17.2.1. Автоматизация при идентификации и определении антибиотикочувствительности

Компьютеризация и автоматизация идентификации микроор­ганизмов. Опыт применения микротест-систем в практической работе показал, что заключительный этап исследований – про­ведение идентификации культур с использованием рекомендо­ванных идентификационных таблиц, индексов часто занимает много времени и не всегда приводит к положительному резуль­тату, так как невозможно предусмотреть все варианты фермен­тативной активности клинических штаммов микроорганизмов. Разработанные к некоторым тест-системам печатные книги кодов (регистры) позволяют расширить количество идентифифицируемых культур, выполнить ряд требуемых дополнительных

тестов. Однако использование данных регистров требует много времени для подсчета числового кода, особенно при наличии сомнительных тестов. Единственный путь преодоления указан­ных трудностей – это использование компьютерных иденти­фикационных программ и автоматизированных комплексов.

Для идентификации микроорганизмов различных групп можно использовать программу "Система микробиологическо­го мониторинга МИКРОБ" ("Медпроект-3", Россия), позво­ляющую проводить визуальное считывание результатов биохи­мических тестов, выполненных с использованием коммерчес­ких микротест-систем, детально описанных в предыдущем раз­деле, а также программу "БАКТ" ("Аналитика", Россия) для автоматического считывания результатов с помощью планшет­ных фотометров-ридеров типа Multiskan или iEMS (производ­ства фирмы "THERMO Labsystems", Финляндия).

Преимуществом использования программ является возмож­ность расширения числа идентифицируемых видов микроорга­низмов, спектра изучаемых признаков (тестов), получения стандартных, воспроизводимых и сопоставимых результатов и получение готового бланка анализа. Идентификация микроор­ганизмов в программах основана на изучении морфологичес­ких, культуральных свойств и биохимической активности с использованием микротест-систем, позволяющих одновремен­но определить от 7 до 24 различных ферментативных реакций и более. Для этого на каждую группу микроорганизмов состав­лен "банк" данных, представляющий собой обобщенные све­дения о частоте встречаемости того или иного теста у микро­организмов различных видов. При составлении "банков" ис­пользованы литературные данные и данные собственных ис­следований разработчиков, позволяющие учесть особенности клинических штаммов и тест-систем. Для всех групп микроор­ганизмов спектр тестов, приведенных в "банках" данных, до­статочно широк, он не ограничивается только биохимически­ми тестами, а включает данные по микроскопии (что особенно важно для анаэробов), рост на дифференциально-диагности­ческих средах, наличие гемолиза, подвижность культур, нали­чие пигмента и т.д. Программы позволяют проводить иденти­фикацию около 400 видов микроорганизмов, включающих пред­ставителей из семейств энтеробактерий и вибрионов, рода стафилококков и родственных грамположительных кокков, стрептококков, энтерококков, неферментирующих грамотри­цательных бактерий, нейссерий, пастерелл, коринебактерий, анаэробов, клинически значимых грибов.

Идентификацию при помощи компьютерной программы начинают с выбора нужного "банка" данных микроорганиз­мов. В программе "МИКРОБ", например, на экране появится всплывающее меню с полным списком "банков".

При выборе из списка банка "Неферментирующие" появляется экранная форма с перечнем всех тестов, заложенных в банк данных на эту группу микроорганизмов (рис. 17.3).

Рис. 17.3. Идентификация в программе "МИКРОБ". Бланк для ввода результатов идентификации.

Над полями для ввода результатов срабатывания тестов даны их условные трехбуквенные обозначения.

При проведении идентификации визуально учитывают ре­зультаты выполненных тестов в тест-системе, на диагностичес­ких полосках и результаты дополнительных тестов (морфоло­гия, рост на среде Эндо, гемолиз, подвижность, ферментация глюкозы, наличие оксидазы, пигментообразования и др.), от­мечая их "+" при положительной реакции, "–" при отрица­тельной и "?" при нечеткой реакции. После завершения ввода результатов тестов программа автоматически проводит расчет результатов идентификации и выдает на экран компьютера следующую информацию (рис. 17.4):

• наименование наиболее вероятного (вероятных) микроорга­низма из имеющихся в "банке" данных;
• подобие или вероятность (%ид, %id);
• индекс (Тин, Tin);
• качественная оценка идентификации (определяется соотно­шением %ид и Тин):

Отличная                                   %ид 99,9 и более, Тин 0,75 и более

Очень хорошая                         %ид 99,0 и более, Тин 0,50 и более

Хорошая                                    %ид 90,0 и более, Тин 0,25 и более

Приемлемая                              %ид 85,0 и более, Тин 0,10 и более

–  данные о несовпадающих (атипичных) тестах в полученном профиле для каждого из вероятных таксонов с процентом положительных реакций, заложенных в банке данных;

Рис. 17.4. Результат идентификации в программе "МИКРОБ". Иден­тифицированные культуры.

• перечень дополнительных разделительных тестов в случае получения двух и более вероятных культур с указанием процента положительных реакций для каждого теста и так­сона (рис. 17.5);
• идентификация до рода или группы микроорганизмов одно­го рода – в случае неудовлетворительной идентификации для каждого из выбранных таксонов, но дающих в сумме для двух и более таксонов одного родового наименования удовлетворительные показатели.

Следует обращать особое внимание на те случаи, когда в таблице результатов идентификации появляются редко встре­чающиеся виды бактерий, причем для них нет ни одного не совпадающего с банком данных теста. В этих случаях рекомен­дуется повторить исследования, приготовив суспензию из куль­туры, выращенной из отдельной колонии на неселективной среде, полностью исключив возможность присутствия примеси посторонних микроорганизмов, особенно медленнорастущих.

Программа "БАКТ" наряду с введением результатов сраба­тывания тестов с клавиатуры позволяет проводить их автома­тизированное считывание при помощи прибора. Однако ре­зультаты дополнительных тестов необходимо вносить вручную с клавиатуры.

При большом объеме выполняемых исследований визуаль ное считывание биохимических тестов и внесение их вручную для компьютерной идентификации следует заменить на авто­матическое с использованием специализированных приборов. Внедрение в работу микробиологических лабораторий автома­тического или полуавтоматического оборудования для выпол­нения ежедневных, самых трудоемких и дорогостоящих, иссле­дований по идентификации и определению антибиотикочувст-вительности позволяет получать стандартные результаты, су­щественно сокращает сроки выдачи результатов анализов, устраняет малопроизводительный ручной труд.

Рис. 17.5. Результат идентификации в программе "МИКРОБ". Допол­нительные тесты для разделения культур.

В настоящее время для автоматизированного считывания тест-панелей пред­лагается несколько видов автоматизированных систем преиму­щественно зарубежного производства: полуавтоматическая, miniAPI и автоматическая VITEK (фирма "bioMerieux", Фран­ция); полуавтоматическая Sceptor и автоматическая Phoenix (фирма "Becton Dickinson", США); полуавтоматическая Auto­Scan 4 и автоматическая WalkAway (фирма "Baxter/DADE", США); полуавтоматическая MicroTax (фирма "SyLab", Авс­трия); полуавтоматические на базе приборов Multiskan и iEMS (фирма "THERMO Labsystems"). Следует отметить, что план­шетные фотометры, например фирмы "THERMO Labsystems", легко адаптируются как к отечественным, так и к импортным тест-системам стандартного планшетного 96-луночного форма­та для проведения идентификации микроорганизмов и опре­деления антибиотикочувствительности. Это не создает безвы­ходных ситуаций в случае отсутствия адекватного финансиро­вания, оставляет возможность выбора используемых тест-сис­тем, исходя из их качества, цены и доступности.

17.2.2.   Методы автоматизированного определения антибиотикочувствительности с использованием готовых тест-систем

При наличии прибора – планшетного фотометра, компью­тера и программы "БАКТ" можно в автоматизированном ре­жиме определять антибиотикочувствительность микроорганиз­мов двумя методами:

• с количественной регистрацией результатов – определение минимальной ингибирующей концентрации (МИКтест);
• полуколичественной регистрацией результатов – определе­ние пограничных концентраций (ТПКтест или Breakpointtest)

Для определения антибиотикочувствительности при этом используют готовые к употреблению тест-системы (ТПКтест или МИКтест) со стандартным набором антибиотиков для различных групп бактерий. После автоматизированного считы­вания тест-систем ТПКтест программа "БАКТ" позволяет по­лучить результаты в виде готовых печатных форм с указанием степени чувствительности выделенной культуры к каждому препарату в антибиотикограмме. При автоматизированном оп­ределении минимальной ингибирующей концентрации с по­мощью тест-системы МИКтест программа "БАКТ" позволяет получить для выделенной культуры точное значение МПК по каждому из препаратов, входящих в тест-систему.

17.2.3.   Автоматизация определения степени обсемененности различных биоматериалов

Наличие в микробиологических лабораториях приборов, по­зволяющих снимать кинетику размножения микроорганизмов, позволяет решать широкий круг задач, например определять степень обсемененности биоматериалов для подтверждения этиологической значимости выделенных микроорганизмов. В настоящее время прибором, отвечающим всем требованиям для проведения кинетических измерений, является планшет­ный фотометр типа iЕМБ (рис. 17.6). Прибор имеет встроен­ный термостат, обеспечивающий поддержание температуры с точностью до 0,5°С и градиентом температуры по инкубируе­мому в приборе планшету 0,2 °С, 8 светофильтров с длинами волн 340, 405, 414, 450, 492, 540, 620, 690 нм и встроенный орбитальный встряхиватель-шейкер. Управление работой при­бора осуществляется при помощи персонального компьютера и программы "БАКТ". Система охлаждения термостата прибора сконструирована таким образом, чтобы не происходило конта-минирования питательного бульона, внесенного в лунки план­шета, из окружающей атмосферы при кинетических измерениях открытого планшета.

Рис. 17.6. Планшетный фотометр серии 1ЕМ8 со встроенным инкуба­тором.

Известно, что ха­рактерное прираще­ние оптической плот­ности инокулиро-ванной питательной среды свидетельству­ет о размножении в ней микроорганиз­мов. Высокий уро­вень корреляции оп­тической плотности с количеством мик­робных тел позволя­

ет опосредованно "кривую роста оптической плотности" на­зывать "кривой микробного роста". Для получения кривых микробного роста необходимо провести динамическое измере­ние оптической плотности в лунках планшета через равные промежутки времени при определенных длинах волн фотомет-рирования. При проведении динамических измерений на эк­ране монитора высвечивается время вступления микроорганиз­мов биосубстрата в стадию экспоненциального роста. Установ­лено, что этот показатель тесно коррелирует с исходным коли­чеством микроорганизмов практически в любом биосубстрате; при исходной обсемененности 10⁸–10⁹ микрооганизмов в 1 мл время вступления в фазу экспоненциального роста равняется 15–30 мин. Методика позволяет в течение первых 5 ч выявить пробы с исходной обсемененностью более 10⁵ КОЕ/мл. Для этого на протяжении указанного периода времени, не преры­вая динамического измерения, программа выдает на экран монитора номера лунок планшета, в которых микроорганизмы вступили в фазу экспоненциального роста, что свидетельствует о высокой обсемененности проб биоматериалов. Необходимо сделать высев этих проб на плотные питательные среды для получения чистой культуры, с тем чтобы уже на следующие сутки была возможность провести идентификацию выделенных культур и определить их антибиотикочувствительность.

По окончании проведения динамического измерения опти­ческой плотности в лунках планшета (через 15–20 ч) програм­ма "БАКТ" позволяет получить полные кривые роста микро­организмов, присутствующих в биоматериале, в разведениях биоматериала 1:10, 1:100 и 1:1000 (рис. 17.7).

Рис. 17.7. Распечатка из программы "БАКТ". Кривые роста микро­организмов в разведениях биосубстрата (мочи) 1:10, 1:100 и 1:1000.

Для проведения исследования моча, раневое отделяемое и другие биосубстраты разводятся микротитрованием непосредственно в стандартном стерильном 96-луночном планшете в питательном бульоне; в одном планшете одновременно можно определить степень обсемененности 31 пробы различных биосубстратов. Специаль­ный алгоритм математической обработки кинетических моде­лей роста микроорганизмов позволяет определять степень обсемененности мочи, раневого отделяемого и других биологиче­ских жидкостей. Через 15–20 ч инкубирования программа рассчитывает точное количество микроорганизмов в пересчете на 1 мл/г/см² биосубстрата.

Данный метод позволяет обследовать одновременно боль­шое количество больных при низких материальных и трудовых затратах по сравнению с традиционными количественными и полуколичественными методами. Получаемое при этом точное количество микроорганизмов может служить тестом при про­ведении мониторинга эффективности назначенной антибакте­риальной терапии.