Средства контроля и вспомогательные устройства. Аппаратура, материа­лы, реактивы по ГОСТ 9225 со следующими дополнениями:

  • сухая плазма кроличья, цитратная;
  • контрольный штамм Staphylococcus aureus;
  • мембранные фильтры;
  • калия теллурит, раствор с массовой концентрацией 10 г/дм3;
  • глицин, раствор с массовой концентрацией 200 г/дм3;
  • кристаллический фиолетовый;
  • натрия пируват, раствор с массовой концентрацией 200 г/дм3;
  • литий хлористый, гексагидрат;
  • триптон;
  • экстракт дрожжевой или экстракт дрожжевой, очищенный;
  • экстракт мясной;
  • фуксин основной, спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм3;
  • яйца куриные пищевые по ГОСТ 27583;
  • витаминный препарат «ЭКД» сухой.

Питательные среды. Гидролизованное и стерильное обезжиренное молоко по ГОСТ 10444.11.

Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой и питательный агар сухой II, выпускаемые Дагестанским НПО «Пита­тельные среды».

Желточную эмульсию готовят следующим образом. Свежее куриное яйцо моют водопроводной водой, затем протирают ваткой, смоченной в спирте, и обсушивают. Отделяют желток и вносят его в 100 см3 сте­рильного раствора хлористого натрия по ГОСТ 9225. Тщательно пере­мешивают. Приготовленная эмульсия может храниться при темпера­туре 0–5 °С не более 72 ч.

Солевой бульон (допускается применение солевого бульона, который готовится согласно указанию на этикетке). Состав: натрий хлористый (NaCl) – 7,5 г; питательный сухой бульон – 1,5 г (или гидролизован­ное молоко – 100 см3).

Приготовление: в 100 см3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухо­го питательного бульона, кипятят 1–2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl, устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение(10 ± 1) мин.

Или к 100 см3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl, уста­навливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Желточно-солевой агар[1]. Состав: питательный агар[2] для культи­вирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г или питательный агар II8 (на основе гидролизата кормовых дрожжей) 24 г; натрий хлористый (NaCl) – 75 г; эмульсия желточная – 50,0 см3; вода дистиллированная – 1 дм3.

Приготовление: в 1 дм3 дистиллированной воды вносят 36 г пита­тельного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г пи­тательного агара сухого II, добавляют 75 г хлористого натрия (NaCl), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный там­пон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см3 предварительно под­готовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Молочно-солевой агар[3]. Состав: питательный агар[4] для культиви­рования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) – 35 г; или питательный агар II10 (на основе гидролизата кормовых дрож­жей) – 24,0 г; натрий хлористый (NaCl) – 75,0 г; молоко обезжирен­ное – 100 см3; вода дистиллированная – 1 дм3.

Приготовление: среду готовят, как указано выше, но после охлажде­ния до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

Агар Байрд-Паркера. Среда готовится согласно указанию на этикет­ке. Состав. Основа среды: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; мясной экстракт – 5,0 г; литий хлористый гексагидрат – 5,0 г; агар – 12,0–20,0 г; вода дистиллированная – 1 дм3.

Раствор пирувата натрия: пируват натрия – 20,0 г; вода дистилли­рованная –100 см3.

Раствор глицина: глицин – 20,0 г; вода дистиллированная – 100,0 см3.

Приготовление основы среды: в 1 дм3 дистиллированной воды вно­сят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.

При отсутствии триптона применяют гидролизат казеиновый сухой, а при отсутствии дрожжевого экстракта применяют витаминный пре­парат «ЭКД» сухой.

При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстрак­та вместо дистиллированной воды применяют 1 дм3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II.

Все компоненты, внесенные в 1 дм3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного рас­творения, охлаждают до температуры 50–60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании сухой среды в 1 дм3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганиз­мов или 24 г питательного агара сухого II, добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50–60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют как указано выше.

Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

Перед использованием к 90 см3 расплавленной основы среды добав­ляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембран­ный фильтр растворы: 6,3 см3 раствора глицина, 5 см3 раствора пирува­та натрия; 1 см3 раствора теллурита калия; 5 см3 желточной эмульсии.

Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стериль­ной дистиллированной воде.

После тщательного перемешивания приготовленную среду разлива­ют в чашки Петри. Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

Порядок подготовки к проведению контроля. Приготовление раство­ров и реактивов. Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится со­гласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.

Растворы и реактивы для окраски препаратов готовят по ГОСТ 9225.

Приготовление реактивов для окраски по Грaму. Приготовление реак­тива 1: в 100 см3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.

Приготовление реактива 2: к 96 см3 спиртового раствора йодисто­го калия массовой концентрацией 5 г/дм3 добавляют 2 см3 спиртового раствора основного фуксина массовой концентрацией 50 г/дм3 и 2 см3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм3.

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при темпера­туре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.

Отбор и подготовка проб по ГОСТ 9225.

Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительным обогащением

Подготовка и проведение контроля. Из навески продукта готовят ряд де­сятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было опре­делить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см3 в пробирки или колбы с солевым бульоном.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эк­вивалентным разведенной питательной средой 1:10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний или на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера, желточно-солевой агар или молочно-солевой агар.

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 часов.

После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2–4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний об­разуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2–4 мм, слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1–1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1–3 мм.

С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных коло­ний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, 1 см желточно-солевого агара, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в те­чение 24 часов.

У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus, колоний делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллирован­ной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реакти­ва 1, для окраски по Граму.

Смесь распределяют на участке примерно 1 см2, просушивают при температуре (20 ± 2) °С, фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть-восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведен­ными с лицевой стороны стекла.

Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтро­вальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2 для окрашивания по Граму так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5–1 мин. После окрашива­ния препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушива­ют фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму – красного цвета.

Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

Постановка реакции плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см3 разве­денной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плаз­мой оставляют незасеянной, в другую засеивают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк).

Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температу­ре (37 ± 1) °С в течение 3–6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отри­цательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

++++ – сгусток плотный;

+++ – сгусток, имеющий небольшой отсек;

++ – сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

При получении положительной реакции считают, что в посевах об­наружен Staphylococcus aureus.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Оформление результатов контроля. Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетель­ствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в за­сеянной массе продукта.

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения

Проведение контроля. 1 см3 жидкого продукта или его разведения (см. «Подготовка и проведение контроля» – 1 абзац предыдущего мето­да) наносят на поверхность питательных сред (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод) в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 24–48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (желточно-солевой агар, молочно-солевой агар и агар Байрд-Паркера, см. предыдущий метод). С каж­дой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подо­зрительных колоний Staphylococcus aureus, а в случае роста менее пяти – все колонии, характерные для Staphylococcus aureus, и пере­севают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки (см. желточно-солевой агар), но без добавления хлористо­го натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика как в предыдущем методе.

Обработка результатов контроля. Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Если при изучении характерных колоний в 80 % случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри (см. «Постановка реакции плазмокоагуляции» в предыдущем методе), принадлежат к Staphylococcus aureus. В остальных случаях количество Staphylococcus aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

Оформление результатов контроля. Количество колоний Staphylococ­cus aureus в 1 г или 1 см3 после определения его в определенной наве­ске продукта вычисляют по формуле:

Количество колоний

где Σn1, Σn2 – количество колоний, выросших на всех чашках Петри в пределах одного разведения или засеянного объема; n – число деся­тикратных разведений.

Пример. Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus, выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений: 

1 г или 1 см3 продукта: 84 96 72
10-1 разведение: 9 10 7

 

Подсчитываем количество 1

 

10-1 разведение: 84 96 72
10-2 разведение: 99 10 7

 Подсчитываем количество 2

 


[1] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно ука­занию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[2] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указа­нию на этикетке.

[3] Допускается использовать солевой агар, который готовится согласно ука­занию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

[4] При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм3 дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указа­нию на этикетке.