрация ионов должна составлять: Са2+ 20-25 мг/л и Mg2+ 10-12,5 мг/л;
- концентрация питательных веществ непосредственным образом влияет на скорость роста и метаболическую активность микроорганизмов. Чем среда богаче питательными веществами, тем выше скорость роста микроорганизмов и соответственно меньше диаметр зоны ингибиции роста и выше значение МПК;
- наиболее подходящей для оценки антибиотикочувствительности является среда Mueller–Hinton;
- • величина посевной дозы микроорганизма (инокулюм-эффект):
- длительность лаг-фазы непосредственным образом связана с величиной посевной дозы микроорганизмов. При очень высокой концентрации инокулята длительность лаг-фазы может сокращаться до 10–20 мин;
- выраженный инокулюм-эффект характерен для штаммов, продуцирующих некоторые ферменты бета-лактамазы. Увеличение концентрации инокулята с 105 КОЕ/мл до 107 КОЕ/мл может привести к повышению МПК в 32 раза и более;
- • исходное физиологическое состояние исследуемой культуры, длительность и температурный режим инкубации:
- культуры микроорганизмов, длительное время хранившиеся на плотных или жидких питательных средах, обладают пониженными ростовыми свойствами. В подавляющем большинстве случаев для оценки чувствительности необходимо использовать "свежие" культуры, инкубировавшиеся не более 16–18 ч;
- температура инкубации может привести как к торможению, так и к увеличению скорости роста;
- при преждевременном учете результатов (особенно в методах серийных разведений в бульоне) возможна ошибочная оценка устойчивых штаммов как чувствительных. При позднем учете результатов возможна селекция устойчивых мутантов.
Основой поддержания стандартности проведения исследований является постоянный внутрилабораторный контроль качества их проведения. Такой контроль предполагает периодическое (не реже 1 раза в неделю) проведение исследований антибиотикочувствительности контрольных (референсных) штаммов. Контрольные штаммы характеризуются стабильностью основных фенотипических признаков и прежде всего чувствительностью к АБП. Если результаты оценки чувствительности контрольных штаммов соответствуют их паспортным характеристикам, то это свидетельствует о стандартности использованного метода и условий проведения исследований. Если же выявляется несоответствие, то необходимо искать этап, на котором произошли нарушения.