Фосфатаза инактивируется при температуре пастеризации не ниже 63 °С с выдержкой 30 мин.

Определение фосфатазы по реакции с 4-аминоантипирином (арбитражный метод)

Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кис­лоты ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Выделившийся при гидролизе свободный фенол в присут­ствии окислителя дает розовое окрашивание с 4-аминоантипирином.

Аппаратура, материалы и реактивы:

  • весы лабораторные аналитические;
  • весы лабораторные технические;
  • пробирки стеклянные по ГОСТ 23932, размером 16 х 150 мм;
  • пипетки измерительные вместимостью 5 см3 по ГОСТ 29169;
  • ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147;
  • колба коническая вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770;
  • цилиндр стеклянный вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770;
  • баня водяная;
  • аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х. ч.;
  • аммиак водный по ГОСТ 3760, 25%-ный, ч. д. а.;
  • фенилфосфорной кислоты динатриевая соль двуводная – по действующей технической документации, утвержденной в уста­новленном порядке;
  • 4-аминоантипирин, ч.;
  • цинк сернокислый по ГОСТ 4174, х. ч.;
  • медь сернокислая по ГОСТ 4165, х. ч.;
  • эфир этиловый;
  • вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
  • воронки стеклянные В 56-80 ХУ-1 ГОСТ 25336,
  • колба мерная вместимостью 1000 см3 по ГОСТ 1770;
  • фильтры бумажные диаметром 11 см;
  • бумага индикаторная универсальная (рН 1–10);
  • натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч. или ч. д. а., 1 н. раствор;
  • уголь активированный.

Подготовка к анализу. Молоко пастеризованное, сливки для прове­дения анализа дополнительной подготовки не требуют.

Приготовление основного буферного раствора (рН 10 ± 0,2). 40 г хло­ристого аммония (NН4С1), взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 100–200 см3 дистиллированной воды, добавляют 348 см3 25%-ного водного аммиака (NH4ОН) и доводят до 1 дм3 дис­тиллированной водой.

Приготовление субстрата. Приготовление раствора А: 1,25 г дина­триевой соли фенилфосфорной кислоты (С6Н5О4РNa2), взвешивают с погрешностью на более 0,0002 г, растворяют в 100 см3 основного бу­ферного раствора.

Приготовление раствора Б: 0,8 г 4-аминоантипирина (С11Н11ОN2NН2), взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в 900 см3 дистиллированной воды.

Растворы А и Б должны быть бесцветными и храниться в склянках из темного стекла в холодильнике. Срок хранения не более 1 мес. По­желтевшие растворы для работы непригодны.

Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед опреде­лением фосфатазы смешиванием растворов А и Б (1:9). Рабочий рас­твор пригоден для работы в течение 8 ч при хранении его в склянке из темного стекла.

При необходимости динатриевую соль фенилфосфорной кислоты очищают от свободного фенола промыванием этиловым эфиром до полного удаления фенола. Сушить реактив при комнатной темпера­туре под тягой.

Приготовление осадителя системы цинк-медь. 30 г сульфата цин­ка (ZnSО4 • 7Н2О) и 6 г сульфата меди (CuSO4 • 5Н2O), взвешенных с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды.

Приготовление 1 н. раствора гидроокиси натрия. 40 г кристалличе­ской гидроокиси натрия взвесить с погрешностью не более 0,1 г и рас­творить в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 дм3, доведя объ­ем до метки. Активированный уголь в таблетках растереть в ступке.

Проведение анализа. К 3 см3 молока, сливок добавляют 2 см3 рабо­чего раствора субстрата. Затем перемешивают содержимое пробирки и ставят в водяную баню, нагретую до 40–45 °С на 30 мин. В пробирку, вынутую из водяной бани, добавляют 5 см3 осадителя системы цинк-медь, тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова ставят в водяную баню с температурой 40-45 °С на 10 мин. Вынув пробирку из бани, производят визуальное сравнение содержимого пробирки ис­пытуемого продукта с контрольным опытом.

Контрольным опытом для всех продуктов является аналогичная ре­акция с кипяченым молоком. Если контрольный опыт с кипяченым молоком дает слабо-розовое окрашивание – динатрийфенилфосфат подлежит дополнительной очистке.

Оценка результатов. При отсутствии фермента фосфатазы в молоке окраска содержимого пробирки (раствора, отделившегося от осажден­ного белка) бесцветная, т. е. аналогичная содержимому пробирок кон­трольного опыта. Следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 63 °С.

При наличии фосфатазы в молоке содержимое пробирок (раствор) имеет окрашивание от розового до темно-красного цвета. Следова­тельно, молоко не подвергалось пастеризации или подвергалось па­стеризации при температуре ниже 63 °С, или было смешано с непасте­ризованным молоком.

При оценке реакции учитывается только цвет, но не прозрачность раствора.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление непа­стеризованного молока к пастеризованному: 0,3 % в молоке, сливках.

Определение фосфатазы по реакции с фенолфталеинфосфатом натрия

Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия фермен­том фосфатазой, содержащейся в молоке. Освобождающийся при гид­ролизе фенолфталеин в щелочной среде дает розовое окрашивание.

Аппаратура, материалы и реактивы:

  • весы лабораторные аналитические;
  • весы лабораторные технические;
  • пробирки по ГОСТ 23932;
  • пипетки вместимостью 2 и 5 см3 по ГОСТ 29169;
  • пипетки вместимостью 5 или 10 см3 с ценой деления 0,1 см3 по ГОСТ 29169;
  • капельницы из темного стекла или покрытые черным лаком;
  • колбы мерные вместимостью 250 и 500 см3 по ГОСТ 1770;
  • колбы конические вместимостью 250 см3 по ГОСТ 1770;
  • аммиак водный по ГОСТ 3760, ч. д. а., 1 н. раствор;
  • аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х. ч. или ч. д. а., 1 н. раствор;
  • смесь буферная аммиачная;
  • фенолфталеинфосфат натрия порошкообразный, 10 или 0,1%-ный раствор;
  • вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
  • пробирки стеклянные по ГОСТ 23932 из бесцветного стекла с на­несенными метками на объем 2 см3;
  • пипетки измерительные вместимостью 1 и 2 см3 по ГОСТ 29169;
  • пробки резиновые.

Подготовка к анализу. Приготовление аммиачной буферной смеси. 80 см3 1 н. раствора аммиака смешивают с 20 см3 1 н. раствора хлори­стого аммония (рН 9,8).

Приготовление 0,1%-ного раствора фенолфталеинфосфата натрия. 0,1 г порошкообразного фенолфталеинфосфата натрия, взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в мерной колбе вмести­мостью 100 см3 с небольшим количеством буферной смеси, затем до­ливают буферную смесь до метки и перемешивают.

Проведение анализа. В пробирку отмеривают анализируемый про­дукт, дистиллированную воду и реактив. Количество анализируемого продукта, дистиллированной воды и реактива должно соответствовать указанному в табл. 33.

Таблица 33

Наименование продуктов Количество продукта, см3 Количество дистиллированной воды, см3 Количество раствора фенолфталеинфосфата натрия, см3
Молоко пастеризованное 2 1
Сливки 2 2 1

После добавления дистиллированной воды и реактива содержимое пробирки закрывают пробкой и взбалтывают.

Затем пробирку помещают в водяную баню с температурой воды от 40 до 45 °С и определяют окраску содержимого пробирки через 10 мин и через 1 ч.

Оценка результатов. При отсутствии фермента фосфатазы в молоке окраска содержимого пробирки не изменяется. Следовательно, моло­ко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 63 °С. При на­личии фосфатазы в молоке содержимое пробирки приобретает окраску от светло-розовой до ярко-розовой. Следовательно, молоко не подвер­галось пастеризации или подвергалось пастеризации при температуре ниже 63 °С, или было смешано с непастеризованным молоком.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не ме­нее 2 % непастеризованного молока к пастеризованному.

Метод определения кислой фосфатазы

Кислая фосфатаза инактивируется при температуре пастеризации мо­лока и сливок 85 °С с выдержкой не менее 30 мин, 90 °С с выдержкой не менее 5 мин и кипячении; термической обработки сливок 103 °С с выдержкой 15–20 с.

Метод определения кислой фосфатазы предназначен для контроля эффективности термической обработки.

Сущность метода. Метод основан на свойстве кислой фосфатазы ка­тализировать при рН (4,00 ± 0,05) гидролиз динатриевой соли фенил­фосфорной кислоты с образованием фенола и фосфата натрия. Фенол с 4-аминоантипирином при добавлении осадителя системы цинк-медь в условиях щелочной реакции образует окрашенное соединение, изме­няющее интенсивность окраски от слабо-розовой до темно-вишневой (в зависимости от концентрации фенола). По разнице в интенсив­ности окраски опытных и контрольных проб определяют активность кислой фосфатазы (соблюдены ли режимы термической обработки).

Аппаратура, материалы и реактивы:

  • анализатор потенциометрический с диапазоном измерения 3-4,5 ед. рН, позволяющий измерить рН с погрешностью ± 0,05, по ГОСТ 19881 или ГОСТ 16454;
  • баня водяная с регулируемым подогревом или ультратермостат, обеспечивающие регулирование температуры от 25 до 50 °С, с точностью ±1 °С;
  • бюретки 3-1-25-0,1; 3-2-25-0,1; 3-1-50-0,1; 3-2-50-0,1 по ГОСТ 29251.
  • весы лабораторные общего назначения, 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104;
  • весы лабораторные общего назначения, 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104;
  • воронка В-56-80ХС по ГОСТ 25336;
  • капельница 2-50 ХС по ГОСТ 25336;
  • колбы Кн-2-250-34; 2-250-40; 2-250-50 ХС по ГОСТ 25336;
  • колбы 1-50-2; 1-100-2; 1-250-2; 1-500-2; 1-1000-2; 2-100-2; 2-50-2; 2-250-2; 2-500-2; 2-1000-2 по ГОСТ 1770;
  • пипетки 4-1-1; 4-1-2; 5-1-1; 5-1-2; 6-1-5: 6-1-10; 7-1-5; 7-1-10 по ГОСТ 29169;
  • пробирки П 4-15-14/23, П 2-16-150 ХС по ГОСТ 253364
  • секундомер по нормативному документу;
  • цилиндры 1-50; 1-100; 1-500; 3-50; 3-100 по ГОСТ 1770;
  • штатив для пробирок;
  • бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
  • фольга алюминиевая для упаковки по ГОСТ 745;
  • 4-аминоантипирин, ч.;
  • аммиак 25%-ный водный раствор по ГОСТ 3760, ч. д. а.;
  • вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
  • кислота соляная, 0,1 моль/дм3, фиксанал;
  • кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х. ч.;
  • медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.;
  • метиловый оранжевый, индикатор с массовой долей 0,1 %;
  • натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.;
  • фенилфосфорной кислоты динатриевая соль 2-водная, ч.;
  • цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174, ч.

Подготовка к анализу. Приготовление буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 72 см3 ледяной уксусной кисло­ты, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Затем подщелачивают концентрированным раствором гидроокиси натрия до (3,78 ± 0,05) рН.

Приготовление и хранение раствора динатриевой соли фенилфосфор­ной кислоты и 4-аминоантипирина. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят (0,300 ± 0,001) г динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и (0,021 ± 0,001) г 4-аминоантипирина, 80 см3 дистиллиро­ванной воды, содержимое растворяют, добавляют 10 см3 буферного раствора, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Реактив хранят в темном месте при температуре (20 ± 5) °С не более 2 ч.

Приготовление осадителя системы цинк-медь. В мерную колбу вме­стимостью 1000 см3 вносят (150,00 ± 0,05) г сернокислого цинка и (30,00 ± 0,05) г сернокислой меди, растворяют в дистиллированной во­де, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление 3 моль/дм3 раствора аммиака и определение его кон­центрации. В мерной колбе вместимостью 1000 см3 разбавляют 333 см3 аммиака с массовой долей 25 % до метки дистиллированной водой. Концентрацию раствора аммиака проверяют 0,2 моль/дм3 раствором соляной кислоты, используя в качестве индикатора раствор с массо­вой долей 0,1 % метилового оранжевого. В коническую колбу вносят 1 см3 исследуемого раствора аммиака, 50 см3 дистиллированной воды, 1–2 капли индикатора, перемешивают и титруют 0,2 моль/дм3 соляной кислотой. Концентрацию аммиака устанавливают по формуле:

К = 0,2 А,

где К – молярная концентрация исследуемого раствора аммиака, моль/дм3; 0,2 – молярная концентрация соляной кислоты, моль/дм3; А – объем израсходованной на титрование соляной кислоты, см3.

Раствор аммиака хранят в плотно закупоренной посуде. Перед взя­тием аммиака содержимое бутылки перемешивают.

Проведение анализа. Приготовление опытной пробы. Исследуемое молоко или сливки вносят по 1 см3 в три пробирки. В одну из проби­рок с молоком или сливками добавляют 10 см3 раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и 4-аминоантипирина, перемешива­ют, помещают в водяную баню или ультратермостат с температурой (36 ± 1) °С. Через одинаковые промежутки времени, например 1 мин, вышеуказанную операцию проводят последовательно с остальными двумя пробирками. Продолжительность выдерживания каждой из трех пробирок в водяной бане или ультратермостате, контролируемая по се­кундомеру, составляет 90 мин. Затем вносят из бюретки вместимостью 25 см3 или отмеривают пипеткой по 1 см3 осадителя системы цинк-медь, 0,6 см3 раствора с концентрацией аммиака 3 моль/дм3 через те же промежутки времени, как и при смешивании с раствором соли фе­нилфосфорной кислоты и 4-аминоантипирина, перемешивают после добавления каждого реактива, фильтруют и выдерживают 60 мин при температуре (20 ± 5) °С.

Приготовление контрольной пробы. Контрольную пробу готовят сле­дующим способом: в три пробирки вносят по 10 см3 раствора динатрие­вой соли фенилфосфорной кислоты и 4-аминоантипирина, выдержи­вают подобно опытным пробам при температуре (36 ± 1) ºС 90 мин. Пробирки вынимают из водяной бани или ультратермостата, добавля­ют по 1 см3 осадителя системы цинк-медь, 1 см3 исследуемых молока или сливок и 0,6 см3 раствора с концентрацией аммиака 3 моль/дм3 (перемешивание выполняют после каждой добавки), фильтруют и вы­держивают 60 мин при температуре (20 ± 5) ºС.

Во избежание попадания в содержимое пробирок постороннего фе­нола пробирки типа П2 закрывают фольгой, перемешивание выполня­ется 2-кратным переворачиванием пробирок на 180° и возвращением их в исходное положение.

Оценка результатов. При полной инактивации кислой фосфатазы в молоке или сливках окраска опытных проб не отличается от окра­ски контрольных проб. Следовательно, молоко и сливки подвергались пастеризации при температуре 85 °С с выдержкой не менее 30 мин, 90 °С с выдержкой не менее 5 мин и кипячению; сливки подвергались термической обработке при температуре 103 °С с выдержкой 15–20 с. В зависимости от активности кислой фосфатазы в молоке и сливках окраска опытных проб изменяет цвет от слабо-розового (но более яр­кого, чем окраска контрольных проб) до темно-вишневого. Следова­тельно, наличие активности кислой фосфатазы свидетельствует о не­соблюдении режимов термической обработки.