Многочисленные исследования свидетельствуют, что на поверх­ности ячменя всегда в изобилии присутствуют разнообразные микро­организмы: бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты. Хотя львиную долю в этом заражении занимают бактерии, решающую роль в порче зерна играют мицелиальные грибы, составляя в среднем ме­нее 1% всей микробиоты.

Бактериальная обсемененность солода, по сведениям разных ав­торов, составляет 1-7 млн. клеток/г, но может достигать 98 млн. кле­ток/г, причем максимальная величина приходится на долю молочно­кислых бактерий (до 14 000/г) – представителей родов Lactobacillus и Pediococcus. Из грамотрицательных бактерий, кроме этого, при­сутствуют в основном не влияющие на вкус пива бактерии родов Erwinia и Pseudomonas. Из грамположительных – представители ро­дов Micrococcus и Bacillus.

Количество дрожжей в солоде лежит в пределах от 720 штук до 11 000 клеток/г. Преобладают представители p. Sporobolomyces, p. Rhodotorula.

Из грибов чаще всего встречаются представители родов Aspergillus, Rhizopus, Pénicillium, Fusarium, Alternaria. Количество мицелиальных грибов достигает 10 000/г.

Количество актиномицетов незначительно. Наиболее часто встре­чаются Streptomyces spp.

Загрязнение зернового материала микроорганизмами и продук­тами их жизнедеятельности происходит в различное время:

• в период вегетации растений;
• при уборке урожая, особенно в условиях повышенной влаж­ности, во время обмолота или послеуборочной подработки зерна;
• в период хранения вследствие нарушения его режима, а также при закладке зерна на хранение.

Классификация микробиоты зерна, предложенная Е. Н. Мишустиным и Л. А. Трисвятским, предполагает деление на три группы в зависимости от типа взаимоотношений микроорганизма с рас­тением.

1. Эпифитные микроорганизмы – микроорганизмы, заселяющие поверхность вегетирующих растений и зерен и питающиеся продуктами жизнедеятельности растительных клеток и различными поверхностными загрязнениями. В нормальных условиях они не внедряются во внутренние ткани и не причиняют особого вреда. Нередко эти микроорганизмы играют положительную роль – подавляют развитие ряда патогенных микроорганизмов. В основном из эпифитных микроорганизмов состоит микробиота свежеубранных растений при условии нормального развития и своевременной уборки, а также доброкачественного зерна.

Видовой состав эпифитных микроорганизмов довольно одно­образен, специфичен и состоит в основном из неспорообразующих бактерий, которые составляют 80-90% общего количества мик­роорганизмов, и грибов, представленных некоторыми видами ро­дов Alternaría, Mucor, Dematium, Cladosporium и другими. Наличие на зерне ячменя типичных эпифитов, например бактерий Erwinia herbicola, свидетельствует о хорошем его состоянии. Источниками эпифитных микроорганизмов являются почва и прорастающее зерно, а состав и их развитие всегда зависят от климатических усло­вий, температуры и влажности среды. Однако иногда (при снижении жизнеспособности семян, а также в условиях высокой влажности) эпифитные микроорганизмы способны причинять значительный вред, вызывая порчу зерна, способствуя процессу самосогревания зерновой массы вследствие выделения большого количества тепла при дыхании.

На поверхности ячменя при теплой влажной погоде преобладают палочковидные бактерии, не образующие спор, а в сухую жаркую по­году вместо них появляются спорообразующие представители рода Bacillus и др. В условиях влажной прохладной погоды часто развива­ются мицелиальные грибы родов Fusarium, Rhizopus.

2. Фитопатогенная (патогенная) микробиота представлена микроорганизмами, способными поражать только живые растения. Проникнув во внутренние части растений, они развиваются и вызывают заболевания семян и проросших из них растений. Грибные болезни зерновых культур (микозы) довольно широко распространены в природе и наносят большой ущерб сельскому хозяйству. Микозы не только резко снижают урожайность, ухудшают качество зерна и продуктов его переработки, но нередко придают им ядовитые свойства. Из числа фитопатогенных грибов наиболее частыми возбудителями микотоксикозов являются Claviceps purpurea, грибы родов Fusarium, Helminthosporium, Septoria и т. д.

Микроорганизмы первой группы являются сапрофитами, но не­обходимо отметить, что строгого разграничения между сапрофитами и паразитами нет, т. к. многие сапрофиты при определенных условиях (например, при снижении устойчивости растения) способны зара­жать растения и вызывать заболевания. Так, к факультативным сапрофитам можно отнести некоторые виды родов Alternaria, Cladosporium.

3. При случайном контакте ячменя с зараженными поверхностями сельскохозяйственного оборудования, складов или с пылью и брыз­гами дождя, частицами почвы и растительных остатков на семена попадают микроорганизмы, относящиеся к третьей группе. Микро­организмы этой группы являются непостоянной, случайной микробиотой, но при благоприятных для них условиях хранения они спо­собны бурно развиваться и размножаться, принося иногда большой ущерб.

Кроме вышеуказанного деления, микроорганизмы, и главным об­разом микроскопические мицелиальные грибы, встречающиеся на зерне, условно можно разделить на полевые грибы и грибы хранения. Первые попадают на зерно в период вегетации растений ячменя, вто­рые – в ходе уборки, транспортировки и хранения зерна. Грибы хра­нения все являются сапрофитами, т. е. в своем развитии не нуждаются в живых растениях, а вот полевые грибы могут быть как сапрофитами, так и паразитами. Заражение полевыми грибами поверхности зерна происходит с ветром, дождем и пылью, переносящими обрывки ми­целия и споры грибов. Многие грибы, составляющие поверхностную (наружную) микрофлору зерна, могут проникать внутрь зерна и обра­зовывать внутреннюю микрофлору.

После уборки, в процессе хранения и переработки ячменя, проис­ходят изменения в составе микробиоты. При хранении зерна коли­чество полевых грибов уменьшается и заметно возрастает количество грибов хранения. Это связано с тем, что полевые грибы для своего развития требуют более высокой влажности (около 25%), а влажность ячменя, направляемого на хранение, составляет 14-15%. Грибы же хранения способны развиваться даже при влажности субстрата ниже 12-13%. К наиболее часто встречающимся грибам хранения, отно­сятся отдельные виды родов Pénicillium и Мисоr, представители рода Aspergillus – Asp. niger, Asp. flavus, Asp. fumigatus, Asp. clavatus, Asp. glaucus, а также Rhizopus nigricans.

Именно грибы хранения играют главную роль в порче зерна, в ухудшении органолептических показателей ячменя, снижении его прорастаемости, изменении пивоваренных свойств сырья и загрязне­нии микотоксинами.

Заражение грибами хранения, как правило, происходит с поверх­ности зерна при попадании на нее спор мицелиальных грибов. И лишь потом, начав развиваться, мицелиальные грибы постепенно прони­кают и во внутренние ткани зерна, к зародышу.

Быстрому развитию в зерновой массе грибов хранения способ­ствуют наличие поврежденных, уже зараженных зерен, а также пло­хое санитарное состояние хранилищ, нарушение температурного ре­жима и влажности при транспортировке и хранении.

При солодоращении, а именно при замачивании ячменя, созда­ются условия для развития бактерий и грибов. При недостаточной аэ­рации возможно закисание зерна вследствие развития молочнокис­лых и уксуснокислых бактерий, дрожжей. В некоторых случаях на стадии проращивания замоченного ячменя наблюдается обильное развитие некоторых полевых грибов, а именно: Fusarium spp.; Botrytis cinérea, Bipolaris sorokiniana, Mucor spp.

В готовом солоде полевые грибы не встречаются, и заметно изме­няется общая картина микробной контаминации, т. к. сушка солода приводит к частичной гибели имеющихся микроорганизмов и появ­лению ряда новых специфических бактерий и грибов, представля­ющих микробиоту солода. Необходимо отметить, что солод, так же как и ячмень, подвержен заражению микроскопическими грибами и бактериями, причем порча солода происходит быстрее, т. к. солод не имеет полевой микробной колонизации, являющейся естественной конкурентоспособной преградой для развития грибов хранения.

Представители микроскопических грибов, встречающиеся на зерне ячменя. Альтернария (Alternaría). Относится к числу полевой мик­робиоты зерен ячменя, и ее присутствие свидетельствует о свежеубранном зерне. От мицелия гриба отходят короткие конидиеносцы, на концах которых находятся конидии заостренно-вытяну­той или округло-грушевидной формы. Колонии грибов на сусло-агаре сначала светлые, пушистые, затем зеленовато-серые или оливково-черные, бархатистые или ворсистые, часто с ярко выра­женной концентрической зональностью. Отдельные виды имеют колонии с самого начала сажисто-черные, причем пигмент может диффундировать в среду. При обильном развитии альтернарии на зерне она может вызывать почернение его (появление так называе­мых «черных кончиков»).

Кладоспориум (Cladosporium). Мицелий гриба окрашен в оливково-зеленый цвет, на концах воздушных нитей расположены овальные споры в виде гроздей, окрашенных в тот же цвет, что и мицелий. Эти грибы способны выделять темный пигмент, который окрашивает суб­страт, на котором они находятся.

Фузариум (Fusarium). Среди грибов рода Fusarium есть сапрофита, питающиеся растительными остатками, и паразиты, вызывающие различные заболевания ячменя и других злаковых культур. Гриб ши­роко распространен во всех регионах земного шара с влажным уме­ренным и теплым климатом. При росте гриба на сусло-агаре колонии отдельных видов очень разнообразны по структуре: они могут быть рыхлыми, ватообразными, пышными, плотными. Колонии бывают белого или различных тонов розового или желтого цвета. Нередко сама питательная среда тоже окрашивается в разные цвета и оттенки от розового до коричневого.

При неблагоприятных погодных условиях, при снижении имму­нитета растения фузариум может выступать в роли паразита и вызы­вать ряд заболеваний, объединенных в группу фузариозов. В этом слу­чае существенно меняется внешний вид зерна. При фузариозе колоса на зернах можно обнаружить налет красно-розового или лососевого цвета – результат развития мицелия гриба и образования спор. При интенсивном поражении фузариумом на зернах развивается сумчатая стадия гриба в виде поверхностного, хорошо локализованного сажис­того налета.

Большинство видов – потенциальные продуценты широкого спектра микотоксинов (фумонизины, комплекс трихоценовых микотоксинов – дезоксиниваленол, ниваленол, Т-2 токсины, зеараленон). Наличие фузариозного зерна в пивоваренном ячмене не допускается.

Аспергилловые грибы (p. Aspergillus). Насчитывают более 200 видов. У разных видов гриба конидии окрашены различно. Например, у Aspergillus niger конидии окрашены в черный цвет, Aspergillus oryzae имеет конидии желтого или желто-зеленого цвета, Aspergillus glaucus – зеленовато-голубого цвета. Грибы имеют хорошо развитый мицелий. Конидиеносцы на вершине образуют головку с радиально расходя­щимися цепочками конидий, причем они располагаются по радиусам шара и напоминают струйки воды, выливающиеся из лейки, поэтому иногда эти грибы называют леечной плесенью. Многие представители рода синтезируют афлатоксины.

Пеницилловые грибы (p. Pénicillium). Споры гриба имеют разный цвет, чаще всего колония имеет зелено-голубой окрас. Молодая колония обычно белого цвета, а характерное окрашивание прояв­ляется с возрастом гриба. При микроскопировании можно устано­вить, что гриб имеет многоклеточный мицелий, а конидиеносцы – кистевидные разветвления на концах. Многие виды образуют ми­котоксины.

Мукоровые грибы. Ризопус (р. Rhizopus). Гриб имеет подобие корневых волосков, с помощью которых он прикрепляется к суб­страту. Спорангии вначале белоснежны, а через некоторое время при­обретают черный цвет. Зерно, зараженное ризопус нигриканс, имеет серый цвет с черными кончиками, с темным налетом в бороздке и/или на поверхности.

М у к о р (р. Мисоr). Развивается в виде войлочного белого или серого налета. Мицелий мукоровых грибов пронизывает субстрат и стелется по поверхности. Вверх от грибницы (мицелия) отходят воздушные гифы-спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Взду­тия представляют собой спорангии с находящимися внутри эн­доспорами.

Влияние загрязнения мицелиальными грибами на показатели броже­ния, качество сусла и пива. Развитие на зерне ячменя мицелиальных грибов имеет целый ряд отрицательных моментов и приводит к сле­дующему:

• изменению цвета зерна;
• гибели зародыша;
• потере сухой массы зерна;
• снижению прорастаемости (с частичной или полной ее поте­рей) ячменя;
• появлению у зерновой массы затхлого и плесневелого запаха;
• к белковому перерастворению (увеличению количества низко­молекулярных белковых веществ), повышению кислотности, т. к. грибы обладают системой мощных протеолитических фер­ментов, разрушающих ткани зерна;
• изменению технологических параметров, поскольку некото­рые продукты метаболизма грибов могут отрицательно влиять на пивоваренные дрожжи, угнетая процесс брожения. В зер­новой массе при интенсивном их развитии возможно накоп­ление ядовитых продуктов жизнедеятельности – микоток­синов, которые оказывают негативное действие на зародыш зерна и дрожжи.

Наибольшая токсичность микотоксинов проявляется в свежеобмолоченном зерне; при хранении его в сухом состоянии токсичное дейс­твие ослабевает, но токсины сохраняют свою активность в ячмене в течение нескольких лет. Будучи устойчивы к нагреванию, большинс­тво микотоксинов лишь в небольшой степени разрушается при кипя­чении сусла, и значительная их часть переходит в пиво.

Влияние мицелиальных грибов на качество сусла неоднозначно. Например, обнаружено, что грибы р. Fuzarium влияют на процессы, происходящие при замачивании, на активность α-амилазы и диастатическую силу (ДС). Причем некоторые виды гриба усиливают актив­ность фермента и ДС, другие не влияют на ДС, третьи снижают эти показатели. Однако во всех случаях увеличивается содержание в сусле белка. Среди микроорганизмов, влияющих на содержание азота в сусле, необходимо отметить также Helminthosporium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus и др.

Таким образом, химические процессы, происходящие в ячмене и солоде под воздействием микроскопических грибов, оказывают влия­ние на качество сусла и получаемого из него пива:

• в сусле изменяется вязкость;
• повышается цветность;
• возрастает количество растворимого азота;
• увеличивается число Кольбаха;
• снижается конечная степень сбраживания.

Качество готового пива резко снижается вследствие появления грубого, специфически грибного вкуса и аромата.

Значительные изменения органолептических свойств пива про­исходят в результате контаминации зерна Asp. niger, Asp. ochraceus, R. arrhizur, Cladosporium sp., Coniothyrium sp. и Fuzarium spp. Пер­вые три представителя придают пиву привкус жженой мелассы, а три последних – грубоватый винный привкус. Исследование влияния мицелиальных грибов на аромат и вкус пива выявило, что в пиве, изготовленном из солода, зараженного культурами Absidia, Trichothecium (Cephalothecium), Cladosporium и Rhizopus, появ­ляется слабый посторонний привкус, в то время как развитие Aspergillus fumigatus придает пиву выраженный терпкий затхлый привкус.

Контаминация солода и пива микотоксинами представляет важ­ную проблему и привлекает к себе внимание не только производи­телей и органов санитарного контроля, но и представителей здраво­охранения и широкие научные круги.

Проблемы возможного обнаружения в пиве микотоксинов свя­заны в первую очередь с использованием в технологиях несоложеного сырья – пшеницы, кукурузы, риса.

Загрязнение зерновых культур микотоксинами приводит к тому, что продукты зернопереработки содержат в своем составе остаточ­ное их количество. Например, фумонизины В₁ и В₂, продуцируемые Fusarium moniliforme, попадают в пиво из зараженного зерна и остаются стабильными в условиях ферментации при получении пива и этанола.

В течение четырех лет – в период с марта 1998 г. по март 2002 г. – исследователями из Канады было проанализировано на содержание афлатоксинов В₁, В₂, G₁, G₂ 304 образца пива, как поступающего на их рынок, так и произведенного у них. В 20 образцах содержание афлатоксинов было повышено; 4 образца пива из Мексики, 2 – из Испа­нии и 1 – из Португалии содержали афлатоксин В₁; 4 образца из Ин­дии содержали два афлатоксина – В₁ и В₂. Содержание афлатоксинов в других образцах не превышало допустимые концентрации.

Высокий уровень зеараленона (0,92 мг/л) был обнаружен в Замбии в кукурузном пиве. Зеараленон выявили в 11% исследованных образ­цов готовых к употреблению напитков местного производства в Сва­зиленде (8–53 мг/кг) и в 12% образцов пива в Лесото (0,3–2 мг/л).

В настоящее время немалое число исследований направлено на изучение сохранения микотоксинов в процессе солодоращения и ходе технологического процесса приготовления пива, влияния их на бро­дильную активность дрожжей. Однако результаты работ далеко не однозначны и порой даже противоречивы.

Анализируя работы по содержанию в ячмене токсинов Т-2, зеарале­нона (ЗЕА) и дезоксиниваленола (ДОН), Фланниган с коллегами сде­лали вывод, что большая часть ЗЕА и трихотеценового токсина Т-2 те­ряется или деградирует при солодоращении, а 77% ДОН исчезает при проращивании. Однако снижение концентраций токсинов в ходе со­лодоращения оспаривается отдельными исследователями. В част­ности, показано, что концентрация ДОН и ЗЕА даже повышается в процессе приготовления солода и эти токсины переходят в пиво. Из­вестно, что попадание микотоксинов из ячменя в пиво зависит от сте­пени растворимости микотоксинов и их температурной стабильности. Несмотря на то, что ДОН растворим в воде, при замачивании ячменя его содержание существенно не уменьшается, а напротив, может воз­растать, т. к. создаются благоприятные условия для роста грибного мицелия и синтеза микотоксина. Но образование ДОН в процессе со­ложения значительно различается и, возможно, зависит как от сорта ячменя, так и от технологических параметров соложения, чем можно объяснить полученные противоречивые данные разных исследовате­лей. При сушке солода ДОН не исчезает и не разлагается. Основное разрушение ДОН происходит при затирании, благодаря чему в пиве он практически не обнаруживается.

Наиболее часто развитие на ячмене мицелиальных грибов р. Fu­sarium и присутствие в пиве различных метаболитов этого гриба, в том числе и микотоксинов, связывают с возникновением гашинга пива (спонтанное вспенивание с выбросом пива из бутылки); это мо­жет также приводить к снижению его прозрачности, появлению в нем коллоидной мути.

Пока точно не установлено, что вызывает гашинг. Одна из воз­можных причин этого – присутствие в пиве микотоксина зеарале­нона (ЗЕА). Вместе с тем необходимо заметить, что, по-видимому, существует зависимость между эффектом подобного вспенивания и способностью того или иного микроорганизма синтезировать микотоксин ЗЕА, т. к. возникновение гашинга связано с заражением зерна грибами не только р. Fusarium, но и, например, Aspergillus, Rhizopus, Pénicillium и др.

В работах немецких исследователей показано, что эффект гашинга могут вызывать Fusarium graminearum и Fusarium culmorum, причем, вероятно, это связано с присутствием микотоксина дезоксинивале­нола (ДОН) в соложеном ячмене, хотя в некоторых случаях при гашинге присутствие ДОН доказано не было. Позднее было сделано за­ключение, что содержание ДОН – это не единственный критерий возможности эффекта гашинга и его возникновение зависит от при­сутствия не менее двух инициирующих соединений, одним из кото­рых является пептидосодержащее вещество с низкой молекулярной массой.

Контаминация ячменя и солода Fusarium проявляется и в других отрицательных явлениях, происходящих при изготовлении пива, как, например, флокуляция дрожжей, приводящая к преждевременному окончанию брожения.

В настоящее время (данные 2006 г.) для пивоваренного ячменя в ЕС установлены следующие предельные уровни содержания мико­токсинов (в мкг/кг):

• охратоксин – 5;
• зеараленон –100;
• дезоксиниваленол – 1250.