Рождение генетики бактерий можно датировать 1943 г., ког­да появилась публикация Лурия и Дельбрюка "Мутации, в результате которых бактерии, чувствительные к вирусу, приоб­ретают к нему устойчивость". В ней впервые было описано, как ставить эксперименты на бактериях, учитывать результаты и давать им оценку.

Бактерии обладают рядом важных преимуществ перед дру­гими организмами. Многие из них легко культивируются в лабораторных условиях на сравнительно простых питательных средах. Крайне важно, что они размножаются очень быстро, и работать с бактериями, делящимися каждые 20–40 мин, гораз­до легче, чем, например, с растениями, дающими одно-два поколения в год. Бактерии содержат гаплоидный (одинарный) набор генов, благодаря чему обнаружение у них мутаций (лат. mulatio – изменение) не представляет особых трудностей: большинство мутаций являются рецессивными (лат. recessus – углубление) и у диплоидных организмов их невозможно обна­ружить в присутствии генов дикого (нормального) типа.

Успешному развитию генетики бактерий предшествовало открытие, продемонстрировавшее, что носителем генетической информации является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Первооткрывателем роли нуклеиновой кислоты был Гриффит, который в 1928 г. описал явление трансформации – переноса наследственных признаков от капсульных вирулентных пнев­мококков, убитых при нагревании, к живым бескапсульным клеткам пневмококков, не обладающим вирулентностью. Ак­тивным началом в этом процессе, по его данным, являлась ДНК. Подтверждение этого вывода было получено Эвери, Мак-Леодом и Мак-Карти в 1944 г., использовавшими очи­щенные от примесей препараты ДНК для трансформации пнев­мококков. Затем Херши и Чейз в 1952 г. показали, что при заражении бактерий вирусом (бактериофагом) в бактериальную клетку проникает лишь ДНК фага, которая обеспечивает раз­множение фага и сохранение в потомстве всех его наследст­венных признаков. После этих открытий количество работ с бактериями стало нарастать и уже в 50-е годы были открыты такие явления у бактерий, как конъюгация, лизогения и транс-дукция, создана модель структуры ДНК, сформулирована про­блема генетического кода. Это сыграло важную роль в решении многих фундаментальных проблем молекулярной генетики.

Структура ДНК и генетический код. Дезоксирибонуклеино­вая кислота состоит из последовательности химически связан­ных нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит гетероцикли­ческое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основа­ние), пятиуглеродное кольцо (пентозу) и фосфатную группу. Азотистые основания делятся на два типа – пиримидиновые и пуриновые. Каждая нуклеиновая кислота синтезируется только из четырех оснований: двух пиримидиновых (цитозина и ти-мина) и двух пуриновых (гуанина и аденина). Рибонуклеиновая кислота (РНК) отличается от ДНК наличием урацила вместо тимина. Основания обозначают начальными буквами: ДНК содержит А, С, G, Т, а РНК - А, С, О, U.

В 1953 г. Уотсон и Крик создали модель структуры ДНК, согласно которой ДНК имеет форму правильной двойной спи­рали из закрученных одна вокруг другой полинуклеотидных цепей. Разные молекулы ДНК имеют различную последова­тельность пар оснований, что не оказывает влияния на структуру спирали ДНК.

Последовательность оснований в ДНК кодирует последова­тельность аминокислот в белке. Кроме последовательностей, кодирующих белки, в ДНК содержатся специфические облас­ти, которые функционируют как регуляторные зоны, узнавае­мые обычно белковыми регуляторными молекулами.

Взаимоотношения между последовательностью нуклеотидов в гене и последовательностью аминокислот в белке устанавли­ваются с помощью генетического кода. Каждой аминокислоте соответствует последовательность из трех нуклеотидов (три­плет), называемая кодоном. Последовательности кодонов считываются непрерывно, начиная с фиксированной стартовой точки на одном конце гена и заканчивая точкой терминации на другом конце гена. Это значит, что различные части гена не могут читаться независимо. Первая ступень экспрессии гена состоит в образовании мРНК (матричной, или информацион­ной, РНК), копирующей одну из двух цепей ДНК. Синтез одноцепочечной мРНК на ДНК называют транскрипцией. Об­разованная мРНК используется в качестве матрицы, по кото­рой аминокислоты собираются в полипептидную цепь. Этот процесс получил название трансляции.

Мутационный процесс. Изменчивость организмов является одним из главных факторов эволюции. Она служит источни­ком для отбора форм, наиболее приспособленных к условиям существования. Причиной изменчивости являются мутации, различные типы геномных перестроек – инверсии (переворо­ты), делеции (нехватки), дупликации и амплификации (умно­жения) генов, транспозиции (перемещения), горизонтальный перенос генов.

Термин "мутация" впервые был предложен Гуго де Фризом в его классическом труде "Мутационная теория" (1901–1903), в котором он так назвал явление скачкообразного изменения наследственного признака.

Чисто условно мутации делят на спонтанные и индуцирован­ные. В тех случаях, когда мутации возникают без преднамерен­ного экспериментального воздействия, под влиянием природных факторов или в результате физиологических изменений в са­мом организме, их относят к спонтанным мутациям. Мутации, возникающие под влиянием специальных воздействий (УФ-света, ионизирующей радиации, химических веществ, темпера­туры и т.п.), называют индуцированными. Принципиальных различий между спонтанными и индуцированными мутациями нет, но именно изучение последних позволило биологам раз­гадать многие тайны гена.

Мутации от состояния дикого типа к новому состоянию называют прямыми, а от мутантного к дикому–обратными. Прямые мутации часто являются рецессивными, что можно увидеть при совмещении их в одной клетке с генами дикого типа (в этом случае мутантный фенотип не будет проявляться), а обратные – доминантными. В ряде случаев обратная мутация представляет собой не истинную мутацию к исходному состо­янию гена, а имитируется прямой мутацией в другом гене, который приобретает способность подавлять проявление эф­фекта первой мутации. Такие мутации называют супрессорны-ми, а гены – супрессорами.

После того как было установлено, что наследственное ве­щество в живых организмах, включая бактерии и многие ви­русы, – это не что иное, как ДНК, исследование природы мутаций стало проводиться на основе "молекулярного" пред­ставления о гене как о полинуклеотидной цепи, последователь­ность оснований в которой определяет последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Эти исследования приве­ли к пониманию молекулярной природы мутаций и созданию на этой основе классификации мутаций.

Мутанты, фенотипы которых обусловлены изменением од­ной нуклеотидной пары, получили название точечных. Они могут возникать в результате замены одного пуринового осно­вания на другое, так называемых транзиций, либо в результате трансверсий, при которых одно из пиримидиновых оснований в полинуклеотидной цепи ДНК заменяется пуриновым "или, наоборот, пуриновое основание заменяется пиримидиновым. Другие типы встречающихся мутаций у бактерий – это деле­ции, приводящие к утрате незначительного количества пар оснований или протяженных участков ДНК, и вставки (инсерции) коротких или протяженных последовательностей ДНК. Делеции и вставки могут приводить к сдвигу "рамки считыва­ния" генетического кода, т.е. к изменению всех последующих кодонов.

В клетках бактерий имеются механизмы, способные пол­ностью или частично восстанавливать структуру поврежденной ДНК. Совокупности ферментов, участвующих в исправлении повреждений в ДНК, составляют системы репарации, разли­чающиеся биохимическими механизмами. У бактерий были описаны различные ферментные системы репарации: фотореактивация и фотопротекция, темновая репарация, ультрафио­летовая реактивация и многие виды так называемых непрямых реактиваций. В 1975 г. Радман и Виткин сформулировали идею об индуцибельной системе репарации, обозначенной как SOS-репарация, которая осуществляется в пострепликативных про­цессах и обладает склонностью к индукции мутаций. Причи­ной появления мутаций является то, что полимераза (фермент, участвующий в синтезе ДНК) не обеспечивает нормального синтеза ДНК в брешах, возникающих в новых нитях дочерних молекул ДНК в местах, противостоящих тем местам, где лока­лизованы повреждения.

Рекомбинации у бактерий. В современных исследованиях по молекулярной генетике кишечная палочка (Е. coli) занимает одно из первых мест. Палочковидная клетка снаружи одета жесткой оболочкой, под которой находится тонкая цитоплазматическая мембрана. Содержимое клетки представлено про­топлазмой, состоящей из цитоплазмы и включенных в нее молекул ДНК. Клетки гаплоидны и содержат по одной хромо­соме. Хромосома представляет собой кольцевую нить ДНК длиной около 1300 мкм, которая в клетке многократно свер­нута и плотно "упакована". По меньшей мере в одной точке хромосома фиксирована на цитоплазматической мембране, от которой и начинается процесс репликации, идущий в обоих направлениях до встречи примерно посередине хромосомного кольца. На репликацию хромосомы у кишечной палочки ухо­дит примерно 20 мин, после чего хромосомы расходятся и между ними начинает расти перегородка. Затем вновь образо­вавшиеся две клетки отделяются друг от друга. Кишечная па­лочка может жить и размножаться на самой простой питатель­ной среде, что делает ее в высшей степени неприхотливым лабораторным объектом.

Доказательство существования рекомбинаций у бактерий было связано с открытием наличия у них полового процесса, а также с изучением явлений трансформации, трансдукции и лизогении.

Метод обнаружения рекомбинаций у бактерий (обмена между гомологичными последовательностями ДНК) состоит в том, что клетки двух линий, каждая из которых обладает своей ауксотрофной мутацией, выращиваются в смеси на минималь­ной среде, на которой смогут образовать колонии лишь реком-бинанты, восстановившие в результате рекомбинации хромо­сому дикого типа, а все клетки ауксотрофов будут гибнуть. Для большей точности экспериментов используют множественные ауксотрофы, т.е. линии бактерий, несущие два или более мутантных гена (рис. 13.1). Появление в таких опытах прототро-фов – это свидетельство того, что хромосомы вступают между собой в контакт и обмениваются своими участками. Только таким образом могли возникнуть формы, содержащие в своих хромосомах все необходимые для реализации прототрофности компоненты генетического материала, которые первоначально находились в разных клетках. С помощью такого рода экспе­риментов были получены доказательства наличия полового про­цесса и обмена материалом между гомологичными участками ДНК у бактерий.

Рис. 13.1. Классические опыты по генетическому скрещиванию двух мутантных штаммов Е.coli К12, проведенных Ледербергом и Татумом.

Конъюгация у бактерий. В основе полового процесса у бак­терий лежит конъюгация клеток. Это явление выражается в возникновении временной связи между клетками посредством образования цитоплазматического мостика. Такая связь созда­ет условия для проникновения генетического материала из одной клетки бактерии в другую. В 1952 г. Хейс обнаружил, что при конъюгации одна из клеток выполняет функции до­нора, а другая – реципиента. Донорские клетки характеризу­ются наличием у них полового фактора F⁺, находящегося в клетке либо в виде отдельной от хромосомы самореплицирую­щейся плазмидной ДНК, либо в интегрированном с хромосо­мой состоянии. При конъюгации автономный фактор F⁺ пере­ходит в клетку реципиента, превращая ее в донорскую, или "мужскую", клетку. Однако, когда фактор F⁺ в клетке интег­рируется с ее хромосомой, при конъюгации в клетки реципи­ента через цитоплазматический мостик начинает проникать хромосома, обусловливая появление определенных типов рекомбинантов с высокой частотой. Такие доноры получили название Hfr (от англ. High frequency of recombination). Вначале явление конъюгации клеток бактерий получило доказательство в генетических экспериментах, показавших существование ре­комбинации, а затем оно получило подтверждение в электрон­но-микроскопических исследованиях.

Для того чтобы узнать, как бактерии обмениваются между собой генами, Жакоб и Вольман разработали метод анализа, включающий прерывание конъюгации бактерий в разные сроки после ее начала. Прерывание осуществляли механически при встряхивании смеси бактерий в гомогенизаторе. Такая обработка разъединяет конъюгирующие бактерии, цитоплазматический мостик разрушается, при этом разрывается и нить ДНК, передающаяся через него из клетки Hfr-донора в клетку F^-. В результате возникает зигота, содержащая хромосому ре-ципиентной клетки и часть хромосомы донора. Такие клетки в отличие от обычных диплоидных зигот получили название мерозигот. Было открыто, что разные гены последовательно переходят из "мужских" в "женские" клетки бактерий в разное, вполне определенное время. Это обусловлено тем, что специ­фический конец хромосомы бактерий Hfr входит в клетку реципиента и постепенно втягивает туда те гены, которые локализованы за ним по длине хромосомы. Таким образом можно определить последовательность расположения генов и расстояние между ними, измеренное в данном случае време­нем, проходящим от начала внедрения в клетку сначала одно­го, а потом следующего гена (рис. 13.2). Поскольку фактор F⁺ способен включаться в разные участки хромосомы, были вы­делены разные Hfr-штаммы, различающиеся точками начала переноса хромосом при конъюгации. Исследования группы линий Hfr привели Жакоба и Вольмана к открытию кольцевого строения хромосомы у Е. coli. Изучение последовательности расположения генов при переходе хромосомы бактерии Hfr в клетку F^- времени прохождения фрагментов разной длины при прерывании конъюгации с учетом частоты образования рекомбинантов различных классов позволило составить гене­тическую карту хромосомы Е. coli (рис. 13.3).

Рис. 13.2. Первая карта участка хромосомы Е.соli, построенная Жакобом и Вольманом в 1964 г. на основании определения времени переноса соответствующего гена из донорской клетки в реципиентную.

Рис. 13.3. Первая кольцевая карта хро­мосомы Е. coli, пост­роенная на основании сравнительного изуче­ния частоты перено­са участков хромосо­мы разными донор­скими штаммами Нfr. На карте показана по­следовательность распо­ложения генов без ука­зания расстояний между ними. Символами 82, л, 381, 21 и 424 обозначе­ны участки внедрений профагов разных уме­ренных фагов, тремя буквами – гены бакте­рий, контролирующие различные метаболичес­кие функции.

Трансформация. Генетическая рекомбинация происходит не только при "половом" процессе у бактерий, но и при транс­формации. В случае трансформации материал природной ДНК проникает в клетки в качестве свободных фрагментов. Сразу же после поглощения ДНК клетками начинаются ее преобра­зования, предшествующие ее рекомбинации с хромосомой. До­казано, что у некоторых видов бактерий эти преобразования сводятся к разрывам ДНК на более короткие фрагменты и к последующему расплетанию двунитевой ДНК на однонитевые участки. Затем такие нити образуют синапс с гомологичными участками хромосомы реципиента и рекомбинируют с ними, замещая одну из нитей ДНК хромосомы в соответствующем месте. В момент замещения хромосома в определенном участке имеет одну свою и одну чужую нить ДНК. При последующей репликации происходит образование двух новых нитей на сво­ей и чужой матрице. Отражением этого процесса является то обстоятельство, что в колонии, выросшей из клетки-трансфор-манта, содержится обычно смесь рекомбинантных клеток, на­следовавших признаки обоих родительских штаммов, с исход­ными реципиентными клетками.

Впервые явление трансформации было обнаружено Гриф­фитом в 1928 г. на пневмококках. Впоследствии оно было открыто и у других микроорганизмов. Трансформация у бак­терий может происходить не только в пределах одного и того же вида, но и между разными видами. Однако, чем дальше отстоит один вид от другого в таксономическом отношении, тем меньше частота межвидовой трансформации.

При обычных способах выделения и очистки трансформирующей ДНК молекулярная масса образующихся фрагментов равна 5 × 10⁶– 10⁷ Д.

Напомним, что молекулярная масса целой хромосомы бак­териальной клетки равна 2 × 10⁹ – 4 × 10⁹ Д. Таким образом, при трансформации клетка поглощает менее 1 % всего генома донора. Поэтому генетические карты, построенные посредст­вом трансформации, показывают последовательность располо­жения генов лишь на небольших участках бактериальных хро­мосом.

К трансформации примыкают некоторые явления, в основе которых также лежит поглощение ДНК бактериальной клет­кой. Одно из них – явление трансфекции, когда клетки погло­щают искусственно выделенную фаговую ДНК. В результате в клетке начинается развитие фага с последующим лизисом клет­ки и освобождением зрелых фаговых частиц. Таким же путем можно ввести в бактерию плазмидную ДНК, передать рекомбинантную ДНК, сконструированную генно-инженерными ме­тодами, и, следовательно, передать в живую бактериальную клетку ДНК самого разного происхождения.

Лизогения и трансдукция. У бактерий обнаружены бактерио­фаги двух типов – вирулентные и умеренные. Первые после размножения в клетках бактерий приводят к их лизису. Они существуют только или в вегетативном (размножение в клетках бактерий), или в зрелом (метаболически инертное состояние вне бактериальных клеток) состоянии. Умеренные бактерио­фаги обладают способностью, кроме вегетативного и инертно­го состояния, быть также в состоянии профага. Основной вклад в изучение этой проблемы внес французский ученый А.Львов. Профагом был назван геном фага, который включа­ется в бактериальную хромосому, после чего этот геном при­обретает способность редуплицироваться вместе с хромосомой бактерии. Такие бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Эти бактерии, содержащие в своих хромосомах генети­ческий материал фага, не продуцируют инфекционных фаго­вых частиц, хотя и сохраняют эту способность. Она может проявиться в определенных условиях, когда произойдет индук­ция профага. При индукции профаг вырезается из хромосомы бактерии, переходит в вегетативное состояние и размножается. В клетке образуются зрелые фаговые частицы, которые высво­бождаются в окружающую среду после ее лизиса. Индукцию профага можно вызвать облучением лизогенной культуры ульт­рафиолетовым светом или обработав ее другими индуцирую­щими агентами. Одной из первых наиболее хорошо изученных систем в отношении взаимодействия бактериофага с бактерией была система Е. coli – бактериофаг лямбда (л). Было показано, что интеграция ДНК фага лямбда (рис. 13.4) происходит в специфическом хромосомном сайте, находящемся вблизи локуса gal, контролирующего сбраживание галактозы.

Рис. 13.4. Жизненный цикл бактериофага лямбда. Развитие бактерио­фага может пойти по литическому (правая ветвь) или лизогенному (левая ветвь) пути. Включение вирусной ДНК в хромосому хозяина и ее выход из хромосомы осуществляются генетической рекомбина­цией, катализируемой особым фаговым белком – интегразой.

Для осуществления процесса интеграции необходимыми являются специфические фаговые attP-сайты (от англ. attachment), сход­ные с ними по устройству бактериальные attB-сайты, фермент Int (интеграза), кодируемый фаговой ДНК, и продукт бактери­ального гена him А. Белок Int, будучи топоизомеразой I типа, осуществляет в центральных участках фагового и бактериаль­ного att-сайтов поочередное разрезание нитей ДНК, в резуль­тате чего образуются двунитевые разрывы (рис. 13.5).

Рис. 13.5. Внедрение профага лямбда в хромосому клетки-хозяина. Особые участки (сайты), которые узнает интеграза, представляют собой опре­деленные нуклеотидные последовательности ДНК (на рисунке они показаны темными прямоугольниками).

При взаимном обмене такими концами между сайтами фаговая ДНК встраивается в бактериальную хромосому, причем на концах профага оказываются рекомбинантные att-сайты. В слу­чае индукции профаг исключается через эти сайты из бакте­риальной хромосомы с помощью белков Int и Xis, узнающими специфические последовательности att-сайтов и производящи­ми в них разрезание нитей ДНК. Иногда, с частотой около 10^–6, исключение профага осуществляется неправильно по слу­чайным сайтам с захватом бактериальных генов, располагаю­щихся слева или справа от него. Образующиеся в результате фаги называют трансдуцирующими, а явление переноса бакте­риальных генов с помощью фаговой ДНК получило название трансдукции.

Для образования фаговых частиц, несущих определенные бактериальные гены, необходимы два условия – близость рас­положения данного гена к месту внедрения профага (чем бли­же, тем с большей вероятностью он включается в трансдуци-рующий фаг) и сохранение в геноме трансдуцирующего фага специфического сайта cos, необходимого для упаковки фаговой ДНК в головку фага. Молекулы ДНК, длина которых превы­шает длину ДНК фага лямбда более чем на 5–6 %, не упако­вываются в головку. Поэтому включение бактериальных генов в фаговый геном обычно происходит при потере части фаговой ДНК, что приводит к дефектности трансдуцирующих фагов.

Профаг лямбда может интегрироваться с меньшей частотой и в другие участки бактериального генома, называемые вто­ричными att-сайтами. Это легко обнаруживается при делети-ровании основного attB-сайта (attB – сайт интеграции профага лямбда в хромосоме). В этих случаях могут быть выделены новые трансдуцирующие фаги, включившие бактериальные ге­ны, прилегающие к этим сайтам. Поскольку фаг лямбда спо­собен трансдуцировать лишь те гены, которые прилегают к месту его интеграции в хромосоме, этот тип трансдукции по­лучил название специализированной.

Другой тип трансдукции был описан в случае фага Pl. Этот фаг является самым крупным умеренным фагом Е. coli, размер его генома составляет около 90 тыс. пар нуклеотидов. Фаг Pl способен развиваться в клетках литически, образуя потомство, а также в определенных условиях переходить в состояние про­фага, который в отличие от профага лямбда не внедряется в хромосому бактерии-хозяина, а находится в виде низкокопий-ной кольцевой плазмиды в ее цитоплазме, способной автоном­но реплицироваться и передаваться потомству в течение дли­тельного времени. При индукции профага или после инфици­рования бактериальных клеток фагом Pl в процессе литического цикла развития происходит упаковка фаговых геномов в головки фага. Механизм упаковки не так строго специфичен, как у фага лямбда, поэтому в головку с частотой около 10^-5–10^-6 может упаковаться любой фрагмент бактериальной ДНК. В результате в лизате всегда присутствуют трансдуцирующие частицы фага, несущие самые разные хромосомные гены. Та­кой тип трансдукции получил название общей трансдукции. Это свойство фага Р1 широко используется в генетических экспериментах по картированию генов, определению их сцепленности друг с другом и порядка их расположения относи­тельно друг друга.

Плазмиды. Плазмиды определяют как стабильно наследуе­мые внехромосомные генетические элементы. Они являются довольно распространенным компонентом бактериальных клеток, найдены также и у представителей низших эукариот. В большинстве случаев плазмиды представляют собой суперскрученные ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК длиной от 2 до 600 тыс. пар нуклеотидов. Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз – фер­ментов, вызывающих деградацию ДНК. Существуют также ли­нейные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонук­леаз обеспечивается тем, что концы их нитей защищены бел­ками или соединяются ковалентно. Клетки, приобретающие плазмиды, как правило, приобретают и новые признаки. Со­ответственно этим признакам обнаруженные первыми плазми­ды получили свое название: F-плазмиды (фактор пола), при­дающие клеткам донорские свойства, Со1-плазмиды, содержа­щие гены колицинпродукции, и R-плазмиды, определяющие резистентность клеток к антибиотикам.

Основным свойством плазмид является способность к авто­номной репликации. Они содержат сайт начала репликации – ой и, как правило, набор генов, необходимых для ее осущест­вления. Однако поскольку в процессе репликации ДНК участ­вует множество белков, в репликации плазмид участвуют и белки клетки-хозяина. Поскольку эти белки в клетках разных видов бактерий отличаются друг от друга, то плазмиды могут существовать только в ограниченном числе близкородственных видов бактерий. Известны вместе с тем плазмиды, имеющие широкий круг хозяев. Такие плазмиды обладают отличиями в наборе белков, необходимых для их поддержания в различных бактериях.

Многие плазмиды способны к интеграции в бактериальную хромосому. Обычно такие плазмиды содержат специфические инсерционные последовательности (IS-элементы), которые име­ют в своем составе ген, ответственный за сайт-специфическую рекомбинацию. В интегрированном состоянии плазмиды способ­ны неопределенно долго существовать в составе хромосомы, реп­лицируясь вместе с ней, как обычные хромосомные гены.

Свойством многих плазмид является их способность пере­давать свою копию в другие клетки методом конъюгации. Плазмиды, обладающие этим свойством, называют конъюгативными, или трансмиссивными. Они содержат в своем геноме гены, ответственные за образование конъюгационного мостика между клетками, по которому может переноситься одна из нитей плазмидной или бактериальной ДНК. Конъюгативные плазмиды найдены главным образом у грамотрицательных бак­терий. Среди них есть плазмиды как с узким, так и с широким кругом хозяев. Они играют важную роль в эволюции бактерий, способствуя распространению генов среди бактерий разных видов и родов; это явление получило название горизонтального переноса генов.

Плазмиды обеспечивают бактериям способность выживать в самых необычных для них условиях. Они придают им устой­чивость к антибиотикам, катионам (висмута, кадмия, ртути, свинца, сурьмы), анионам (арсенату, арсениту), мутагенам (ак­ридинам, этидиум-бромиду, УФ-свету), бактериоцинам. Клет­ки с плазмидами способны вызывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина, толуола и др.; синтезировать антибиоти­ки, бактериоцины, гемолизин, инсектициды, пигменты, ток­сины и т.п.; использовать в качестве источника углерода раз­личные сахара и необычные аминокислоты; конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий и переносить им генети­ческую информацию – свою и своих хозяев; индуцировать опухоли у растений, осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК. Все перечисленное выше свидетельствует о чрезвычайно важной биологической роли плазмид в жизни бактерий.

Инсерционные последовательности (IS-элементы) и транспозоны. Подвижные элементы, способные к перемещениям как внутри одного генома, так и между геномами (например, плазмидным и хромосомным, плазмидным и фаговым) внутри од­ной клетки, встречаются в ДНК всех организмов. Впервые они были открыты у бактерий при обнаружении вставок (инсерций) нового материала в пределах бактериальных оперонов. Такие вставки локализовались внутри гена и предотвращали его транскрипцию. Восстановление активности гена происхо­дит лишь после утраты встроенного материала. При сравнении последовательностей, присутствующих в различных инсерци-онных мутантах, оказалось возможным классифицировать не­сколько дискретных элементов. Каждый элемент мог быть встроен в определенный сайт в любой ориентации. Таким образом были выявлены несколько типов IS-элементов, хотя определенные черты являлись общими для всех элементов (рис. 13.6, А). Каждый из них представляет собой автономную еди­ницу, кодирующую белок (или белки), необходимый для транс­позиции (перемещения). Этот белок узнает концы транспози-рующегося элемента, которые образованы инвертированными повторяющимися последовательностями разной протяженнос­ти. В разных штаммах Е. coli насчитывается от 4 до 19 копий ISl-элемента, от 0 до 12 копий IS2-элемента, около 10 копий IS3-элемента, 1–2 копии IS4-элемента и т.д. Если две копии одного и того же элемента находятся в хромосоме на относи­тельно небольшом расстоянии друг от друга, они могут транс-позироваться в виде одной генетической структуры: два IS-элемента и заключенные между ними бактериальные гены.

Именно таким образом, по-видимому, возникли более сложно организованные транспозирующиеся. элементы – транспозоны, которые были обнаружены у бактерий вслед за IS-элементами. Первые выявленные транспозоны несли в своем со­ставе гены антибиотикорезистентности, позднее были выделе­ны транспозоны с генами устойчивости к солям тяжелых ме­таллов, генами токсинообразования, гемолизина, сбраживания лактозы и т.п. В принципе транспозоны могут содержать лю­бые другие гены. По особенностям строения различают состав­ные транспозоны и транспозоны ТnЗ-семейства. В состав пер­вых входят два полных IS-элемента, фланкирующих централь­ную часть, которая часто содержит гены резистентности к антибиотикам или другие гены, например термолабильного токсина. IS-элементы содержат информацию о способности к транспозиции. У некоторых транспозонов этого типа такая информация сохраняется только в одном из IS-элементов, тог­да как во втором гены, кодирующие эту информацию, инактивированы мутациями. Так как на концах IS-элементов име­ются короткие инвертированные повторяющиеся последова­тельности, то и весь транспозон ограничен такими инвертиро­ванными повторами. Эти концевые повторы имеют важное значение для транспозиции, так как именно они узнаются ферментом, осуществляющим транспозицию – транспозазой.

Транспозоны Тn3-семейства не содержат в своем составе IS-элементов. Все они ограничены высоко гомологичными ин­вертированными концевыми повторами, состоящими из 35–48 пар нуклеотидов; центральные области этих транспозонов содержат информацию об их транспозиции, а также гены, не связанные с транспозицией, кодирующие устойчивость к анти­биотикам или устойчивость к ртути. Схематически классы транспозонов изображены на рис. 13.6.

Биологическая роль транспозонов определяется прежде все­го их способностью переносить гены. Правда, этот перенос осуществляется только внутри клетки, но именно благодаря ему гены могут включаться в плазмиды и геномы бактериофа­гов и вместе с ними распространяются в популяциях клеток разных видов, придавая им новые свойства, часто связанные со способностью выживать в неблагоприятных условиях. Кро­ме того, они индуцируют образование мутаций в геномах, вызывают геномные перестройки разного типа, их интеграция может привести к экспрессии соседнего "молчащего" гена.

Рис. 13.6. Классы бактериальных транспозонов.

А – инсерционный элемент (IS) (i); составной транспозон (ii) – (Тn10); Б – Тn3 и Тn501 – транспозоны семейства Тn3. Стрелки на концах транспозонов – короткие инвертированные последовательности, узнаваемые рекомбинационным ферментом транспозазой (ген tnp). Символами tet, amp и mer обозначены гены в составе транспозонов, кодирующие резистентности соответственно к тетрациклину, ампициллину и солям ртути.

Некоторые транспозоны способны приобретать новые гены устойчивости к антибиотикам, существующие в виде генных циркулярно-замкнутых кассет. Это происходит в тех случаях, когда в составе транспозона содержится дополнительная гене­тическая структура, получившая название интегрона. Интегро-ны – это специфические генетические элементы, содержащие ген интегразы, промотор и сайт интеграции. С помощью фер­мента интегразы они способны захватывать генные кассеты, внедрять их в специфический сайт интегрона и экспрессиро-вать их со своего промотора. В один сайт интегрона последо­вательно может быть включено несколько генных кассет. Ин-тегроны могут находиться не только в транспозонах, но и в плазмидах и фаговых геномах. По-видимому, с их участием образовались плазмиды, несущие множество генов лекарствен­ной устойчивости.

"Острова патогенности" у бактерий. В последнее десятилетие стал широко применяться метод секвенирования бактериаль­ных геномов, т.е. расшифровка полных нуклеотидных после­довательностей ДНК бактерий, особенно патогенных. В июле 1995 г. была опубликована первая полная последовательность нуклеотидов генома Н. influezae. В настоящее время уже извест­ны последовательности более 30 бактериальных геномов и зна­чительное количество геномных проектов находятся в работе. Помимо ценной информации о структурной организации ге­номов бактерий, результаты анализов нуклеотидных последо­вательностей показали, что многие геномы содержат вставки, отличающиеся от основной последовательности нуклеотидов хромосом определенных бактерий процентным содержанием G+C пар в ДНК, которое является характерным для каждого вида бактерий и у разных видов отличается иногда очень значи­тельно (например, у Mycoplasma – 25 мол.%, Е. coli – 51 мол.%, Streptomyces – 73 мол.%). Это свидетельствовало о чужеродном происхождении таких вставок. У патогенных бактерий было показано не только присутствие в хромосомах больших блоков чужеродной ДНК, но и связь этих блоков с патогенностью бактерий. Некоторые из этих областей были явно мобильными, т.е. имели в своем составе все, что необходимо для их переме­щения (мобильности): ген, кодирующий специфическую ре-комбиназу, последовательности, характерные для сайтов интег­рации. Другие сохранили лишь части генов и последователь­ностей мобильности или же, несмотря на их явную чужеродность, не имели в своем составе ни генов рекомбиназ, ни специфических att-сайтов, ни инсерционных элементов (IS). Последнее, вероятно, объясняется утратой элементов мобиль­ности в течение длительного эволюционного процесса после их внедрения в бактериальный геном. Поскольку первые об­наруженные блоки чужеродной ДНК были связаны с генами вирулентности патогенных бактерий, они получили название "островов патогенности". Позднее было установлено, что та­кие блоки чужеродной ДНК, кодирующие различные допол­нительные метаболические функции, резистентность к анти­биотикам, симбиотические функции, существуют во многих геномах, поэтому их стали называть "геномными островами".

Детальное изучение структуры "островов патогенности" по­казало, что они имеют модульную организацию, свидетельст­вующую, что происходила их сборка из отдельных блоков генов путем независимых инсерций, осуществляемых, по-видимому, с помощью IS-элементов либо интегронов. IS-элементы или их остатки, полные или частичные гены интеграз обнаружены во многих "островах патогенности".

Открытие "островов патогенности", способных горизон­тально распространяться среди бактерий, способствовало по­ниманию того, каким образом, несмотря на разнообразие бак­терий и их хозяев, существуют универсальные механизмы ви­рулентности, используемые разными видами бактерий.

Современные представления о структуре прокариотических ге­номов с учетом данных, полученных при анализе полных нуклеотидных последовательностей. До 1956 г., когда Жакоб и Воль-ман предложили кольцевую модель бактериальной хромосомы, все хромосомы считались линейными. Новая модель удовле­творяла всем требованиям, предъявляемым результатами многочисленных экспериментов в бактериальной генетике, и была общепринятой до появления новых методов исследова­ния ДНК. Сначала с помощью метода прямого анализа физической структуры хромосом – электрофореза в пульсирующем поле – было показано, что у некоторых бактерий хромосомы являются линейными, а в середине 90-х годов, когда были начаты расшифровки полных нуклеотидных последовательнос­тей геномов методом секвенирования, было выявлено, что ряд бактерий имеют сложные геномы, состоящие из двух или не­скольких репликонов (табл. 13.1).

Таблица 13.1. Состав сложных геномов бактерий

Анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов бактерий позволяет получить ценную информацию об органи­зации геномов бактерий – их размерах, линейности или цир­кулярности, GC-составе, количестве открытых рамок считыва­ния (ORF), наличии дупликаций и амплификации некоторых из них, выявить родственные и уникальные гены у различных бактерий (табл. 13.2). Оказалось, что многие бактерии, отно­сящиеся к различным таксономическим группам, обладают генами, имеющими общее происхождение. Их распростране­ние осуществлялось путем горизонтального переноса генов – механизма, признанного сейчас одним из основных "двигате­лей" в бактериальной эволюции.

Обнаружение в составе геномов бактерий генов эукариот и, что самое поразительное, в геноме человека, не говоря уже о других представителях эукариот, генов бактерий, подтвердило сложившееся после открытия перемещающихся (мобильных) генетических элементов представление о существовании обще­го генофонда всего живого мира, обмена генами не только между разными видами и родами бактерий, но и между совер­шенно неродственными организмами – бактериями и высши­ми животными и растениями.

Таблица 13.2. Характеристики геномов некоторых бактерий, определенные по их полной нуклеотидной последовательности