В бактериологической лаборатории для проведения иссле­дований, хранения реактивов, взятия и транспортирования биологических материалов и других задач используют самую разнообразную посуду. Она может быть изготовлена как из стекла, так и из различных полимерных материалов. Все чаще вместо традиционной стеклянной посуды используют пласти­ковую посуду промышленного изготовления (как правило, од­нократного применения и в индивидуальной упаковке).

Мытье и обработка лабораторной посуды. Посуда для бакте­риологических исследований должна быть чистой и в боль­шинстве случаев стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению искаженных или неправильных результатов. Пластиковая по­суда однократного применения, как правило, поступает в лабораторию чистой, в индивидуальной упаковке и в большин­стве случаев в стерильном виде. Следует ориентироваться на применение такой посуды для ежедневных работ. После использования и дезинфекции пластиковая посуда однократного применения подлежит утилизации.

Для мытья лабораторной посуды многократного примене­ния из стекла и пластмасс в микробиологических лабораториях отводят отдельное помещение – моечную комнату или специальное рабочее мес­то, которое оборуду­ется большой рако­виной с подводом го­рячей и холодной воды, нагревательными приборами – газовой или электрической плитой. В моечной комнате необходимо иметь кастрюли, тазы, ведра, ерши, щет­ки и доски (или пластины из поли­мерных материалов) с колышками для сушки чистой посуды. На дно раковины кладут густую металлическую или инертную полимерную сетку, чтобы предупредить засорение канализации частицами агара, ватой, бумагой, попадающими в воду при мытье посуды. Для мытья посуды может быть использована специальная моечная машина (рис. 5.1), которая также разме­щается в моечной комнате. Мытье лабораторной посуды в такой машине осуществляется в соответствии с инструкцией производителя используемой моечной машины.

В процессе мытья на посуду воздействуют химическими и механическими факторами. К числу последних относится уда­ление загрязнений с помощью щеток и ершей. При отсутствии ершей или невозможности их использования, например в случае несоответствия ерша размеру сосуда, посуду моют с помо­щью мелко нарезанных кусочков бумаги. При этом загрязне­ние, имеющееся на внутренних стенках, удаляется механичес­ки. Наилучшие результаты мытья посуды отмечаются в тех случаях, когда воздействие механических факторов сочетается с действием химических веществ. Поэтому ерши, которыми моют посуду, предварительно погружают в соду, полужидкое мыло, мыльный раствор или раствор моющего средства. Для мытья посуды не следует применять абразивные материалы, царапающие стекло, так как поцарапанное стекло утрачивает присущую ему прочность и во время стерилизации на месте едва заметных изъянов – царапин – могут образоваться трещины, посуда может разрушиться. Для мытья посуды необхо­димо применять нейтральные моющие средства, лучше всего жидкое моющее средство "Прогресс". Можно также использовать нейтральные синтетические моющие средства, не содер­жащие биодобавок (например, "Лотос", "Кристалл", "Эра").

Надписи, сделанные на стекле восковым карандашом или маркером, удаляются щеткой либо кусочком влажной марли с меловым порошком или содой.

Для устранения налета белого цвета, нередко появляюще­гося на стекле, посуду помещают на 30–40 мин в 5–10 % раствор хлористоводородной кислоты.

Сильно загрязненную стеклянную посуду со следами жиро­вых отложений обрабатывают в хромовой смеси. Хромовая смесь, будучи сильным окислителем, разрушает органические вещества с образованием растворимых в воде или газообразных продуктов. Перед использованием хромовую смесь подогрева­ют до температуры 45–50 °С, а затем заливают ею загрязнен­ную посуду.

Мытье новой лабораторной посуды из стекла. Новую посуду из стекла перед использованием моют мыльной водой или 0,5 % раствором моющего средства. После этого посуду опо­ласкивают проточной водопроводной водой и кипятят в 1– 2 % растворе соляной кислоты в течение 15–20 мин. После кипячения в растворе кислоты посуду прополаскивают водо­проводной, а затем дистиллированной водой.

При мытье стеклянной посуды, предназначенной для поста­новки серологических реакций, кислоты и щелочи использо­вать не следует, так как даже следовые количества этих ве­ществ, оставшиеся на стенках, могут исказить результат реак­ции. Такую посуду моют горячей водой, кладут на сетки, чтобы из нее стекла вода, затем несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу.

Мытье и обработка посуды, бывшей в употреблении. Загряз­ненная посуда, а также посуда, в которой содержался инфи­цированный материал, поступает в мойку после предваритель­ной дезинфекции, гарантирующей гибель находящихся в ней патогенных микроорганизмов. Загрязненная посуда помещает­ся в специальные биксы или ведра с крышками, после чего автоклавируется при 126 °С в течение 60 мин или при 132 °С в течение 20 мин. Нельзя освобождать от содержимого исполь­зованную посуду без предварительного обеззараживания. В ис­ключительных случаях допускается обеззараживание материа­лов кипячением в 2 % растворе пищевой соды или 0,5 % рас­творе нейтрального моющего средства в течение 60 мин с момента закипания. Кипячение в этом случае должно проис­ходить в закрытой емкости с полным погружением в раствор. Отработанные пипетки обеззараживают в высоком сосуде с полным погружением в дезинфицирующий раствор. Продол­жительность обеззараживания зависит от типа применяемого дезсредства.

При выборе методов обеззараживания следует руководствоваться СП 1.2.731–99 "Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности и гельминтами". Допускают­ся также к использованию новые дезинфицирующие средства, получившие разрешение Министерства здравоохранения РФ на применение. В этих случаях следует руководствоваться ре­комендациями производителя.

Перед мытьем из пробирок, чашек, матрацев и т.п. обезза­раженные материалы по возможности выливают в канализа­цию. Для облегчения дальнейшего процесса мытья после автоклавирования обеззараженную посуду замачивают в 1 % растворе моющего средства "Прогресс" в горячей воде на 1–2 ч, тщательно промывают при помощи щеток и ершей и ополас­кивают в проточной водопроводной воде (8–10 раз при ис­пользовании моющего средства "Прогресс" и до 15 раз при использовании других средств). Не слишком загрязненную по­суду моют ершом в горячей воде с мылом или содой. Посуду со следами агара, желатина или иных компонентов питатель­ных сред за сутки перед мытьем можно залить 2–5 % раство­ром едкого натра или едкого кали. Очень загрязненную жир­ную посуду, не поддающуюся мытью обычным способом, сле­дует залить на 30–40 мин хромовой смесью, а затем обильно промыть проточной водопроводной водой и ополоснуть дис­тиллированной водой (3–4 раза). Затем посуду сушат при комнатной температуре или в сушильном шкафу.

Мытье градуированной посуды. Градуированная посуда долж­на быть абсолютно чистой и хорошо обезжиренной. На стенках плохо обезжиренной посуды при вливании в нее жидкости остается большое количество капель, вследствие чего слитый объем жидкости не будет соответствовать той величине, кото­рая указана на шкале деления. Это особенно важно при мытье градуированных пипеток объемом 1–2 мл и менее.

Мытье новых, не бывших в употреблении, градуированных пипеток нужно проводить следующим образом. С помощью резинового баллона, надетого на пипетку, всасывают в нее горячую мыльную воду, а затем помещают пипетку целиком в сосуд с таким же мыльным раствором. Чтобы вода из пипеток не вытекала, уровень жидкости в сосуде должен соответство­вать высоте пипеток. Выдержав пипетки в мыльном растворе в течение 20–30 мин, их следует прополоснуть проточной водопроводной водой и перенести в сосуд с 1–2 % раствором соляной кислоты. Сосуд затем нужно поставить на слабый нагрев и постепенно довести раствор до кипения. Затем пи­петки обрабатывают аналогично остальной стеклянной посуде.

Перед мытьем бывших в употреблении обеззараженных пи­петок из них удаляют "ватики" (внутреннюю поверхность пи­петок можно протереть при помощи плотно накрученного на конец тонкой упругой проволоки кусочка ваты или марли в виде оливы, закупорившийся канал пипетки прочищают мандреном от тонких игл шприцев или тонкой упругой проволо­кой), промывают теплой водопроводной водой под давлением и кипятят в 1% растворе бикарбоната натрия в течение 45 мин, многократно промывают водопроводной, затем дистиллиро­ванной водой. После этого пипетки высушивают, вставляют новые "ватики" и, поместив в оберточную бумагу или пенал, стерилизуют в суховоздушном стерилизаторе.

Сильно загрязненные пипетки также очищают вначале ер­шом с раствором моющего средства или соды, а затем погру­жают в хромовую смесь, налитую в ванночку или высокий сосуд. Объем смеси по высоте должен соответствовать длине обрабатываемых пипеток. В хромовой смеси пипетки выдер­живают 20–30 мин, затем в течение нескольких минут промы­вают проточной и дважды ополаскивают дистиллированной водой.

Для наиболее ответственных работ можно также использо­вать импортные градуированные пипетки однократного при­менения из пластмасс. Такие пипетки, как правило, упакованы индивидуально и уже простерилизованы производителем при помощи ионизирующего излучения.

Мытье предметных и покровных стекол. Предметные и покров­ные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжирен­ную поверхность стекла, растекается равномерно. Если же стекло недостаточно обезжирено, то капля распадается на мно­жество мелких капель. Предметные и покровные стекла реко­мендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи.

Покровные и предметные стекла, не бывшие в употребле­нии, моют в теплой мыльной воде и после ополаскивания заливают смесью Никифорова. Если стекла, вынутые через 2–3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, то их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2–5 % раство­ром гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый нагрев и кипятят в течение 20–30 мин после закипания. Затем стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опус­кают на 10–15 мин в 5–10 % раствор хлористоводородной кислоты и затем промывают проточной водой.

Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении и загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабаты­вают следующим образом:

• опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой;
• заливают стекла 5 % раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкий натр или едкое кали), ставят на слабый нагрев и кипятят в течение 30–40 мин.

Силиконирование лабораторной посуды. Силиконирование посуды, пробок и т.п. осуществляют с целью придания поверхности посуды водоотталкивающих (парафиноподобных) свойств. Тщательно вымытую и обезжиренную посуду высуши­вают и при комнатной температуре заливают на несколько Минут раствором силиконовой эмульсии (например, КЭ-10-16, ПМС-200А или ПМС-400, с массовой долей силикона 0,05– 0,5 %). После этого жидкость сливают (силиконовую эмульсию можно использовать многократно) и подсушивают посуду в речение 20–30 мин при комнатной температуре. При этом на поверхности стекла образуется тончайшая органосиликоновая Пленка с хорошими гидрофобными свойствами. Обработанную таким образом посуду помещают на 1,5 ч в сушильный шкаф при температуре 120–140 °С. Затем промывают посуду дистил­лированной водой и сушат в течение 1,5 ч при указанных выше условиях. После этого посуда готова к использованию. Пленка не смывается водой и не разрушается кислотами. Для ее уда­ления необходимо в течение 2 ч кипятить посуду в 10 % рас­творе щелочи. Качество силиконирования во многом зависит от качества мытья посуды и ее обезжиривания. Работу по силиконированию посуды проводят в лабораторном вытяжном шкафу.

Обработка резиновых пробок. Новые пробки кипятят 30 мин в 2 % растворе бикарбоната натрия, многократно промывают горячей проточной водопроводной водой (кипячение и промы­вание проводят дважды). Затем пробки кипятят 30 мин в дис­тиллированной воде, промывают и высушивают.

Пробки, бывшие в употреблении, после кипячения в 2 % растворе бикарбоната натрия ополаскивают проточной водо­проводной водой, кипятят 30 мин в дистиллированной воде, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают.

Резиновые пробки для флаконов заворачивают в крафт-бу­магу (или плотную упаковочную бумагу) либо фольгу и стери­лизуют автоклавированием.

Проверка качества мытья лабораторной посуды. Контроль чистоты мытья посуды осуществляют путем осмотра и выбо­рочного проведения тестов. Стекло вымытой и высушенной посуды должно быть прозрачным, без подтеков, пятен и по­сторонних включений. Перед сушкой для проверки чистоты посуды ее ополаскивают водой. Вода должна стекать, оставляя на поверхности стекла равномерную пленку. Плохо обезжирен­ную посуду обязательно моют повторно. Наличие остаточных жировых загрязнений может быть определено при помощи реактива, содержащего судан III (в 70 мл 90 % этилового спир­та, нагретого до 60 °С, растворяют по 0,2 г измельченной краски судан III и метиленового синего, затем добавляют 10 мл 20–25 % раствора аммиака, 20 мл дистиллированной воды и взбалтывают; такой раствор пригоден для использования в течение 6 мес.). Для этого внутреннюю поверхность вымытой и подсушенной посуды смачивают 3–5 мл красящего раствора, распределяют его по исследуемой поверхности в течение 10 с, затем быстро смывают обильной струей воды. На внутренней поверхности посуды не должно оставаться желтых пятен и подтеков.

При обработке и мытье стеклянной посуды используются моющие и дезинфицирующие средства, содержащие вещества, которые могут повлиять на рост микроорганизмов, поэтому контроль на наличие остаточных количеств моющих средств также имеет большое значение. Качество удаления моющих и моюще-дезинфицирующих средств оценивают по величине рН. Для этих целей используют рН-индикаторную бумагу с шагом измерительного диапазона не более 0,3 единицы. Предвари­тельно определяют рН воды, применяемой для ополаскивания посуды на конечном этапе. Контрольные измерения рН про­водят путем прикладывания рН-индикаторной бумаги к по­верхности вымытого мокрого стекла, прошедшего обработку. Для контроля произвольно выбирают 3–10 емкостей. Значение рН воды, полученное в результате контроля, должно соответ­ствовать рН дистиллированной воды, применяемой для опо­ласкивания.

При использовании нового моющего средства методика проверки качества мытья посуды от моющих средств и подбор режима мытья посуды осуществляется в соответствии со стандартом ИСО 9998:1991Е.

Сушка и хранение чистой лабораторной посуды. Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре (хо­лодная сушка) или горячим воздухом в сушильном шкафу при температуре 80–105 °С. Для холодной сушки в лаборатории используются специальные доски из дерева или пластмассы с колышками, прикрепленными к ним под углом. Высушенную посуду просматривают на свет, поверхность стекла должна быть совершенно прозрачной, без матового налета и пятен.

Чисто вымытую и высушенную посуду, закрытую ватно-марлевыми (с бумажными колпачками или без них), резино­выми, силиконовыми пробками или металлическими крышка­ми-колпачками, хранят в местах, надежно защищенных от пыли. Для этих целей лучше всего подходят шкафы с плотно закрывающимися дверцами, ящики столов. Для размещения чистой сухой посуды на полках шкафов можно использовать фанерные ящики или клееные коробки из плотного картона, внутрь которых следует положить фильтровальную бумагу. По­суду также следует укрыть фильтровальной бумагой от попада­ния пыли и грязи.

Стерилизация и подготовка лабораторной посуды к использо­ванию. Лабораторную посуду (флаконы, пробирки, бутыли, колбы и т.п.) закрывают пробками, поверх которых надевают бумажные (или фольгированные) колпачки. Колпачки обвязы­вают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновым кольцом. Перед стерилизацией чистую посуду при необходи­мости монтируют в крафт-бумагу (плотную оберточную бума­гу). Чашки Петри и пипетки стерилизуют, завернув в оберточ­ную или крафт-бумагу, либо в пеналах.

При выборе режима стерилизации специальной посуды и расходных материалов (флаконы с завинчивающимися проб­ками, металлические или силиконовые колпачки, выдержи­вающие автоклавирование, микробиологические пробки много­кратного применения и другие материалы) следует руководст­воваться рекомендациями производителя.

Стерилизацию посуды осуществляют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в течение 2 ч (или 180 °С в течение 60 мин) или текучим паром под давлением (1 атм) при темпе­ратуре 121 °С в течение 30 мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу при отсутствии в автоклаве вакуумной сушки.

После стерилизации посуду хранят до использования в за­крытом шкафу или ящиках с крышками не более 10 сут при ненарушенной упаковке или невскрытом пенале.

Контроль обсемененности лабораторной посуды для отбора проб. Цель – выборочный контроль качества подготовки посу­ды в отношении различных по устойчивости микроорганизмов, учитываемых при проведении анализа. При проведении кон­троля режимов суховоздушной стерилизации в полном объеме биологический, термический, химический) с рекомендуемой периодичностью контроль обсемененности стеклянных флако­нов для отбора проб в зависимости от объема стерилизуемых партий проводят не реже 1 раза в квартал. Контролю подвер­гаются все емкости, используемые для отбора проб: стеклян­ные многоразового использования после стерилизации, а также пластиковые одноразового использования, поступающие в сте­рильном виде от производителя. Контролируется общая обсемененность (стерильность) посуды и наличие спор сульфитредуцирующих клостридий.

Условия проведения испытаний в значительной мере обу­словливают качество данного вида контроля. В связи с этим его неотъемлемой частью является следующий комплекс меро­приятий:

• анализ проводят в боксе для разливки сред или в посевных комнатах (боксах);
• непосредственно перед исследованием проводят дезинфек­ционную обработку помещения (мытье бокса). После дез-обработки включают дополнительно бактерицидные лампы на 1,5–2 ч;
• спецодежду для проведения анализа (халат, шапочку, четырехслойную марлевую маску) стерилизуют. Режим стерили­зации спецодежды: автоклавирование при 120±1 °С в тече­ние 45 мин или при 132±2 °С в течение 20 мин.

Перед входом в бокс сотрудник, проводящий испытания, тщательно моет руки теплой водой с мылом и щеткой, выти­рает их стерильным полотенцем, надевает стерильный халат, шапочку, маску, надевает перчатки, обрабатывает их 70 % эти­ловым спиртом. При наличии ламинарного бокса исследование выполняют в спецодежде с использованием стерильных перча­ток.

Во время испытаний обязательно проводят контроль воздуха на обсемененность микроорганизмами.

Для каждого вида анализа отбирают не менее 1 % флаконов от общего количества партии простерилизованной посуды. Партией флаконов считают все флаконы, прошедшие стерили­зацию за один цикл работы одного стерилизатора.

В случае получения результата, свидетельствующего о не­стерильности хотя бы одного флакона, все партии флаконов, прошедшие обработку в данном стерилизаторе, бракуют. За­бракованные партии флаконов подлежат повторной стерили­зации. Выясняют возможные причины нарушения стерильнос­ти. Проводят комплексную проверку стерилизатора с одновре­менным использованием химического, термического (в 5 точ­ках) и биологического контроля.

При проведении контроля используются следующие мате­риалы:

• жидкая полноценная неселективная среда (питательный бу­льон, ГРМ-бульон и др.) проверенной ранее серии;
• плотная полноценная неселективная среда (питательный агар, ГРМ-агар и др.) проверенной ранее серии;
• железосульфитный агар, приготовленный согласно МУК 4.2.10181–01, либо зарубежные аналоги;
• стерильные чашки Петри диаметром 90 мм;
• стерильная водопроводная вода;
• спирт ректификат 96° для фламбирования;
• спирт ректификат 70° для дезинфекции.

Питательный бульон предварительно проверяют на стериль­ность. Для этого две пробирки от приготовленной партии бульона инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч – учитывают наличие (отсутствие) пророста среды. При наличии пророста партию среды выбраковывают. Контроль стерильнос­ти питательного агара и железосульфитного агара проводят в процессе исследования путем постановки отрицательного кон­троля.

Контроль на общую обсемененность. В исследуемые флаконы вносят питательный бульон в количестве 20 % от объема флакона (например, во флакон 500 мл вносят 100 мл бульона). Флаконы закрывают стерильными резиновыми (силиконовы­ми) пробками. Переворачиванием или встряхиванием флако­нов трехкратно омывают всю внутреннюю поверхность флако­на, включая пробку. Инкубацию посевов проводят в этих же флаконах при температуре 37±1 °С в течение 48±2 ч. При ви­димом росте (помутнение бульона) в каком-либо флаконе ре­зультат учитывают как "не стерильно". При сохранении про­зрачности бульона проводят контроль пророста бульона: из каждого флакона отбирают по 1 мл содержимого, вносят в две Стерильные чашки Петри и заливают питательным агаром. Параллельно для контроля стерильности используемого пита­тельного агара стерильную чашку Петри заливают тем же пи­тательным агаром (отрицательный контроль). Чашки с посева­ми инкубируют при 37 °С в течение 48 ч. Наличие пророста при условии отсутствия роста микроорганизмов в отрицатель­ном контроле свидетельствует о нестерильности флакона. Ре­зультаты заносят в протокол исследования.

Контроль на наличие спор сульфитредуцирующих клостридий проводят при помощи мембранной фильтрации. В исследуемые флаконы вносят стерильную водопроводную воду в количестве 20 % от объема флакона, флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками. Переворачиванием или встряхиванием флаконов трехкратно омывают (смачивают) всю внутреннюю Поверхность флакона, включая пробку. Фильтровальную уста­новку фламбируют, после чего производят фильтрацию 100 мл стерильной водопроводной воды (отрицательный контроль), затем через другой мембранный фильтр без дополнительного обжига установки фильтруют весь объем смыва с флакона. Дальнейшие исследования обоих фильтров (смыва и контроля) выполняют аналогично по схеме анализа на выявление спор сульфитредуцирующих клостридий согласно МУК 4.2.1018–01. Наличие роста колоний клостридий при отсутствии роста в отрицательном контроле свидетельствует о нестерильности флакона. Результаты заносят в протокол исследования.