Рождение генетики бактерий можно датировать 1943 г., ког­да появилась публикация Лурия и Дельбрюка "Мутации, в результате которых бактерии, чувствительные к вирусу, приоб­ретают к нему устойчивость". В ней впервые было описано, как ставить эксперименты на бактериях, учитывать результаты и давать им оценку.

Бактерии обладают рядом важных преимуществ перед дру­гими организмами. Многие из них легко культивируются в лабораторных условиях на сравнительно простых питательных средах. Крайне важно, что они размножаются очень быстро, и работать с бактериями, делящимися каждые 20–40 мин, гораз­до легче, чем, например, с растениями, дающими одно-два поколения в год. Бактерии содержат гаплоидный (одинарный) набор генов, благодаря чему обнаружение у них мутаций (лат. mulatio – изменение) не представляет особых трудностей: большинство мутаций являются рецессивными (лат. recessus – углубление) и у диплоидных организмов их невозможно обна­ружить в присутствии генов дикого (нормального) типа.

Успешному развитию генетики бактерий предшествовало открытие, продемонстрировавшее, что носителем генетической информации является дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Первооткрывателем роли нуклеиновой кислоты был Гриффит, который в 1928 г. описал явление трансформации – переноса наследственных признаков от капсульных вирулентных пнев­мококков, убитых при нагревании, к живым бескапсульным клеткам пневмококков, не обладающим вирулентностью. Ак­тивным началом в этом процессе, по его данным, являлась ДНК. Подтверждение этого вывода было получено Эвери, Мак-Леодом и Мак-Карти в 1944 г., использовавшими очи­щенные от примесей препараты ДНК для трансформации пнев­мококков. Затем Херши и Чейз в 1952 г. показали, что при заражении бактерий вирусом (бактериофагом) в бактериальную клетку проникает лишь ДНК фага, которая обеспечивает раз­множение фага и сохранение в потомстве всех его наследст­венных признаков. После этих открытий количество работ с бактериями стало нарастать и уже в 50-е годы были открыты такие явления у бактерий, как конъюгация, лизогения и транс-дукция, создана модель структуры ДНК, сформулирована про­блема генетического кода. Это сыграло важную роль в решении многих фундаментальных проблем молекулярной генетики.

Структура ДНК и генетический код. Дезоксирибонуклеино­вая кислота состоит из последовательности химически связан­ных нуклеотидов. Каждый нуклеотид содержит гетероцикли­ческое кольцо из атомов углерода и азота (азотистое основа­ние), пятиуглеродное кольцо (пентозу) и фосфатную группу. Азотистые основания делятся на два типа – пиримидиновые и пуриновые. Каждая нуклеиновая кислота синтезируется только из четырех оснований: двух пиримидиновых (цитозина и ти-мина) и двух пуриновых (гуанина и аденина). Рибонуклеиновая кислота (РНК) отличается от ДНК наличием урацила вместо тимина. Основания обозначают начальными буквами: ДНК содержит А, С, G, Т, а РНК - А, С, О, U.

В 1953 г. Уотсон и Крик создали модель структуры ДНК, согласно которой ДНК имеет форму правильной двойной спи­рали из закрученных одна вокруг другой полинуклеотидных цепей. Разные молекулы ДНК имеют различную последова­тельность пар оснований, что не оказывает влияния на структуру спирали ДНК.

Последовательность оснований в ДНК кодирует последова­тельность аминокислот в белке. Кроме последовательностей, кодирующих белки, в ДНК содержатся специфические облас­ти, которые функционируют как регуляторные зоны, узнавае­мые обычно белковыми регуляторными молекулами.

Взаимоотношения между последовательностью нуклеотидов в гене и последовательностью аминокислот в белке устанавли­ваются с помощью генетического кода. Каждой аминокислоте соответствует последовательность из трех нуклеотидов (три­плет), называемая кодоном. Последовательности кодонов считываются непрерывно, начиная с фиксированной стартовой точки на одном конце гена и заканчивая точкой терминации на другом конце гена. Это значит, что различные части гена не могут читаться независимо. Первая ступень экспрессии гена состоит в образовании мРНК (матричной, или информацион­ной, РНК), копирующей одну из двух цепей ДНК. Синтез одноцепочечной мРНК на ДНК называют транскрипцией. Об­разованная мРНК используется в качестве матрицы, по кото­рой аминокислоты собираются в полипептидную цепь. Этот процесс получил название трансляции.

Мутационный процесс. Изменчивость организмов является одним из главных факторов эволюции. Она служит источни­ком для отбора форм, наиболее приспособленных к условиям существования. Причиной изменчивости являются мутации, различные типы геномных перестроек – инверсии (переворо­ты), делеции (нехватки), дупликации и амплификации (умно­жения) генов, транспозиции (перемещения), горизонтальный перенос генов.

Термин "мутация" впервые был предложен Гуго де Фризом в его классическом труде "Мутационная теория" (1901–1903), в котором он так назвал явление скачкообразного изменения наследственного признака.

Чисто условно мутации делят на спонтанные и индуцирован­ные. В тех случаях, когда мутации возникают без преднамерен­ного экспериментального воздействия, под влиянием природных факторов или в результате физиологических изменений в са­мом организме, их относят к спонтанным мутациям. Мутации, возникающие под влиянием специальных воздействий (УФ-света, ионизирующей радиации, химических веществ, темпера­туры и т.п.), называют индуцированными. Принципиальных различий между спонтанными и индуцированными мутациями нет, но именно изучение последних позволило биологам раз­гадать многие тайны гена.

Мутации от состояния дикого типа к новому состоянию называют прямыми, а от мутантного к дикому–обратными. Прямые мутации часто являются рецессивными, что можно увидеть при совмещении их в одной клетке с генами дикого типа (в этом случае мутантный фенотип не будет проявляться), а обратные – доминантными. В ряде случаев обратная мутация представляет собой не истинную мутацию к исходному состо­янию гена, а имитируется прямой мутацией в другом гене, который приобретает способность подавлять проявление эф­фекта первой мутации. Такие мутации называют супрессорны-ми, а гены – супрессорами.

После того как было установлено, что наследственное ве­щество в живых организмах, включая бактерии и многие ви­русы, – это не что иное, как ДНК, исследование природы мутаций стало проводиться на основе "молекулярного" пред­ставления о гене как о полинуклеотидной цепи, последователь­ность оснований в которой определяет последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Эти исследования приве­ли к пониманию молекулярной природы мутаций и созданию на этой основе классификации мутаций.

Мутанты, фенотипы которых обусловлены изменением од­ной нуклеотидной пары, получили название точечных. Они могут возникать в результате замены одного пуринового осно­вания на другое, так называемых транзиций, либо в результате трансверсий, при которых одно из пиримидиновых оснований в полинуклеотидной цепи ДНК заменяется пуриновым "или, наоборот, пуриновое основание заменяется пиримидиновым. Другие типы встречающихся мутаций у бактерий – это деле­ции, приводящие к утрате незначительного количества пар оснований или протяженных участков ДНК, и вставки (инсерции) коротких или протяженных последовательностей ДНК. Делеции и вставки могут приводить к сдвигу "рамки считыва­ния" генетического кода, т.е. к изменению всех последующих кодонов.

В клетках бактерий имеются механизмы, способные пол­ностью или частично восстанавливать структуру поврежденной ДНК. Совокупности ферментов, участвующих в исправлении повреждений в ДНК, составляют системы репарации, разли­чающиеся биохимическими механизмами. У бактерий были описаны различные ферментные системы репарации: фотореактивация и фотопротекция, темновая репарация, ультрафио­летовая реактивация и многие виды так называемых непрямых реактиваций. В 1975 г. Радман и Виткин сформулировали идею об индуцибельной системе репарации, обозначенной как SOS-репарация, которая осуществляется в пострепликативных про­цессах и обладает склонностью к индукции мутаций. Причи­ной появления мутаций является то, что полимераза (фермент, участвующий в синтезе ДНК) не обеспечивает нормального синтеза ДНК в брешах, возникающих в новых нитях дочерних молекул ДНК в местах, противостоящих тем местам, где лока­лизованы повреждения.

Рекомбинации у бактерий. В современных исследованиях по молекулярной генетике кишечная палочка (Е. coli) занимает одно из первых мест. Палочковидная клетка снаружи одета жесткой оболочкой, под которой находится тонкая цитоплазматическая мембрана. Содержимое клетки представлено про­топлазмой, состоящей из цитоплазмы и включенных в нее молекул ДНК. Клетки гаплоидны и содержат по одной хромо­соме. Хромосома представляет собой кольцевую нить ДНК длиной около 1300 мкм, которая в клетке многократно свер­нута и плотно "упакована". По меньшей мере в одной точке хромосома фиксирована на цитоплазматической мембране, от которой и начинается процесс репликации, идущий в обоих направлениях до встречи примерно посередине хромосомного кольца. На репликацию хромосомы у кишечной палочки ухо­дит примерно 20 мин, после чего хромосомы расходятся и между ними начинает расти перегородка. Затем вновь образо­вавшиеся две клетки отделяются друг от друга. Кишечная па­лочка может жить и размножаться на самой простой питатель­ной среде, что делает ее в высшей степени неприхотливым лабораторным объектом.

Доказательство существования рекомбинаций у бактерий было связано с открытием наличия у них полового процесса, а также с изучением явлений трансформации, трансдукции и лизогении.

Метод обнаружения рекомбинаций у бактерий (обмена между гомологичными последовательностями ДНК) состоит в том, что клетки двух линий, каждая из которых обладает своей ауксотрофной мутацией, выращиваются в смеси на минималь­ной среде, на которой смогут образовать колонии лишь реком-бинанты, восстановившие в результате рекомбинации хромо­сому дикого типа, а все клетки ауксотрофов будут гибнуть. Для большей точности экспериментов используют множественные ауксотрофы, т.е. линии бактерий, несущие два или более мутантных гена (рис. 13.1). Появление в таких опытах прототро-фов – это свидетельство того, что хромосомы вступают между собой в контакт и обмениваются своими участками. Только таким образом могли возникнуть формы, содержащие в своих хромосомах все необходимые для реализации прототрофности компоненты генетического материала, которые первоначально находились в разных клетках. С помощью такого рода экспе­риментов были получены доказательства наличия полового про­цесса и обмена материалом между гомологичными участками ДНК у бактерий.

 
   

Рис. 13.1. Классические опыты по генетическому скрещиванию двух мутантных штаммов Е.coli К12, проведенных Ледербергом и Татумом.

Конъюгация у бактерий. В основе полового процесса у бак­терий лежит конъюгация клеток. Это явление выражается в возникновении временной связи между клетками посредством образования цитоплазматического мостика. Такая связь созда­ет условия для проникновения генетического материала из одной клетки бактерии в другую. В 1952 г. Хейс обнаружил, что при конъюгации одна из клеток выполняет функции до­нора, а другая – реципиента. Донорские клетки характеризу­ются наличием у них полового фактора F+, находящегося в клетке либо в виде отдельной от хромосомы самореплицирую­щейся плазмидной ДНК, либо в интегрированном с хромосо­мой состоянии. При конъюгации автономный фактор F+ пере­ходит в клетку реципиента, превращая ее в донорскую, или "мужскую", клетку. Однако, когда фактор F+ в клетке интег­рируется с ее хромосомой, при конъюгации в клетки реципи­ента через цитоплазматический мостик начинает проникать хромосома, обусловливая появление определенных типов рекомбинантов с высокой частотой. Такие доноры получили название Hfr (от англ. High frequency of recombination). Вначале явление конъюгации клеток бактерий получило доказательство в генетических экспериментах, показавших существование ре­комбинации, а затем оно получило подтверждение в электрон­но-микроскопических исследованиях.

Для того чтобы узнать, как бактерии обмениваются между собой генами, Жакоб и Вольман разработали метод анализа, включающий прерывание конъюгации бактерий в разные сроки после ее начала. Прерывание осуществляли механически при встряхивании смеси бактерий в гомогенизаторе. Такая обработка разъединяет конъюгирующие бактерии, цитоплазматический мостик разрушается, при этом разрывается и нить ДНК, передающаяся через него из клетки Hfr-донора в клетку F-. В результате возникает зигота, содержащая хромосому ре-ципиентной клетки и часть хромосомы донора. Такие клетки в отличие от обычных диплоидных зигот получили название мерозигот. Было открыто, что разные гены последовательно переходят из "мужских" в "женские" клетки бактерий в разное, вполне определенное время. Это обусловлено тем, что специ­фический конец хромосомы бактерий Hfr входит в клетку реципиента и постепенно втягивает туда те гены, которые локализованы за ним по длине хромосомы. Таким образом можно определить последовательность расположения генов и расстояние между ними, измеренное в данном случае време­нем, проходящим от начала внедрения в клетку сначала одно­го, а потом следующего гена (рис. 13.2). Поскольку фактор F+ способен включаться в разные участки хромосомы, были вы­делены разные Hfr-штаммы, различающиеся точками начала переноса хромосом при конъюгации. Исследования группы линий Hfr привели Жакоба и Вольмана к открытию кольцевого строения хромосомы у Е. coli. Изучение последовательности расположения генов при переходе хромосомы бактерии Hfr в клетку F- времени прохождения фрагментов разной длины при прерывании конъюгации с учетом частоты образования рекомбинантов различных классов позволило составить гене­тическую карту хромосомы Е. coli (рис. 13.3).

 
   

Рис. 13.2. Первая карта участка хромосомы Е.соli, построенная Жакобом и Вольманом в 1964 г. на основании определения времени переноса соответствующего гена из донорской клетки в реципиентную.

Рис. 13.3. Первая кольцевая карта хро­мосомы Е. coli, пост­роенная на основании сравнительного изуче­ния частоты перено­са участков хромосо­мы разными донор­скими штаммами Нfr. На карте показана по­следовательность распо­ложения генов без ука­зания расстояний между ними. Символами 82, л, 381, 21 и 424 обозначе­ны участки внедрений профагов разных уме­ренных фагов, тремя буквами – гены бакте­рий, контролирующие различные метаболичес­кие функции.

Трансформация. Генетическая рекомбинация происходит не только при "половом" процессе у бактерий, но и при транс­формации. В случае трансформации материал природной ДНК проникает в клетки в качестве свободных фрагментов. Сразу же после поглощения ДНК клетками начинаются ее преобра­зования, предшествующие ее рекомбинации с хромосомой. До­казано, что у некоторых видов бактерий эти преобразования сводятся к разрывам ДНК на более короткие фрагменты и к последующему расплетанию двунитевой ДНК на однонитевые участки. Затем такие нити образуют синапс с гомологичными участками хромосомы реципиента и рекомбинируют с ними, замещая одну из нитей ДНК хромосомы в соответствующем месте. В момент замещения хромосома в определенном участке имеет одну свою и одну чужую нить ДНК. При последующей репликации происходит образование двух новых нитей на сво­ей и чужой матрице. Отражением этого процесса является то обстоятельство, что в колонии, выросшей из клетки-трансфор-манта, содержится обычно смесь рекомбинантных клеток, на­следовавших признаки обоих родительских штаммов, с исход­ными реципиентными клетками.

Впервые явление трансформации было обнаружено Гриф­фитом в 1928 г. на пневмококках. Впоследствии оно было открыто и у других микроорганизмов. Трансформация у бак­терий может происходить не только в пределах одного и того же вида, но и между разными видами. Однако, чем дальше отстоит один вид от другого в таксономическом отношении, тем меньше частота межвидовой трансформации.

При обычных способах выделения и очистки трансформирующей ДНК молекулярная масса образующихся фрагментов равна 5 × 106– 107 Д.

Напомним, что молекулярная масса целой хромосомы бак­териальной клетки равна 2 × 109 – 4 × 109 Д. Таким образом, при трансформации клетка поглощает менее 1 % всего генома донора. Поэтому генетические карты, построенные посредст­вом трансформации, показывают последовательность располо­жения генов лишь на небольших участках бактериальных хро­мосом.

К трансформации примыкают некоторые явления, в основе которых также лежит поглощение ДНК бактериальной клет­кой. Одно из них – явление трансфекции, когда клетки погло­щают искусственно выделенную фаговую ДНК. В результате в клетке начинается развитие фага с последующим лизисом клет­ки и освобождением зрелых фаговых частиц. Таким же путем можно ввести в бактерию плазмидную ДНК, передать рекомбинантную ДНК, сконструированную генно-инженерными ме­тодами, и, следовательно, передать в живую бактериальную клетку ДНК самого разного происхождения.

Лизогения и трансдукция. У бактерий обнаружены бактерио­фаги двух типов – вирулентные и умеренные. Первые после размножения в клетках бактерий приводят к их лизису. Они существуют только или в вегетативном (размножение в клетках бактерий), или в зрелом (метаболически инертное состояние вне бактериальных клеток) состоянии. Умеренные бактерио­фаги обладают способностью, кроме вегетативного и инертно­го состояния, быть также в состоянии профага. Основной вклад в изучение этой проблемы внес французский ученый А.Львов. Профагом был назван геном фага, который включа­ется в бактериальную хромосому, после чего этот геном при­обретает способность редуплицироваться вместе с хромосомой бактерии. Такие бактерии, несущие профаг, называют лизогенными. Эти бактерии, содержащие в своих хромосомах генети­ческий материал фага, не продуцируют инфекционных фаго­вых частиц, хотя и сохраняют эту способность. Она может проявиться в определенных условиях, когда произойдет индук­ция профага. При индукции профаг вырезается из хромосомы бактерии, переходит в вегетативное состояние и размножается. В клетке образуются зрелые фаговые частицы, которые высво­бождаются в окружающую среду после ее лизиса. Индукцию профага можно вызвать облучением лизогенной культуры ульт­рафиолетовым светом или обработав ее другими индуцирую­щими агентами. Одной из первых наиболее хорошо изученных систем в отношении взаимодействия бактериофага с бактерией была система Е. coli – бактериофаг лямбда (л). Было показано, что интеграция ДНК фага лямбда (рис. 13.4) происходит в специфическом хромосомном сайте, находящемся вблизи локуса gal, контролирующего сбраживание галактозы.

Рис. 13.4. Жизненный цикл бактериофага лямбда. Развитие бактерио­фага может пойти по литическому (правая ветвь) или лизогенному (левая ветвь) пути. Включение вирусной ДНК в хромосому хозяина и ее выход из хромосомы осуществляются генетической рекомбина­цией, катализируемой особым фаговым белком – интегразой.

Для осуществления процесса интеграции необходимыми являются специфические фаговые attP-сайты (от англ. attachment), сход­ные с ними по устройству бактериальные attB-сайты, фермент Int (интеграза), кодируемый фаговой ДНК, и продукт бактери­ального гена him А. Белок Int, будучи топоизомеразой I типа, осуществляет в центральных участках фагового и бактериаль­ного att-сайтов поочередное разрезание нитей ДНК, в резуль­тате чего образуются двунитевые разрывы (рис. 13.5).

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 13.5. Внедрение профага лямбда в хромосому клетки-хозяина. Особые участки (сайты), которые узнает интеграза, представляют собой опре­деленные нуклеотидные последовательности ДНК (на рисунке они показаны темными прямоугольниками).

При взаимном обмене такими концами между сайтами фаговая ДНК встраивается в бактериальную хромосому, причем на концах профага оказываются рекомбинантные att-сайты. В слу­чае индукции профаг исключается через эти сайты из бакте­риальной хромосомы с помощью белков Int и Xis, узнающими специфические последовательности att-сайтов и производящи­ми в них разрезание нитей ДНК. Иногда, с частотой около 106, исключение профага осуществляется неправильно по слу­чайным сайтам с захватом бактериальных генов, располагаю­щихся слева или справа от него. Образующиеся в результате фаги называют трансдуцирующими, а явление переноса бакте­риальных генов с помощью фаговой ДНК получило название трансдукции.

Для образования фаговых частиц, несущих определенные бактериальные гены, необходимы два условия – близость рас­положения данного гена к месту внедрения профага (чем бли­же, тем с большей вероятностью он включается в трансдуци-рующий фаг) и сохранение в геноме трансдуцирующего фага специфического сайта cos, необходимого для упаковки фаговой ДНК в головку фага. Молекулы ДНК, длина которых превы­шает длину ДНК фага лямбда более чем на 5–6 %, не упако­вываются в головку. Поэтому включение бактериальных генов в фаговый геном обычно происходит при потере части фаговой ДНК, что приводит к дефектности трансдуцирующих фагов.

Профаг лямбда может интегрироваться с меньшей частотой и в другие участки бактериального генома, называемые вто­ричными att-сайтами. Это легко обнаруживается при делети-ровании основного attB-сайта (attB – сайт интеграции профага лямбда в хромосоме). В этих случаях могут быть выделены новые трансдуцирующие фаги, включившие бактериальные ге­ны, прилегающие к этим сайтам. Поскольку фаг лямбда спо­собен трансдуцировать лишь те гены, которые прилегают к месту его интеграции в хромосоме, этот тип трансдукции по­лучил название специализированной.

Другой тип трансдукции был описан в случае фага Pl. Этот фаг является самым крупным умеренным фагом Е. coli, размер его генома составляет около 90 тыс. пар нуклеотидов. Фаг Pl способен развиваться в клетках литически, образуя потомство, а также в определенных условиях переходить в состояние про­фага, который в отличие от профага лямбда не внедряется в хромосому бактерии-хозяина, а находится в виде низкокопий-ной кольцевой плазмиды в ее цитоплазме, способной автоном­но реплицироваться и передаваться потомству в течение дли­тельного времени. При индукции профага или после инфици­рования бактериальных клеток фагом Pl в процессе литического цикла развития происходит упаковка фаговых геномов в головки фага. Механизм упаковки не так строго специфичен, как у фага лямбда, поэтому в головку с частотой около 10-5–10-6 может упаковаться любой фрагмент бактериальной ДНК. В результате в лизате всегда присутствуют трансдуцирующие частицы фага, несущие самые разные хромосомные гены. Та­кой тип трансдукции получил название общей трансдукции. Это свойство фага Р1 широко используется в генетических экспериментах по картированию генов, определению их сцепленности друг с другом и порядка их расположения относи­тельно друг друга.

Плазмиды. Плазмиды определяют как стабильно наследуе­мые внехромосомные генетические элементы. Они являются довольно распространенным компонентом бактериальных клеток, найдены также и у представителей низших эукариот. В большинстве случаев плазмиды представляют собой суперскрученные ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК длиной от 2 до 600 тыс. пар нуклеотидов. Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз – фер­ментов, вызывающих деградацию ДНК. Существуют также ли­нейные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонук­леаз обеспечивается тем, что концы их нитей защищены бел­ками или соединяются ковалентно. Клетки, приобретающие плазмиды, как правило, приобретают и новые признаки. Со­ответственно этим признакам обнаруженные первыми плазми­ды получили свое название: F-плазмиды (фактор пола), при­дающие клеткам донорские свойства, Со1-плазмиды, содержа­щие гены колицинпродукции, и R-плазмиды, определяющие резистентность клеток к антибиотикам.

Основным свойством плазмид является способность к авто­номной репликации. Они содержат сайт начала репликации – ой и, как правило, набор генов, необходимых для ее осущест­вления. Однако поскольку в процессе репликации ДНК участ­вует множество белков, в репликации плазмид участвуют и белки клетки-хозяина. Поскольку эти белки в клетках разных видов бактерий отличаются друг от друга, то плазмиды могут существовать только в ограниченном числе близкородственных видов бактерий. Известны вместе с тем плазмиды, имеющие широкий круг хозяев. Такие плазмиды обладают отличиями в наборе белков, необходимых для их поддержания в различных бактериях.

Многие плазмиды способны к интеграции в бактериальную хромосому. Обычно такие плазмиды содержат специфические инсерционные последовательности (IS-элементы), которые име­ют в своем составе ген, ответственный за сайт-специфическую рекомбинацию. В интегрированном состоянии плазмиды способ­ны неопределенно долго существовать в составе хромосомы, реп­лицируясь вместе с ней, как обычные хромосомные гены.

Свойством многих плазмид является их способность пере­давать свою копию в другие клетки методом конъюгации. Плазмиды, обладающие этим свойством, называют конъюгативными, или трансмиссивными. Они содержат в своем геноме гены, ответственные за образование конъюгационного мостика между клетками, по которому может переноситься одна из нитей плазмидной или бактериальной ДНК. Конъюгативные плазмиды найдены главным образом у грамотрицательных бак­терий. Среди них есть плазмиды как с узким, так и с широким кругом хозяев. Они играют важную роль в эволюции бактерий, способствуя распространению генов среди бактерий разных видов и родов; это явление получило название горизонтального переноса генов.

Плазмиды обеспечивают бактериям способность выживать в самых необычных для них условиях. Они придают им устой­чивость к антибиотикам, катионам (висмута, кадмия, ртути, свинца, сурьмы), анионам (арсенату, арсениту), мутагенам (ак­ридинам, этидиум-бромиду, УФ-свету), бактериоцинам. Клет­ки с плазмидами способны вызывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина, толуола и др.; синтезировать антибиоти­ки, бактериоцины, гемолизин, инсектициды, пигменты, ток­сины и т.п.; использовать в качестве источника углерода раз­личные сахара и необычные аминокислоты; конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий и переносить им генети­ческую информацию – свою и своих хозяев; индуцировать опухоли у растений, осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК. Все перечисленное выше свидетельствует о чрезвычайно важной биологической роли плазмид в жизни бактерий.

Инсерционные последовательности (IS-элементы) и транспозоны. Подвижные элементы, способные к перемещениям как внутри одного генома, так и между геномами (например, плазмидным и хромосомным, плазмидным и фаговым) внутри од­ной клетки, встречаются в ДНК всех организмов. Впервые они были открыты у бактерий при обнаружении вставок (инсерций) нового материала в пределах бактериальных оперонов. Такие вставки локализовались внутри гена и предотвращали его транскрипцию. Восстановление активности гена происхо­дит лишь после утраты встроенного материала. При сравнении последовательностей, присутствующих в различных инсерци-онных мутантах, оказалось возможным классифицировать не­сколько дискретных элементов. Каждый элемент мог быть встроен в определенный сайт в любой ориентации. Таким образом были выявлены несколько типов IS-элементов, хотя определенные черты являлись общими для всех элементов (рис. 13.6, А). Каждый из них представляет собой автономную еди­ницу, кодирующую белок (или белки), необходимый для транс­позиции (перемещения). Этот белок узнает концы транспози-рующегося элемента, которые образованы инвертированными повторяющимися последовательностями разной протяженнос­ти. В разных штаммах Е. coli насчитывается от 4 до 19 копий ISl-элемента, от 0 до 12 копий IS2-элемента, около 10 копий IS3-элемента, 1–2 копии IS4-элемента и т.д. Если две копии одного и того же элемента находятся в хромосоме на относи­тельно небольшом расстоянии друг от друга, они могут транс-позироваться в виде одной генетической структуры: два IS-элемента и заключенные между ними бактериальные гены.

Именно таким образом, по-видимому, возникли более сложно организованные транспозирующиеся. элементы – транспозоны, которые были обнаружены у бактерий вслед за IS-элементами. Первые выявленные транспозоны несли в своем со­ставе гены антибиотикорезистентности, позднее были выделе­ны транспозоны с генами устойчивости к солям тяжелых ме­таллов, генами токсинообразования, гемолизина, сбраживания лактозы и т.п. В принципе транспозоны могут содержать лю­бые другие гены. По особенностям строения различают состав­ные транспозоны и транспозоны ТnЗ-семейства. В состав пер­вых входят два полных IS-элемента, фланкирующих централь­ную часть, которая часто содержит гены резистентности к антибиотикам или другие гены, например термолабильного токсина. IS-элементы содержат информацию о способности к транспозиции. У некоторых транспозонов этого типа такая информация сохраняется только в одном из IS-элементов, тог­да как во втором гены, кодирующие эту информацию, инактивированы мутациями. Так как на концах IS-элементов име­ются короткие инвертированные повторяющиеся последова­тельности, то и весь транспозон ограничен такими инвертиро­ванными повторами. Эти концевые повторы имеют важное значение для транспозиции, так как именно они узнаются ферментом, осуществляющим транспозицию – транспозазой.

Транспозоны Тn3-семейства не содержат в своем составе IS-элементов. Все они ограничены высоко гомологичными ин­вертированными концевыми повторами, состоящими из 35–48 пар нуклеотидов; центральные области этих транспозонов содержат информацию об их транспозиции, а также гены, не связанные с транспозицией, кодирующие устойчивость к анти­биотикам или устойчивость к ртути. Схематически классы транспозонов изображены на рис. 13.6.

Биологическая роль транспозонов определяется прежде все­го их способностью переносить гены. Правда, этот перенос осуществляется только внутри клетки, но именно благодаря ему гены могут включаться в плазмиды и геномы бактериофа­гов и вместе с ними распространяются в популяциях клеток разных видов, придавая им новые свойства, часто связанные со способностью выживать в неблагоприятных условиях. Кро­ме того, они индуцируют образование мутаций в геномах, вызывают геномные перестройки разного типа, их интеграция может привести к экспрессии соседнего "молчащего" гена.

 
   

Рис. 13.6. Классы бактериальных транспозонов.

А – инсерционный элемент (IS) (i); составной транспозон (ii) – (Тn10); Б – Тn3 и Тn501 – транспозоны семейства Тn3. Стрелки на концах транспозонов – короткие инвертированные последовательности, узнаваемые рекомбинационным ферментом транспозазой (ген tnp). Символами tet, amp и mer обозначены гены в составе транспозонов, кодирующие резистентности соответственно к тетрациклину, ампициллину и солям ртути.

Некоторые транспозоны способны приобретать новые гены устойчивости к антибиотикам, существующие в виде генных циркулярно-замкнутых кассет. Это происходит в тех случаях, когда в составе транспозона содержится дополнительная гене­тическая структура, получившая название интегрона. Интегро-ны – это специфические генетические элементы, содержащие ген интегразы, промотор и сайт интеграции. С помощью фер­мента интегразы они способны захватывать генные кассеты, внедрять их в специфический сайт интегрона и экспрессиро-вать их со своего промотора. В один сайт интегрона последо­вательно может быть включено несколько генных кассет. Ин-тегроны могут находиться не только в транспозонах, но и в плазмидах и фаговых геномах. По-видимому, с их участием образовались плазмиды, несущие множество генов лекарствен­ной устойчивости.

"Острова патогенности" у бактерий. В последнее десятилетие стал широко применяться метод секвенирования бактериаль­ных геномов, т.е. расшифровка полных нуклеотидных после­довательностей ДНК бактерий, особенно патогенных. В июле 1995 г. была опубликована первая полная последовательность нуклеотидов генома Н. influezae. В настоящее время уже извест­ны последовательности более 30 бактериальных геномов и зна­чительное количество геномных проектов находятся в работе. Помимо ценной информации о структурной организации ге­номов бактерий, результаты анализов нуклеотидных последо­вательностей показали, что многие геномы содержат вставки, отличающиеся от основной последовательности нуклеотидов хромосом определенных бактерий процентным содержанием G+C пар в ДНК, которое является характерным для каждого вида бактерий и у разных видов отличается иногда очень значи­тельно (например, у Mycoplasma – 25 мол.%, Е. coli – 51 мол.%, Streptomyces – 73 мол.%). Это свидетельствовало о чужеродном происхождении таких вставок. У патогенных бактерий было показано не только присутствие в хромосомах больших блоков чужеродной ДНК, но и связь этих блоков с патогенностью бактерий. Некоторые из этих областей были явно мобильными, т.е. имели в своем составе все, что необходимо для их переме­щения (мобильности): ген, кодирующий специфическую ре-комбиназу, последовательности, характерные для сайтов интег­рации. Другие сохранили лишь части генов и последователь­ностей мобильности или же, несмотря на их явную чужеродность, не имели в своем составе ни генов рекомбиназ, ни специфических att-сайтов, ни инсерционных элементов (IS). Последнее, вероятно, объясняется утратой элементов мобиль­ности в течение длительного эволюционного процесса после их внедрения в бактериальный геном. Поскольку первые об­наруженные блоки чужеродной ДНК были связаны с генами вирулентности патогенных бактерий, они получили название "островов патогенности". Позднее было установлено, что та­кие блоки чужеродной ДНК, кодирующие различные допол­нительные метаболические функции, резистентность к анти­биотикам, симбиотические функции, существуют во многих геномах, поэтому их стали называть "геномными островами".

Детальное изучение структуры "островов патогенности" по­казало, что они имеют модульную организацию, свидетельст­вующую, что происходила их сборка из отдельных блоков генов путем независимых инсерций, осуществляемых, по-видимому, с помощью IS-элементов либо интегронов. IS-элементы или их остатки, полные или частичные гены интеграз обнаружены во многих "островах патогенности".

Открытие "островов патогенности", способных горизон­тально распространяться среди бактерий, способствовало по­ниманию того, каким образом, несмотря на разнообразие бак­терий и их хозяев, существуют универсальные механизмы ви­рулентности, используемые разными видами бактерий.

Современные представления о структуре прокариотических ге­номов с учетом данных, полученных при анализе полных нуклеотидных последовательностей. До 1956 г., когда Жакоб и Воль-ман предложили кольцевую модель бактериальной хромосомы, все хромосомы считались линейными. Новая модель удовле­творяла всем требованиям, предъявляемым результатами многочисленных экспериментов в бактериальной генетике, и была общепринятой до появления новых методов исследова­ния ДНК. Сначала с помощью метода прямого анализа физической структуры хромосом – электрофореза в пульсирующем поле – было показано, что у некоторых бактерий хромосомы являются линейными, а в середине 90-х годов, когда были начаты расшифровки полных нуклеотидных последовательнос­тей геномов методом секвенирования, было выявлено, что ряд бактерий имеют сложные геномы, состоящие из двух или не­скольких репликонов (табл. 13.1).

Таблица 13.1. Состав сложных геномов бактерий

Бактерии

Геном

Agrobacterium tumefaciens С58

1 линейная хромосома,

1 кольцевая хромосома,

2 плазмиды

В. cereus

1 кольцевая хромосома, 1 мегаплазмида

В. melitensis

2 кольцевые хромосомы

V. cholerae

2 кольцевые хромосомы

L. interrogans

1 кольцевая хромосома,

1 мегаплазмида

R. meliloti

1 кольцевая хромосома,

2 метаплазмиды

R. sphaeroides

2 кольцевые хромосомы

R. fascians

1 линейная хромосома,

1 линейная плазмида

Анализ полных нуклеотидных последовательностей геномов бактерий позволяет получить ценную информацию об органи­зации геномов бактерий – их размерах, линейности или цир­кулярности, GC-составе, количестве открытых рамок считыва­ния (ORF), наличии дупликаций и амплификации некоторых из них, выявить родственные и уникальные гены у различных бактерий (табл. 13.2). Оказалось, что многие бактерии, отно­сящиеся к различным таксономическим группам, обладают генами, имеющими общее происхождение. Их распростране­ние осуществлялось путем горизонтального переноса генов – механизма, признанного сейчас одним из основных "двигате­лей" в бактериальной эволюции.

Обнаружение в составе геномов бактерий генов эукариот и, что самое поразительное, в геноме человека, не говоря уже о других представителях эукариот, генов бактерий, подтвердило сложившееся после открытия перемещающихся (мобильных) генетических элементов представление о существовании обще­го генофонда всего живого мира, обмена генами не только между разными видами и родами бактерий, но и между совер­шенно неродственными организмами – бактериями и высши­ми животными и растениями.

Таблица 13.2. Характеристики геномов некоторых бактерий, определенные по их полной нуклеотидной последовательности

Видовое название бактерий

Размер генома (пар нуклеотидов)

Кодирую­щие после­дователь­ности, %

Содержа­ние GC, мол.%

Количест­во ORF

М. genitalium

580070

89,7

32

479

М. pneumoniae

816394

88,7

40

677

С. trachomatis

1042519

+

плазмида

7493

 

41,3

894

R. prowazekii

1111523

76,0

29,1

834

Т. pallidum

1138006

92,9

52,8

1041

Н. pylori

1667867

91,0

39

1552

Н. influenzae

1830137

 

38

1073

В. subtilis

4214810

87,0

43,5

4100

М. tuberculosis

4411529

91,0

65,6

4000

Е. coli

4639221

88,6

50,8

4288