Способность бактерии формировать колонии специфичес­кой формы и размера, расщеплять субстраты с помощью фер­ментов, образуемых в ходе физиологических циклов роста и развития, продуцировать пигменты, формировать эндоспоры, а также расти в определенных пределах температур, передви­гаться относят к физиолого-биохимическим свойствам, кото­рые, помимо тинкториальных и иммунологических характерис­тик, используются при идентификации микроорганизмов и диагностике инфекций.

9.3.1. Способность утилизировать углеводы, соли органических кислот и другие соединения

Среди физиолого-биохимических реакций наибольшее диа­гностическое значение имеют реакции, в которых выявляют наличие ферментов, утилизирующих углеводы, аминокислоты, белки и другие вещества. Определение проводят с помощью дифференциально-диагностических сред, содержащих одно из этих соединений или их сочетание.

Углеводы (карбогидраты) являются основным питательным и строительным материалом микробной клетки. В состав угле­водов входят углерод, водород, кислород.

Углеводы разделяют на 2 группы – моносахариды (напри­мер, глюкоза, фруктоза, галактоза) и полисахариды (олигосахариды, крахмал, инулин и т.д.).

В соответствии с количеством атомов углерода моносахари­ды делят на тетрозы (4 атома), пентозы (5 атомов), гексозы (6 атомов), гептозы (7 атомов). Наиболее распространены пен­тозы (ксилоза, арабиноза) и гексозы или их производные (рам-ноза). Из тетроз наиболее известна D-эритроза.

По стереохимической конфигурации изомеры моносахари­дов подразделяют на D- и L-формы. Гексозы (глюкоза, фрук­тоза, галактоза, манноза) относятся к D-ряду.

По оптической активности (способность вращать плоскость поляризованного луча света) моносахариды подразделяют на правовращающие и левовращающие. Правовращающие обозна­чаются знаком (+), левовращающие знаком (–). Например, D-моносахариды могут быть левовращающими, глюкоза явля­ется правовращающей, а фруктоза – левовращающей.

При восстановлении моносахаридов гидрированием по свя­зи С – О или ферментативным путем они превращаются в многоатомные спирты (сахароспирты). Так, D-глюкоза образу­ет сорбит, D-фруктоза – смесь D-маннита и D-сорбита, D-манноза – маннит.

Важнейшими производными группы моносахаридов, в ко­торых (–ОН) замещена на (–NH), являются аминосахара. Аминосахара имеют свойства моносахаров и аминов. Они являются компонентами мукополисахаридов, гликопротеинов, гликолипидов, синтезируемых бактериальной клеткой.

Полисахариды образуются при соединении нескольких мо­лекул моносахаридов (с выделением Н₂O). Две молекулы об­разуют дисахариды: мальтоза (две молекулы глюкозы), лактоза (глюкоза с галактозой), сахароза (глюкоза с фруктозой) и др. Три молекулы моносахаридов образуют трисахариды (рафиноза – состоит из глюкозы, фруктозы, галактозы), четыре моле­кулы – тетрасахариды (стахиоза). Эти полисахариды называ­ются полисахаридами 1-го порядка (олигосахаридами). Они яв­ляются кристаллическими веществами и легкорастворимы в воде.

Для олигосахаридов характерно наличие гликозидных связей между моносахаридами. Некоторые олигосахариды, такие как, например, мальтоза, лактоза, обладают редуцирующими (вос­станавливающими) свойствами. Однако дисахарид сахароза та­кой способностью не обладает. Олигосахариды принадлежат к основным источникам углеводов, используемых как субстрат питания. Углеводы с большим количеством моносахаридов яв­ляются более сложными соединениями с высокой молекуляр­ной массой и называются полисахаридами 2-го порядка (крах­мал, инулин, гликоген, пектиновые вещества, агар-агар). По­лисахариды 2-го порядка разделяют на структурные (целлюлоза и др.) и резервные полисахариды (крахмал, гликоген и др.). При гидролизе или ферментативном расщеплении гликоген, крах­мал и др. расщепляются до декстринов, затем до мальтозы и глюкозы. Целлюлоза расщепляется до дисахарида целлобиозы, а при полном гидролизе – до глюкозы.

 

Тест на сахаролитические ферменты предназначен для диф­ференциальной диагностики энтеробактерий и других микро­организмов.

Принцип теста. Тест основан на способности микробов при утилизации углеводов с образованием кислоты и газа изменять цвет индикатора среды.

Проведение теста. Для обнаружения сахаролитических фер­ментов исследуемую культуру микроорганизма засевают в про­бирки с жидкими или полужидкими (0,2–0,5 % агара) средами Гисса ("пестрый ряд"), которые содержат 3–5 мл среды с определенным углеводом и индикатор, реагирующий измене­нием цвета при изменении величины рН при кислотообразовании. В средах Гисса (рецепт 45) наиболее часто используют моно- и олигосахариды: глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, рафинозу, маннозу, трегалёзу, целлобиозу, фруктозу; полисахариды: крахмал, ину­лин; многоатомные спирты: сорбит, дульцит, маннит, глицерин, адонит, инозит (не карбогидрат); гликозиды: эскулин, салицин, эритритол.

Среды засевают 18-часовой агаровой микробной культурой (петлей диаметром 2–4 мм), а также 0,5–1 млрд суспензией в количестве не более 0,1 мл для исключения мгновенных лож­ных реакций индикатора. При необходимости изучения спо­собности ферментировать углевод в анаэробных условиях по­сле засева микроорганизма в свежепрокипяченную среду наслаивается стерильное вазелиновое масло. Например, таким способом изучают ферментацию глюкозы, маннита и др.

Контролем в "пестром ряду" служат пробирки с посевами эталонных штаммов (положительный и отрицательный кон­троль) и с незасеянными средами Гисса. Такие контроли по­зволяют избежать ложных реакций не только вследствие слу­чайной контаминации среды, но и вследствие редуцирующей активности у cахаров или у примесей в ингредиентах среды. Если изучаемый микроб (помещенный в термостат с оптималь­ной температурой) быстро растет в углеводной среде, то ре­зультаты биохимической реакции можно регистрировать через 24–48 ч. Для медленно растущих микроорганизмов срок на­блюдения продлевается до 96 ч, а иногда до 7–10 сут.

Использование в средах Гисса агар-агара (0,2–0,5%) позво­ляет наблюдать в глубине среды или на ее поверхности пузырь­ки газов. Кроме того, для обнаружения газов в пробирки с 3мл жидкой среды Гисса опускают "поплавки" (трубки Дюрхема), микропробирки длиной 35–45 мм, диаметром 5–7 мм, запаянные с одного конца. При стерилизации из "поплавка", помещенного в среду Гисса дном кверху, воздух вытесняется питательной средой. В случае образования микробом газооб­разных продуктов в "поплавке" появляется пузырек газа.

Если микроорганизм синтезирует сахаролитический фер­мент, утилизируя соответствующий углевод с образованием органических кислот, то цвет среды меняется в зависимости от типа индикатора.

Микроорганизмы, осуществляющие аэробное окисление суб­страта, изменяют цвет только в пробирке без масла. Микроор­ганизмы, осуществляющие брожение (ферментацию), изменя­ют цвет в обеих пробирках (с маслом и без масла). Отсутствие роста в пробирке и сохранение исходного цвета среды указы­вает на неспособность микроба утилизировать углевод.

В некоторые плотные среды включены 2 сахара (среда Клиглера, Ресселя и др. – рецепты 46, 115) (рис. 9.2 – см. вклейку) или 3 сахара (среда Олькеницкого, TSI и др. – рецепты 49, 113, 116).

Перечень наиболее используемых в микробиологии углево­дов представлен в табл. 9.1.

OF-тест (тест окисления/ферментации) предназначен для дифференциальной диагностики энтеробактерий и других мик­роорганизмов.

Принцип теста основан на выявлении разных путей рас­щепления глюкозы: окислительного – в присутствии О₂ как конечного акцептора Н₂ и ферментативного – в анаэробных условиях с фосфорилированием глюкозы и переносом электро­нов на органические субстраты с образованием кислот, газов, альдегидов и изменением цвета среды. Вместо глюкозы могут использоваться также другие карбогидраты.

Таблица 9.1. Перечень наиболее употребляемых карбогидратов для определения сахаролитических ферментов и их бактериальный контроль

Карбогидраты			Бактериальный контроль (образование кислоты)
химическая группа		наименование	положительный	отрицательный
Моно- и олигосахариды	Пентозы	Арабиноза (L+)	Citrobacter, Salmonel­la	Proteus, Serra­tia
		Ксилоза (дре­весный сахар)	Enterobacter, Kleb­siella	Edwardsieila tarda
	Метил-пентоза	Рамноза (изо-дульцит)	Citrobacter freundii, Salmonella typhimu-rium	Edwardsiella tarda, Serratia marcescens
	Гексозы	Галактоза	Corynebacterium diphtheriae, тип gravis	Corynebacteri­um pseudo-diphthericum
		Глюкоза (декс­троза)	Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae	Yersinia spp.
		Сорбоза	Yersinia enterocolitica	Yersinia pseudotubercul osis
Моно- и олигосахариды		Фруктоза (ле­вулеза)	Clostridium perfrin-gens, Corynebacte­rium xerosis, Yersinia enterocolitica	Clostridium novyi
	Дисахариды	Лактоза (мо­лочный сахар)	Escherichia coli, Klebsiella oxytoca	Proteus mirabi­lis, Salmonella typhimurium
		Мальтоза (со­лодовый сахар)	Hafnia alvei, Serratia marcescens	Proteus mirabi­lis
		Мелибиоза	Yersinia pseudotuber­culosis	Yersinia enero-colitica
		Сахароза (тростниковый сахар)	Edwardsieila, Salmo­nella, Shigella	Enterobacter, Klebsiella, Ser­ratia
		Трегалёза (грибной сахар)	Hafnia alvei, Serratia marcescens	Morganella morganii
		Целлобиоза	Escherichia, Shigella	Enterobacter, Klebsiella
	Трисахариды	Мелицитоза	Micrococcus luteus	Yersinia ente­rocolitica
		Рафиноза	Enterobacter, Klebsi­ella	Hafnia, Prote­us, Serratia
Полисахариды		Крахмал раст­воримый Инулин	Corynebacterium diph­theriae тип gravis Enterococcus pyogenes	Corynebacteri­um xerosis Enterococcus faecium
Гликозиды		Амигдалин	Yersinia enterocolitica	Yersinia pseudo­tuberculosis
		Салицин	Klebsiella, Serratia	Salmonella, Shigella
Многоатомные спирты		Эскулин	Enterococcus faecalis, Serratia marcescens	Shigella sonnei, Streptococcus
	Трех­атомные	Глицерин	Escherichia, Salmo­nella, Serratia mar­cescens	Enterobacter cloacae
	Четырех­атомные	Эритрит	Micrococcus luteus	Shigella, Yersinia enterocolitica
	Пятиатомные	Адонит	Escherichia coli, Klebsiella omithino-lytica	Hafnia alvei, Salmonella, Shigella sonnei
	Шести­атомные	Дульцит	Salmonella, Entero­bacter aerogenes	Hafnia, Proteus, Serratia
		Маннит	Escherichia coli, Sal­monella, Serratia	Edwardsieila tarda
		Сорбит	Citrobacter, Klebsiel­la, Salmonella	Edwardsiella tarda, Hafnia alvei
	Шести­атомный цикличе­ский, про­изводное гексагид-робензола	Инозит	Enterobacter aeroge­nes	Hafnia alvei, Klebsiella, Shi­gella sonnei

Проведение теста осуществляется на среде Хью – Лейфсона (рецепт 76). Для посева используют 18-часовую агаровую куль­туру, которую в небольшом количестве вносят в среду методом укола в 2 пробирки. В одну из пробирок наслаивается 3–5 мл стерильного вазелинового масла. Инкубирование проводят в течение 3–4 дней при 36±1°С. Учет результатов проводят по наличию роста и изменению цвета среды. Изменение цвета среды на желтый (образование кислоты) в обеих пробирках свидетельствует о ферментативной реакции. Образование кис­лоты только в пробирке без вазелина (аэробные условия) ука­зывает на использование глюкозы путем окисления. Отсутст­вие кислотообразования в обеих пробирках связано с принадлежностыо культуры к "неферментирующим" группам микро­организмов.

Положительный контроль на ферментацию: Enterobacter aero-genes.

Положительный контроль на окисление: Citrobacter freundii. Отрицательный контроль (не ферментирует): Alcaligenes fae-calis.

 

Тест с ONPG (тест на β-D-галактозидазу с О-нитрофенил-β-D-галактопиранозидом, ONPG)

Тест предназначен для выявления бактерий, обладающих β-D-галактозидазой, осуществляющей внутриклеточное рас­щепление лактозы на галактозу и глюкозу, но лишенных фер­мента лактазы (галактозидпермеазы), ответственной за транс­порт лактозы в клетку. Вследствие этого у некоторых бактерий (Escherichia coli, Salmonella, Arizona, Citrobacter spp. и др.) отме­чается замедленная утилизация лактозы.

Принцип теста. Тест основан на реакции расщепления бес­цветного реагента О-нитрофенил-β-D-галактогшранозида (ONPG) под действием синтезируемой микробом β-галактозидазы до образования галактозы и вещества желтого цвета О-нитрофенила. Поскольку реагент отличается от лактозы тем, что в нем глюкозная группа заменена на О-нитрофенильную, он быстрее проникает в клетку и выявление способности утилизировать лактозу выявляется быстрее.

Проведение теста. В 0,25 мл физиологического раствора вносят петлей до образования густой суспензии 18-часовую культуру с плотных сред, содержащих лактозу (среда Олькеницкого, TSI и др. – рецепты 113, 116), и добавляют 1 каплю толуола для извлечения энзима из бактериальных клеток.

Пробирки после встряхивания помещают в термостат. Через 7–10 мин в пробирки вносят 0,25 мл бесцветного свежепри­готовленного раствора ONPG (рецепт 48) и вновь инкубируют в термостате или водяной бане. Через 30 мин и затем перио­дически (до 24 ч) проводят наблюдение за результатом реак­ции. Появление желтого окрашивания в тестируемой культуре указывает на положительную реакцию. Контролем на отсутст­вие неспецифической реакции является стерильная питатель­ная среда, в которую вносят реагенты. В пробирках на отри­цательный и неспецифический контроль окрашивание должно отсутствовать.

Положительный контроль: Escherichia coli, Enterobacter aero-genes, Klebsiella oxytoca.

Отрицательный контроль: Salmonella typhimurium, Proteus mi­rabilis.

 

Тест на определение кислотообразования в тесте с метиленовым красным (MR-тест). Тест используется для дифференци­альной диагностики энтеробактерий и других микроорганизмов. Для определения сильного кислотообразования (смесь из уксусной, молочной и других кислот) к 24 – 48-часовой мик­робной культуре в среде Кларка (рецепт 47) прибавляют 3–4 капли 0,04% спиртового раствора метиленового красного. При сильном кислотообразовании возникает ярко-красное окраши­вание, при слабоположительном – красно-оранжевое, при от­рицательном – желтое.

Положительный контроль: Escherichia coli, Salmonella typhi­murium, Proteus vulgaris.

Отрицательный контроль: Enterobacter aerogenes.

 

Тест на образование ацетилметилкарбинола (реакция Фогеса – Проскауэра, в модификации Баррита). Некоторые микроорга­низмы, сбраживающие глюкозу с образованием кислот (пируват и др.), метаболизируют затем пировиноградную кислоту до образования нейтральных продуктов – ацетилметилкарбинола (ацетоина, СН₃СНОНСОСН₃), диацетила и др. Ацетоин выяв­ляют в реакции Фогеса – Проскауэра.

Принцип теста. В щелочных условиях (при добавлении КОН) ацетилметилкарбинол окисляется в диацетил, который реагирует с гуанидиновой группой аргинина в пептоне. При положительном результате в среде образуется азотное соедине­ние, которое при добавлении α-нафтола окрашивается в виш­нево-красный цвет.

Проведение теста. К 1 мл микробной культуры, выращен­ной в двух пробирках в среде Кларка (рецепт 47) в течение 24–72 ч при разной температуре инкубации (36±1°С и 23±2°С, так как в последнем случае некоторые микроорганизмы про­являют более выраженные биохимические реакции), вносят 0,6 мл свежеприготовленного 5 % спиртового раствора α-нафтола. Пробирки встряхивают, добавляют 0,2 мл 40 % раствора КОН, затем снова встряхивают и помещают на 30–60 мин в термостат при 36+1°С. При положительной реакции появляется вишнево-красное окрашивание.

Положительный контроль: Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei, Sal­monella typhimurium.

Тест на гидролиз эскулина предназначен для дифференциа­ции микроорганизмов по способности утилизировать карбогидрат эскулин.

Принцип теста – окрашивание взаимодействующих про­дуктов гидролиза эскулина с цитратом железа.

Проведение теста. В питательную среду для тестирования эскулина (рецепт 50) засевают 18-часовую культуру. Контролем на неспецифическую реакцию является питательная среда с эскулином. Реакцию оценивают через 24 – 96 ч инкубирования пробирок при 36±1°С с ежедневным учетом результатов. При гидролизе эскулина наблюдается образование черного окраши­вания среды с образованием осадка. В контрольных пробирках черное окрашивание отсутствует.

Положительный контроль: Enterococcus faecalis.

Отрицательный контроль: Streptococcus salivarius.

 

Тест на гидролиз крахмала используют для дифференциации микроорганизмов по способности утилизировать крахмал. Гид­ролиз осуществляют микроорганизмы, синтезирующие фер­мент амилазу и использующие полисахарид как источник уг­лерода и энергии.

Принцип теста. С негидролизованным крахмалом среда мутнеет, а при гидролизе наблюдается ее просветление. Для выявления способности гидролизовать крахмал используют разные рецептуры сред. Тест в жидкой среде выполняют как тесты со средами Гисса (рецепты 45, 51).

Проведение теста на плотной среде (рецепты 52, 84). Среду (МПА, АГВ, Мюллера – Хинтона с 1–2 % крахмала) разлива­ют в стерильные чашки Петри. На чашку штрихом или бляш­ками производят посев 18-часовой агаровой культуры. После выращивания в течение 24 – 48 ч (иногда наблюдение до 5 дней) отмечают просветление среды вокруг штриха (бляшки), свидетельствующее о гидролизе крахмала. Зона гидролиза видна лучше после обработки среды раствором Люголя. Вся среда с крахмалом окрашивается в синий цвет, кроме зоны гидролиза, которая остается прозрачной или становится буро-красной, если гидролиз идет до декстрина.

Положительный контроль: Bacillus subtilis, Bacillus cereus.

Отрицательный контроль: Escherichia coli.

 

Тест на утилизацию цитрата используют при дифференци­альной диагностике энтеробактерий и близкородственных микроорганизмов. Для изучения способности энтеробактерий использовать цитрат чаще всего применяются агаризованные среды Симмонса (рецепт 53), Кристенсена (рецепт 54) или жид­кая среда Козера (рецепт 55).

Принцип теста заключается в том, что при расщеплении цитрата с помощью фермента образуется двуокись углерода (СO₂), реагирующая с ионами Na и водой. В результате обра­зуется натрия карбонат (Na₂CO₃), защелачивающий среду. Это­му способствует также аммиак (NH₃), образующийся в среде при разложении источника азота – солей аммония. В резуль­тате положительной реакции цвет среды от щелочных продук­тов изменяется с оливково-зеленого на ярко-синий (среда Симмонса с бромтимоловым синим – рис. 9.3 – см. вклейку) или на розовый (среда Кристенсена с феноловым красным). Цитратнегативные микробы не растут на жидкой среде Козера, и она остается прозрачной.

Положительная реакция может быть на среде Кристенсена, отрицательная – на среде Симмонса или Козера (например, у Edwardsiella), так как на средах Симмонса и Козера выявляют способность утилизировать цитрат в качестве единственного источника углерода в безглюкозной среде. При замене в среде Симмонса цитрата натрия на ацетат натрия или на соли ам­мония может выполняться тест на их утилизацию с соответст­вующими для них контрольными культурами.

Проведение теста. Определение проводят с 18-часовой культурой, которую засевают в среды петлей. Учет результатов после инкубации посевов при 36±1°С через 24–48 ч, при отрицательной реакции иногда наблюдение до 7 дней.

Положительный контроль: Salmonella typhimurium, Morganella morganii.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella flexneri.

 

Тест на утилизацию органических кислот или их солей. D-, L-, I-тартрат (соли винной кислоты), мукат (слизевая кислота), цитрат (соли лимонной кислоты) (рецепт 56)

Принцип теста основан на том, что в пептонной среде, содержащей оптически активные или инертные соединения винной кислоты (тартраты), мукат или цитрат, некоторые саль­монеллы и родственные энтеробактерий утилизируют эти суб­страты с участием соответствующих ферментов, изменяя цвет индикатора.

Проведение теста. Засев среды осуществляется 18-часовой агаровой культурой с помощью петли. Незасеянная питатель­ная среда является контролем на стерильность и окраску. Ин­кубацию пробирок проводят при 36+1 °С в течение 18–24 ч. Изменение цвета среды с оливково-зеленого на желтый ука­зывает на утилизацию этих веществ. После окончания инкуба­ции ставят дополнительный тест в пробирках с D-тартратом, добавляя 0,5 мл нейтрального 50 % раствора уксуснокислого свинца. При положительной реакции осадок в пробирке с куль­турой составляет менее 2/3 объема среды. При отрицательном результате в засеянной и контрольной пробирках появляется осадок, занимающий около 2/3 объема среды с тартратом.

Утилизацию муката, цитрата, ацетата оценивают по измене­нию цвета среды на желтый.

Положительный контроль: на тартрат – Salmonella typhi,

Citrobacter freundii;

на мукат   – Salmonella Paratyphi А,

Enterobacter aerogenes;

на цитрат – Enterobacter cloacae.

Отрицательный контроль: на тартрат – Salmonella paratyphi А,

Enterobacter cancero-genus;

на мукат – Hafnia alvei;

на цитрат – Shigella sonnei.

Тест с малонатом применяется для дифференциации энте­робактерий.

Принцип теста основан на изменении окраски среды при расщеплении малоната натрия с образованием щелочных про­дуктов.

Проведение теста. Испытуемую 18-часовую культуру вносят в пробирки со средой (рецепт 57) петлей. Контролем является незасеянная среда.

Пробирки инкубируют при 36±1 °С в течение 24 – 48 ч.

При положительной реакции цвет среды с бромтимоловым синим изменяется с оливково-зеленого на синий.

Положительный контроль: Salmonella arizona.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei.

 

Тест на гидролиз гиппурата применяют для определения спо­собности микроорганизмов (Streptococcus, Enterococcus, Campy­lobacter, Helicobacter и др.) вызывать гидролиз гиппурата натрия.

Принцип теста основан на том, что после гидролиза гип­пурата натрия и взаимодействия с раствором FeCl₃ (12 г FeCl₃ ∙ 6Н₂0 в 100 мл 2 % раствора HCl) образуется нерастворимый осадок бензоата железа.

Проведение теста. В питательный бульон (с показателем аминного азота не менее 140 мг%) с 1 % гиппурата натрия (рецепт 58) засевают петлей (2–4 мм) 18-часовую культуру. Через 24–96 ч культивирования при 36+1°С получают бескле­точный центрифугат (культуральную жидкость). Затем в 1 мл стерильного контрольного бульона порциями по 0,1 мл вносят раствор FeCl₃ (рецепт 58) и встряхивают. Возникающий осадок гиппурата железа после дополнительных порций FeCl₃ полнос­тью растворяется. Подсчитывают общее количество израсходо­ванного раствора FeCl₃, которое в том же объеме затем добав­ляют к 1 мл культуральной жидкости. Положительная реакция развивается в виде плотного желтовато-коричневого осадка бензоата железа.

Положительный контроль: Streptococcus agalactiae.

Отрицательный контроль: Streptococcus mutans.

 

Тесты на щелочную и кислую фосфатазы предназначены для дифференциальной диагностики Staphylococcus и др.

Принцип теста связан с отщеплением под действием фос­фатазы фосфатной группы от фосфорорганического соедине­ния, которое окрашивается (или является окрашенным) при добавлении соответствующего реагента.

Проведение теста. Метод 1. Этот метод предназначен для определения как кислой, так и щелочной фосфатазы. В рас­плавленный и охлажденный до 50 °С 1,5 % МПА (рецепт 93) асептически добавляют 1 % раствор натриевой соли дифосфата фенолфталеина (Sigma) до конечной концентрации 0,01 %. Среду, разлитую в чашки Петри, после подсушивания инокулируют 18-часовой культурой методом бляшек или штриха до образования единичных колоний. Чашки инкубируют при 36±1 °С в течение 24–48 ч (при необходимости до 5 дней). После окончания инкубации на крышку, перевернутой вверх дном чашки, вносят 0,1 – 0,5 мл нашатырного спирта, пары которого должны воздействовать на колонии. Через 5 – 10 мин учитывают результат реакции. При наличии щелочной фосфа­тазы (в присутствии свободного фенолфталеина) колонии ок­рашиваются в розовый или красный цвет.

Метод 2. В расплавленный и охлажденный до 50 °С 1,5 % МПА (рецепт 93) вносят 0,05 % паранитрофенилфосфата. После перемешивания разливают среду в чашки Петри. После их подсушивания производят посев 18-часовой культуры мето­дом бляшек или штриха с образованием единичных колоний. Результаты учитывают через 24–48 ч инкубации при 36±1 °С. Желтое окрашивание среды вокруг выросшей культуры указы­вает на наличие кислой фосфатазы.

Положительный контроль: Staphylococcus aureus, Staphylococ­cus epidermidis, Haemophilus influenzae.

Отрицательный контроль: Staphylococcus saprophytics, Micro­coccus varians.

9.3.2. Способность микроорганизмов утилизировать протеины, аминокислоты и вызывать литические реакции

К основным физиолого-биохимическим свойствам микро­организмов принадлежит протеолитическая активность, свя­занная с наличием протеаз. Согласно классификации, они называются пептидгидролазами. Протеазы разделяют на пептидазы, расщепляющие пептиды и дипептиды, и протеиназы, гидролизующие непосредственно белок, а также полипептиды. Среди пептидаз распространение имеет, например, лейцинами-нопептидаза. Среди протеиназ следует отметить пепсин, трип­син, химотрипсин, папаин. При гидролизе белка с их участием образуются пептоны, полипептиды, свободные аминокислоты.

Белки используются микроорганизмами при питании как источник мономерных белковых субъединиц – аминокислот. Белковая молекула – продукт полимеризации аминокислот, связанных пептидными связями и образующих пептиды. Пеп­тиды формируют полипептиды, которые по количеству амино­кислот называются ди-, три-, тетрапептидами и т.д. Всего известно 20 α-аминокислот: аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин, триптофан, глицин, серии, треонин, цистин, тирозин, аспарагин, глутамин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, гистидин. В белках аминокислоты присутствуют в разных ко­личественных и качественных соотношениях. Аминокислотымогут быть получены из белков (протеинов) методами фермен­тативного или химического гидролиза [щелочной гидролиз, например с Ва(ОН)₂ или NаОН; кислотный гидролиз, напри­мер с НСl].

Полученные под действием бактериальных ферментов (на­пример, гидролаз, лиаз) аминокислоты могут подвергаться дезаминированию или декарбоксилированию или разрушаться че­рез дегидролазный путь расщепления. При декарбоксилировании образуются первичные амины и СO₂. Декарбоксилазы образуются, как правило, в кислой среде. Эти реакции извест­ны, например, для лизина, орнитина. В процессе декарбокси-лирования, помимо СO₂, из L-лизина образуется диамин ка­даверин, а из L-орнитина – диамин путресцин. Иначе проис­ходит расщепление L-аргинина, на который воздействует фер­ментный комплекс из декарбоксилазы и дегидролазы. Через промежуточные продукты обмена (L-орнитин, мочевина) рас­щепление аргинина завершается образованием путресцина и СO₂, а при наличии уреазы, кроме СO₂, появляется 2NH₃. При дезаминировании от аминокислоты отщепляется аммиак. Из­вестно окислительное дезаминирование (распад глутаминовой кислоты), гидролитическое дезаминирование (гидролиз моче­вины с участием уреазы), дезаминирование с образованием ненасыщенных соединений (дезаминирование аспарагиновой кислоты).

Важным свойством аминокислот является их оптическая активность (способность вращать плоскость поляризованного луча, за исключением глицина). Около половины аминокислот оказались правовращающими, обозначаются (+); к ним отно­сятся аланин, глутамин, лизин и др. Остальные – левовращающие, обозначаются (–); к ним относятся лейцин, триптофан, фенил аланин и др. Все аминокислоты по стереохимической конфигурации принадлежат к L-ряду. D-аминокислоты встре­чаются очень редко: D-глутаминовая и D-аспарагиновые кис­лоты, D-аланин, D-фенилаланин найдены в бацилле сибир­ской язвы. В грамицидине найден D-фенилаланин.

При химическом (но не ферментативном) синтезе получают оптически неактивную смесь L- и D-изомеров, которую назы­вают DL-аминокислотами. В связи с этим при использовании DL-аминокислот в диагностических средах их необходимо до­бавлять в концентрации, в 2 раза большей, чем для L-аминокислот.

Аминокислоты одновременно являются кислотами и осно­ваниями, т.е. в водных растворах это амфотерные электролиты. Они содержат кислотную карбоксильную группу, которая в вод­ных растворах отщепляет ионы водорода и функционирует как кислота, а также основную аминную группу, являющуюся источ­ником гидроксильных ионов и проявляющую свойства основа­ния.

У некоторых микроорганизмов утрачена способность син­тезировать аминокислоты, поэтому они нуждаются в готовых аминокислотах. Некоторые микробы нуждаются в нескольких аминокислотах.

В бактериологической диагностике инфекций и идентифи­кации микроорганизмов используют тесты по выявлению фер­ментов, расщепляющих аминокислоты: лизин, орнитин, арги­нин, фенилаланин, триптофан, тирозин. Определение прово­дят на питательных средах с добавлением соответствующей аминокислоты, испытуемых бактериальных культур, тест-реа­гентов (при необходимости).

Тест на декарбоксилазы и дегидролазы предназначен для дифференциальной диагностики энтеробактерий и других мик­роорганизмов.

Принцип теста основан на изменении цвета среды под действием продуктов декарбоксилирования.

Проведение теста. Петлей (2–4 мм в диаметре) делают посев 18-часовой микробной культуры в питательные среды (рецепт 60), не содержащие аминокислоты (контроль) и содер­жащие аминокислоты лизин, орнитин или аргинин. Через 24– 48 ч культивирования при 36+1°С отмечают результаты. Изме­нение цвета среды с аминокислотой и бромтимоловым синим с оливково-зеленого на синий вследствие защелачивания среды образовавшимися аминами (диаминами) или аммиаком свидетельствует соответственно о наличии лизиндекарбоксила-зы, орнитиндекарбоксилазы или аргининдегидролазы. Измене­ние цвета среды на желтый указывает на образование кислых продуктов в результате роста микробной культуры и отсутствие декарбоксилазы. Цвет среды в контрольной пробирке с вырос­шей культурой всегда изменяется на желтый. При отсутствии роста цвет среды не изменяется.

Положительный              на лизин      – Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens;
контроль:                          

на орнитин – Salmonella typhimurium, Entero­bacter aerogenes;

на аргинин – Salmonella typhimurium.

Отрицательный                  на лизин    – Proteus vulgaris, Shigella sonnei;

контроль:                          на орнитин –Klebsiellapneumoniae, Proteus vulgaris;

     на аргинин –Hafnia alvei, Proteus vulgaris.

Тест на дезаминазы предназначен для дифференциальной диагностики энтеробактерий и других микроорганизмов. Этот биохимический признак используется, например, для диффе­ренциации бактерий рода Proteus от других энтеробактерий при росте в среде с фенилаланином (рецепт 61).

Принцип теста заключается в том, что в результате дезами­нировании фенилаланина в среде образуются аммиак и фенилпировиноградная кислота. Для ее выявления на выросшую культуру наносят 1 каплю 10 % водного раствора FeCl3.

Проведение теста. Среда с аминокислотой заливается 18-ча­совой агаровой культурой. После инкубирования при 35±1°С в течение 24–48 ч на выросшую культуру наносят 10 % водный раствор FeCl₃. При положительной реакции дезаминирования образуется фенилпируват железа и появляется оливковозеленое окрашивание, при отрицательной – желтое окрашивание (рис. 9.4 – см. вклейку).

Положительный контроль: Proteus vulgaris.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei, Sal­monella typhimurium.

Тест на утилизацию триптофана (тест на индол) предназначен для дифференциальной диагностики энтеробактерий и других микроорганизмов.

Принцип теста. Некоторые микроорганизмы вырабатывают фермент триптофаназу, под действием которой из триптофана образуется индол, который при взаимодействии с бензальдегидом дает красное окрашивание.

Проведение теста. Определение на индол проводят после вы­ращивания микроорганизма в течение 16–18 ч на среде, обо­гащенной триптофаном (0,01 %) с добавлением после культи­вирования реактива Эрлиха или Ковача (рецепт 62). Опреде­ление также проводят с использованием полосок из фильтро­вальной бумаги, пропитанных реагентами. Появление в среде или на полосках бумаги красного окрашивания указывает на наличие индола.

Положительный контроль: Proteus vulgaris.

Отрицательный контроль: Salmonella typhimurium, Enterobac­ter aerogenes.

 

Тест на образование сероводорода предназначен для диффе­ренциальной диагностики энтеробактерий и других микроор­ганизмов.

Принцип теста заключается в том, что при расщеплении микробами серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин, метионин) до конечного продукта происходит образование се­роводорода. Возможно также образование H₂S у микробов, осуществляющих процесс нитратредукции. H₂S вступает в со­единение с уксуснокислым свинцом и превращается в сульфат свинца, вызывающий черно-бурое окрашивание.

Проведение теста. Определение проводят после выращива­ния культуры при 36±1°С 24–48 ч (при необходимости до 7–10 дней) в мясопептонном бульоне, разлитом по 8–10 мл. Под пробку перед началом культивирования помещают фильтровальную полоску, пропитанную уксуснокислым свинцом. При положительной реакции полоска чернеет. Для теста могут использоваться среды Клиглера, Олькеницкого, TSI (рецепты 49, 113, 115, 116). Внесение культуры уколом в нескошенную часть сред при положительной реакции вызывает почернение.

Положительный контроль: Proteus vulgaris, Salmonella typhi, Edwardsiella tarda.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei, Klebsiella pneumoniae.

 

Тест на цистиназу (проба Пизу) применяют наиболее часто для идентификации Corynebacterium diphtheriae.

Принцип теста основан на том, что фермент цистиназа расщепляет цистин в среде Пизу (рецепты 63, 64). Свободная сера реагирует с ацетатом свинца с образованием сульфита свинца черного цвета. При отсутствии цистиназы цвет среды не изменяется.

Проведение теста. В свежеприготовленную среду Пизу с цистином уколом (до дна пробирки) вносят 18-часовую тести­руемую агаровую культуру. Контролями служат эталонные штаммы микроорганизмов, образующие и не образующие цис­тиназу, а также незасеянные пробирки со средой на неспеци­фическую реакцию. После инкубации пробирок при 36±1 °С в течение 24–48 ч учитывают наличие и характер роста, окраску культуры и появление коричневого "облачка" вокруг роста культуры по уколу. Так, при положительной реакции отмечается рост культуры, главным образом, в глубине среды и по уколу культуры (дифтерийная палочка). Культура окрашивается в черно-коричневый цвет, а вокруг укола на расстоянии не менее 1 см от поверхности образуется коричневое "облачко". При отрицательной реакции (дифтероиды и ложнодифтерийные па­лочки) культура растет в основном на поверхности, не окра­шивается, "облачко" не образуется.

Положительный контроль: Corynebacterium diphtheriae.

Отрицательный контроль: Corynebacterium xerosis.

 

Тест на дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) предназначен для дифференциациальной диагностики Staphylococcus, Serratia и др.

Принцип теста заключается в том, что фермент ДНКаза деполимеризует ДНК вокруг культуры с образованием прозрач­ной зоны после воздействия НО.

Проведение теста. К расплавленному и охлажденному до 50 °С 1,8 % МПА (рН 8,6) (рецепт 93) добавляют водный рас­твор ДНК до конечной концентрации 0,5; 1 и 2 мг/мл. Среду стерилизуют при 112 °С 30 мин или прогревают в течение 20 мин в кипящей бане. Перед розливом в чашки Петри по 10–12 мл добавляют СаСl₂ (0,8 мг/мл). Для этого используют стерильный фармакопейный 10 % раствор СаС1₂. После застывания пита­тельного агара на подсушенную поверхность делают посев 18-часовой культуры методами реплик с помощью штампа-репликатора или штриха с образованием колоний, бляшек или полосок. Для теста может быть использована специальная среда (рецепт 59). После инкубации посевов при 36±1 °С в течение 18–24 ч на чашки наносят 5 мл IN HCl. Через 10–15 мин раствор выливают. При положительной реакции вокруг выросшей культуры на мутном фоне (вследствие осадка от взаимодействия высокополимерной ДНК с HCl) образуется прозрачная зона деполимеризованной ДНК, связанная с про­дукцией ДНКазы. Для более четкого проявления зоны перед автоклавированием МПА, содержащего ДНК, в среду вносят 0,01 % толуидинового синего "О". В случае образования ДНКазы вокруг бактериальной культуры возникает ярко-розо­вая зона. При положительном результате прозрачная зона должна превышать ширину участка роста в 4 и более раз. Зона меньшего размера оценивается как сомнительный результат (рис. 9.5 – см. вклейку).

Положительный контроль: Staphylococcus aureus, Serratia mar­cescens.

Отрицательный контроль: Staphylococcus epidermidis, Entero­bacter aerogenes.

 

Тест на лизоцим (мурамидазу) используют для выявления фермента у стафилококков, стрептококков и др.

Принцип теста основан на появлении зон лизиса на тест-штамме.

Проведение теста. Определение следует проводить с между­народными эталонными штаммами Micrococcus luteus, рекомен­дованными для тестирования на лизоцим. Для реакции готовят густую суспензию 14 – 16-часовой агаровой культуры микро­кокка. Суспензию кипятят 20 мин, добавляют к расплавленно­му агару (рецепты 87–89, 93) в концентрации 2 млрд/мл взвеси по ОСО мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича, перемешивают, разливают в чашки Петри. После подсушивания застывших чашек на них петлей методом "бляшек" наносятся тестируе­мые культуры (продуцирующие и не продуцирующие лизоцим). Образование культурой лизоцима проявляется через 24–48 ч инкубации при 36±1 °С в виде зон просветления вокруг вырос­ших макроколоний.

Перед экспериментом целесообразно проверить тест-штамм Micrococcus luteus на лизируемость лизоцимом. Для этого, поль­зуясь отраслевым стандартом мутности, готовят 1-миллиард­ную микробную взвесь и разливают ее в 2 пробирки по 1 мл. В одну (опытную) добавляют 8 мкг лизоцима, растворенного в 1 мл физиологического раствора, создавая конечную кон­центрацию фермента 4 мкг/мл. Во вторую (контрольную) при­бавляют 1 мл физиологического раствора. Пробирки выдержи­вают при комнатной температуре 30 мин. Культура считается пригодной для работы, если за этот период в опытной пробир­ке произойдет полный лизис клеток микрококка.

Положительный контроль: продуцирующие лизоцим штам­мы Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes.

Отрицательный контроль: Bacillus megaterium.

 

Тест на гемолизин предназначен для выявления гемолизина у бактерий.

Принцип теста основан на гемолизе эритроцитов крови. Ферменты микроорганизмов – гемолизины разрушают гемо­глобин крови с разной степенью деструкции эритроцитов. Ви­ды гемолиза подразделяют на:

α-гемолиз – гемоглобин эритроцитов разрушается до метглобина (под микроскопом обнаруживаются цельные или час­тично разрушенные эритроциты) с появлением зеленовато-ко­ричневого ореола вокруг колоний микроба;

β-гемолиз – гемоглобин эритроцитов разрушается полнос­тью, происходит ферментативное обесцвечивание гемоглобина. Вокруг колоний образуется прозрачная зона гемолиза;

γ-гемолиз – гемолиз отсутствует, эритроциты остаются без изменения.

Гемолитические свойства микробов проявляются по-разно­му на средах с дефибринированной кровью человека, барана, кролика, морской свинки и т.д.

Проведение теста. В расплавленный и охлажденный до 48 – 50 °С 1,5 % МПА или в другую питательную среду (рецепты 65, 87–89, 93), предназначенную для кровяного агара, прибавляют 5 % дефибринированной крови. После розлива среды в чашки Петри на застывшую и подсушенную поверхность истощаю­щим штрихом делают посев 18-часовой культуры. Чашки ин­кубируют при 36±1 °С в течение 24–48 ч, после чего проводят учет результатов (рис. 9.6 – см. вклейку).

Для предохранения гемолизинов от разрушения кислородом посев культуры штрихом можно вначале произвести на пита­тельный агар без крови. Затем на первый слой наслоить 10 мл агара (при 48–50 °С) с 5 % крови. Вокруг погруженных в агар колоний гемолиз проявляется более четко. В некоторых случа­ях (например, у отдельных стафилококков) ß-гемолиз выявля­ется, если после 24 – 48-часовой инкубации чашек в термостате их помещают на 18 – 24 ч в холодильник.

При проведении реакции необходимо учитывать возможное воздействие на эритроциты образующихся органических кис­лот (молочной, муравьиной, уксусной и др.), которые могут вызвать изменения гемоглобина, сходные с α-гемолизом.

Положительный контроль (α-гемолиз): Streptococcus oralis.

Положительный контроль (ß-гемолиз): Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus.

Отрицательный контроль (γ -гемолиз): Staphylococcus epider­midis, Bacillus subtilis.

САМР-тест используют для дифференциации стрептококков группы В от остальных β-гемолитических стрептококков в сочетании с другими тестами. Наименование теста – по пер­вым буквам фамилий авторов метода (Christiae, Atkins, Munch-Peterson).

Принцип теста основан на увеличении гемолиза эритроци­тов культурой стрептококка группы В, продуцирующего вне­клеточный САМР-фактор, под действием β-токсина стафило­кокка при совместном выращивании штаммов.

Проведение теста. На центральную часть чашки Петри с 5 % кровяным агаром (рецепт 65) толщиной не более 3 мм петлей 2 – 4 мм вносят 18-часовую культуру стафилококка, продуцирующего токсин. Перпендикулярно линии посева, не доходя до нее, параллельными полосами вносят 18-часовые бульонные культуры (4–6) идентифицируемых штаммов стреп­тококка. Учет результатов проводят через 18–24 ч после ин­кубации при 36±1°С. При положительной реакции возникающий гемолиз в месте пересечения посевов стрептококка и стафило­кокка по форме напоминает "клин" или "крылья бабочки".

Положительный контроль: Streptococcus agalactiae группы В, осуществляющий ß-гемолиз.

Отрицательный контроль: Streptococcus spp. любой группы, не продуцирующий гемолизин.

Тест на уреазу предназначен для дифференциальной диа­гностики различных микроорганизмов.

Принцип теста заключается в способности бактерий, обла­дающих уреазой, гидролизовать мочевину, образуя аммиак и углекислоту. Это приводит к изменению pH среды, в которой выращивали микроорганизм, до щелочных показателей.

Проведение теста. 18-часовую агаровую культуру бактерио­логической петлей засевают в среду, содержащую мочевину (среда Кристенсена или Преуса – рецепт 66). Инкубацию про­водят при 35±1 °С в течение 24–48 ч. Среда, содержащая фе­ноловый красный, меняет окраску от желтой до красной. Сре­да, содержащая бромтимоловый синий, из желто-зеленой ста­новится синей.

Положительный контроль: Proteus vulgaris, Klebsiella pneumo­niae.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei.

 

Тест на протеолитическое разжижение желатина предназна­чен для дифференциальной диагностики различных микроор­ганизмов.

Принцип теста. Тест основан на гидролизе протеазами мик­роорганизмов (коллагеназами) белков желатина с утратой его желирующей способности, сопровождающейся разжижением желатина.

Проведение теста. Мясопептонный желатин (рецепт 67) разливают в пробирки столбиком по 5–6 мл. Посев исследуемой 18-часовой культуры производят уколом, погружая петлю до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, оставляют стоять в комнате при 20–22 °С. Ос­тальные посевы инкубируют в термостате при 36±1 °С. Вместе с опытными пробирками в термостат ставят одну или две пробирки с незасеянным желатином для контроля. При тем­пературе 36±1 °С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контрольных пробирках при­ступают к просмотру роста и учету результатов в питательной среде опытных пробирок. Если под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной среды. Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменения, остав­ляют в термостате для наблюдения в течение 20 сут. В прото­коле исследования обязательно отмечают день появления при­знаков разжижения среды, степень и характер ее разжижения.

Положительный контроль: Proteus mirabilis.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei.

 

Тест на пептонизацию казеина на молочном агаре Эйкмана предназначен для дифференциальной диагностики различных групп микроорганизмов.

Принцип теста основан на том, что бактерии, продуцирую­щие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка – казеина.

Проведение теста. Молочный агар Эйкмана (рецепт 68), разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают 18-часовой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные колонии. Через 24–48 ч инку­бации при 36±1°С при положительном результате вокруг ко­лоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочном фоне среды.

Положительный контроль: Lactococcus lactis.

Отрицательный контроль: Streptococcus (серогруппа В).

Тест на протеолиз куриного белка (в бульоне с куриным яич­ным белком) предназначен для дифференциальной диагностики различных групп микроорганизмов.

Принцип теста основан на том, что протеолитически актив­ные культуры микробов расщепляют коагулированный яичный белок.

Проведение теста. В пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернувшегося куриного белка (рецепт 69), вносят одну петлю 18-часовой культуры микроба и инкубируют при 36±1 °С. Посевы просмат­ривают ежедневно в течение 5 дней. При положительном ре­зультате кусочки белка, содержащиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются.

Положительный контроль: Proteus vulgaris.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei.

 

Тест на плазмокоагулазу и фибинолитический фермент пред­назначен для дифференциальной диагностики различных групп микроорганизмов. Наиболее часто используется для вы­явления патогенности стафилококков.

Принцип теста основан на ферментативной активации ес­тественной системы свертывания крови или соответственно на литическом действии.

Проведение теста. Метод 1. Для получения плазмы исполь­зуют кровь животных (кролика), взятую из сердца. В 10 мл крови вносят 1 мл стерильного 5 % раствора натрия цитрата, осторожно перемешивают, центрифугируют в стерильных цент­рифужных стаканах при 3000 об/мин. Очищенную от эритро­цитов плазму асептически отсасывают пастеровской пипеткой в пробирку и затем разливают по 0,5 мл в несколько агглюти-национных пробирок. Для исследования, помимо цельной плаз­мы, можно использовать разведенную не более чем в 2–4 раза. В пробирки вносят 1 петлю (диаметром 2–4 мм) 18-часовой микробной культуры. Контролем являются пробирки с плаз­мой без засева культуры, а также с инокулятом эталонного плазмокоагулирующего штамма стафилококка. Пробирки ин­кубируют при 36±1°С. Учет результатов проводят периодичес­ки в течение суток (через 30 мин, 1, 2 и 4 ч). Время плазмокоагуляции связано с уровнем ферментативной активности мик­роба. При положительной реакции с высокой степенью коагули­рующего действия штамма в плазме образуется плотный сгусток. В пробирках с разведенной плазмой сгусток рыхлый.

Одновременно у микроба можно установить наличие фибринолитической активности. С этой целью наблюдение за реак­цией в условиях 36±1 °С продолжается дополнительно 18–20 ч. Растворение сгустка свидетельствует о фибринолитической ак­тивности культуры.

Метод 2. Тест на коагулазу можно проводить на предметном стекле. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят 1 каплю кроличьей плазмы с антикоагулянтом и 1 каплю физиологического раствора. В каждую каплю петлей вносят 18-часовую культуру микроба. С помощью лупы отмечают по­явление агрегации. Если реакцию наблюдают в обеих каплях, то ее считают неспецифической и этот способ определения коагулазы непригоден.

Положительный контроль: Staphylococcus aureus.

Отрицательный контроль: Staphylococcus epidermidis.

 

Тест на лецитиназу предназначен для внутривидовой диф­ференциации иерсиний, выявления фермента у стафилококка, анаэробов и других микроорганизмов.

Принцип теста основан на том, что под действием лецитиназы на жиры желтка и его водорастворимые белковые веще­ства вследствие преципитации в среде формируется зона опалесценции. Фермент лецитиназа (фосфолипаза) гидролизует лецитин (из группы фосфатидов).

Проведение теста. Определение проводят на среде (рецепт 70), содержащей яичный желток (источник лецитина), на ко­торую штрихом до получения изолированных колоний вносят 18-часовую культуру. При положительной реакции вокруг ле-цитинферментирующих колоний после инкубации при 36+1°С через 24–48 ч возникает зона опалесценции.

Положительный контроль: Staphylococcus aureus, Yersinia, Clostridium perfringens.

Отрицательный контроль: Staphylococcus epidermidis, Staphy­lococcus saprophyticus, штамм Yersinia, не продуцирующий фер­мент, Clostridium butyricum.

Тест на липазу предназначен для дифференциальной диа­гностики Clostridium, Pseudomonas и других микроорганизмов.

Принцип теста основан на том, что под действием липазы происходит гидролиз липидов с визуальным выявлением воз­никающих продуктов.

Проведение теста. Метод 1. На среду с яичным желтком (рецепт 70, см. тест на лецитиназу) штрихом вносят 18-часовую культуру. Результаты учитывают через 24–48 ч культивирова­ния при 36±1 °С. При осмотре колоний при косом освещении в случае положительного результата над колонией возникает перламутровый блестящий слой.

Метод 2. К 20 мл расплавленного МПА (рецепт 71) добав­ляют 1 мл любого растопленного жира, к которому добавлен сернокислый нильский голубой. После тщательного перемеши­вания агар разливают в чашки Петри. Посев на чашки делают штрихом до образования единичных колоний. При положи­тельной реакции вокруг колоний возникает синий ореол.

Положительный контроль: Clostridium sporogenes.

Отрицательный контроль: Clostridium butyricum, Pseudomonas putida.

9.3.3. Окислительно-восстановительные ферменты бактерий

Для выявления активности наиболее распространенных у микроорганизмов окислительно-восстановительных ферментов (оксидаз и дегидрогеназ) используется ряд тестов. Так, опре­деление дегидрогеназ основано на введении в питательные среды (МПА, МПБ, молоко) красок, выполняющих роль ак­цепторов водорода. В результате присоединения водорода кра­ситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединенив, называемое лейкобазой. При доступе кислорода оно мо­жет вновь окисляться и приобретать прежний цвет.

Акцепторами водорода служат метиленовый синий, лакму­совая настойка, малахитовый зеленый, индигокармин, ней­тральный красный и др. Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Это свойство микроба использовано в микробиологической прак­тике в качестве дифференциального признака. Бактерии брюшного тифа редуцируют метиленовый синий, но не реду­цируют лакмуса и не изменяют нейтрального красного в про­тивоположность кишечной палочке, которая остается ней­тральной в отношении метиленового синего, но восстанавли­вает лакмус и нейтральный красный.

Тест на редуцирующую способность предназначен для диф­ференциации энтерококков, стрептококков и других микроор­ганизмов.

Принцип теста основан на том, что при наличии у микроба редуцирующей активности происходит обесцвечивание краси­теля.

Проведение теста. Метод 1. В 5 мл среды – молока с метиленовым синим (рецепт 72) – засевают петлю 18-часовой культуры с плотной питательной среды или 0,1 мл бульонной культуры и после 24 ч инкубации учитывают результаты роста. При положительной реакции на редукцию метиленового синего среда из голубой становится кремового цвета, а при слабопо­ложительной – приобретает зеленоватое окрашивание.

Метод 2. Пробирки с лакмусовым молоком, средой Мин-кевича (рецепт 73) засевают так же, как молоко с метиленовым синим, 18-часовой культурой с плотной или жидкой питатель­ной среды. Посевы инкубируют в термостате в течение 10 дней, ежедневно наблюдая за изменением цвета среды. Редукция лакмуса проявляется полным обесцвечиванием молока, имею­щего до посева розовато-сиреневый цвет.

Среда Минкевича позволяет также выявлять кислото- или щелочеобразование, выражающееся соответственно в покрас­нении или посинении молочной среды.

Тест на редукцию ТТХ предназначен для выявления у бак­терий окислительно-восстановительной активности. Метод часто используется у энтерококков.

Принцип теста основан на способности бесцветного 2-, 3-, 5-трифенилтетразолия хлорида восстанавливаться до трифе-нилформазана, который нерастворим в воде, но при растворе­нии в органических растворителях или под действием продук­тов жизнедеятельности микроорганизмов приобретает вишне­во-красный цвет.

Проведение теста. Бульонная или агаровая 18-часовая куль­тура высевается истощающим штрихом на чашки со средой, содержащей ТТХ (рецепт 74). После инкубирования посевов в течение 18–24 ч при 36±1 °С проводят учет результатов. У куль­тур, способных восстанавливать ТГХ, колонии были окрашены в вишнево-красный цвет. Штаммы, не обладающие редуци­рующей активностью или слабо ее проявляющие, имели соот­ветственно неокрашенные или бледно окрашенные колонии.

Положительный контроль: Enterococcus faecalis.

Отрицательный контроль: Enterococcus faecium.

 

Тест на оксидазу (цитохромоксидазу) предназначен для диф­ференциальной диагностики псевдомонад, энтеробактерий (ре­цепт 75).

Принцип теста основан на том, что при добавлении водного 1 % раствора тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорида с участием цитохрома образуется вещество вурстеровский синий и развивается пурпурно-красное окрашивание, переходящее через 10–30 мин в черное (метод Ковача). При добавлении к культуре α-нафтола из N,N-диметил-n-фенилендиамина обра­зуется индофенол и развивается синее окрашивание (метод Эрлиха).

Проведение теста. Выявление фермента оксидазы проводят с 18–20-часовой культурой, выращенной на чашке Петри с МПА (рецепт 93), на которую наливается свежеприготовлен­ный раствор 1 % тетраметилпарафенилендиамина гидрохлори­да. Культура, обладающая оксидазой, окрашивается в пурпур­но-красный цвет (метод Ковача) через 20–30 с. Для этого теста часто используют полоски ОКСИ-тест (А/О Лахема, Брно, Чешская Республика), на которых в зонах индикации после внесения по инструкции 18-часовой культуры платиновой пет­лей (под действием других металлов возможно каталитическое окисление реагента) примерно через 1 мин развивается синее окрашивание (метод Эрлиха).

Положительный контроль: Pseudomonas spp.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Shigella sonnei, Sal­monella typhimurium.

 

Тест на фермент каталазу предназначен для дифференциаль­ной диагностики энтеробактерий, микобактерий, стафилокок­ков и других микроорганизмов.

Принцип теста основан на том, что некоторые виды мик­роорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водорода. Анаэробы каталазу не образуют. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по мере образо­вания перекись расщепляется на воду и молекулярный кисло­род при участии фермента каталазы.

Проведение теста. На поверхность микробной культуры, выращенной в течение 18 ч на плотной питательной среде в чашке Петри (рецепты 87–89, 93), наносят 1–2 мл 3 % раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверх­ность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кислорода в результате расщепления перекиси водорода под действием ката-лазы. Для теста не следует использовать среды, содержащие непрогретую кровь, так как она обладает каталазной активностью.

Определение каталазы можно проводить на предметном стекле, на которое наносятся 1 капля свежеприготовленной 3 % перекиси водорода и 1 петля тестируемой культуры, выра­щенной на среде, не содержащей крови или ее компонентов. О наличии каталазы свидетельствуют образующиеся через 3–5 с пузырьки водорода.

Некоторые бактерии (молочнокислые) при отсутствии в среде глюкозы или при ее низком содержании могут обнару­живать "псевдокаталазу". Эта реакция предотвращается введе­нием в среду 1 % глюкозы.

Положительный контроль: Escherichia coli, Mycobacterium spp., Staphylococcus epidermidis.

Отрицательный контроль: Streptococcus spp., Clostridium spp., Lactococcus lactis.

 

Тест на восстановление нитратов до нитритов предназначен для дифференциальной диагностики энтеробактерий, нейссе-рий и других микроорганизмов.

Принцип теста. Восстановление нитратов до нитритов осу­ществляют микроорганизмы, имеющие фермент нитратредук-тазу и использующие нитраты как источник азота.

Проведение теста. Способность к восстановлению нитратов выявляют на среде (рецепт 77), состоящей из мясопептонного бульона и 0,2 % KNO₃. Среду разливают в пробирки, опускают "поплавки" (трубки Дюрхема) и стерилизуют при 112 °С 30 мин. В пробирки вносят 18-часовую культуру исследуемого штамма. Инкубируют при температуре 36±1 °С в течение 7–10 дней, начиная наблюдать за результатами через 24 ч. Образовавшиеся нитриты обнаруживают по крахмало-йодной пробе или с ре­активом Грисса.

Крахмало-йодная реакция на нитриты основана на том, что нитриты окисляют йодистый цинк в кислой среде с выделени­ем йода. Присутствие йода обнаруживают с помощью крах­мала.

Для выявления нитритов к 1 капле раствора, содержащего йодистый калий, ZnCl, и крахмал, добавляют 1 каплю культуры и 1 каплю раствора HCl. При наличии в среде нитритов воз­никает синее окрашивание.

Реакция на нитриты с реактивом Грисса. Реакция основана на образовании в присутствии нитритов и ароматических ами­нов (сульфаниловой кислоты и α-нафтиламина) соединения, окрашивающегося в кислой среде в красно-розовый цвет. Для выявления реакции к 1 капле культуры добавляют 1 каплю реактива Грисса (рецепт 77). Красное окрашивание свидетель­ствует о наличии нитритов. Накопление газа в "поплавке" свидетельствует о восстановлении нитритов до N₂.

Положительный контроль: Proteus vulgarus, Escherichia coli.

Отрицательный контроль: Micrococcus luteus, Bacillus sphaer-icus.

9.3.4. Пигменты микроорганизмов

В процессе жизнедеятельности некоторые микроорганизмы продуцируют пигменты, которые могут окрашивать не только колонии культуры (хромофорные пигменты, находящиеся в ци­топлазме, вакуолях, оболочке), но и питательную среду в ре­зультате их диффузии (хромопарные пигменты). Пигменты яв­ляются представителями вторичных метаболитов, синтезируе­мых микроорганизмами.

Пигментообразование выполняет у микроорганизмов важ­ные физиологические функции, обеспечивая выживание мик­робов в среде обитания. Так, некоторые пигменты обладают токсическим и антибиотическим действием, участвуют в про­цессах синтеза других веществ (окрашенные культуры чаще оказываются продуцентами различных антибактериальных ве­ществ) и дыхания (цитохромы и флавины), обеспечивают за­щиту клетки от УФ-лучей (каротиноиды). Поэтому пигменти­рованные колонии чаще других можно встретить при изучении микрофлоры УФ-облученных помещений.

Известны следующие пигменты микроорганизмов:

• красный, розовый или фуксинового цвета (продигиозин или пиролловый пигмент), выделяется серрацией ("чудесной" палочкой);
• черный или бурый (меланин), синтезируется бациллами, бак­тероидами, дрожжами, грибами;
• желтый или оранжевый (каротиноидные, липохромные пиг­менты разных оттенков), образуется стафилококками, сарцинами, микрококками, туберкулезной палочкой и др.;
• синий: пиоцианин (феназиновый пигмент) – характерен для синегнойной палочки, индигоидин (азахинон) – выделяется некоторыми псевдомонадами, коринебактериями, артробак-териями;
• флюоресцирующий желто-зеленый – пиовердин (производное птерина), синтезируется псевдомонадами, азотобактером, азомонасом;
• сине-зеленый – фикоцианин, продуцируется цианобактериями;
• фиолетовый – виолацеин, производное от индола, возникаю­щее при окислении триптофана, образуется хромобактером.

Одна культура может синтезировать два пигмента и более, различающиеся по условиям образования, цвету, химическому строению, растворимости, диффузионным свойствам, резистент­ности к внешним факторам и др. Например, штаммы псевдомонад могут продуцировать флюоресцирующий в УФ-лучах зеленый пиг­мент (пиовердин), красный (пиорубин), желтый (α-оксифеназин), черный (пиомеланин). По растворимости пигменты подразделяют на водорастворимые (пиоцианин, индигоидин и др.), нерастворимые в воде, но растворимые в спирте, ацетоне, эфире (продигиозин, липохромные пигменты и др.), нерастворимые в воде, спирте и сильных кислотах (меланин и др.).

Пигментирование зависит от многих факторов. Так, для син­теза пигментов требуются питательные среды, которые содер­жат факторы, необходимые для формирования этого признака. Например, на синтетической среде с глюкозой и 0,5 % смесью аминокислот как единственным источником азота (аспарагин, аланин, аргинин, гистидин, лейцин, валин, триптофан, тиро­зин, фенилаланин), бактерии группы Bacillus subtilis через 72 ч выращивания синтезируют черный пигмент, а при снижении концентрации аминокислот в 2 раза пигмент становится бу­рым. При исключении из сред микроэлементов колонии не имеют пигмента. Отсутствие отдельных аминокислот (аспарагина) из указанного комплекса увеличивает время появления меланина в среде или приводит к его утрате.

Известно, что для синтеза пиоцианина необходимо присут­ствие в среде аланина, глицерина, ионов Mg²⁺ и К⁺ или соединений серы в виде сернокислых солей. У некоторых ви­дов Candida на средах, содержащих железо, образуются темно-красные колонии, обусловленные особым пиразиновым пигмен­том пульхерримином. Иногда синтез пигмента выражен лучше на сахаросодержащих средах или средах, в которые добавлены молоко, кровь, яйца и др.(стафилококки).

У аэробов пигментообразование нуждается в достаточном уровне кислорода, тогда как облигатные анаэробы (Bacteroides niger и др.) синтезируют меланин без доступа кислорода.

Важным фактором образования пигментов является темпе­ратура. Например, для синтеза пиоцианина у Pseudomonas aeru­ginosa оптимальной является температура 30–37 °С, а для про-дигиозина у Serratia marcescens и многих каротиноидов (у Sta­phylococcus aureus и др.) благоприятнее 22–25 °С.

Поскольку пигментообразование является достаточно стой­ким фенотипическим признаком микроорганизмов, его ис­пользуют как дифференциально-диагностический показатель при идентификации микроорганизмов. С целью стимуляции пигментообразования применяют специальные питательные среды. Например, для более интенсивного проявления пиоци­анина и других феназиновых пигментов используют среду Кинга А (рецепт 78), для проявления липохромных пигментов стафилококка – среду Петровича с молоком (рецепт 80) или среду Чистовича с яйцом (рецепт 81).

Тест на образование пиоцианина и других феназиновых пиг­ментов у Pseudomonas предназначен для дифференциальной диагностики псевдомонад и других микроорганизмов.

Принцип теста основан на выявлении на специальной среде пигментов разного цвета.

Проведение теста. Методом штриха инокулируют пробирки или чашки со средой Кинга А (рецепт 78) 18-часовой агаровой культурой. Инкубацию проводят при 35±2 °С. Результаты учи­тывают через 24, 48 и 72 ч. При положительном результате наблюдается появление в среде пигментов разного оттенка. Сине-зеленый цвет – пиоцианин – характерен для Pseudomonas aeruginosa. Желто-оранжевый цвет – феназин-1-карбокарбок-сильная кислота – для Pseudomonas aerofaciens. Бледно-желтый цвет – оксихлорорафин – для Pseudomonas chlororaphs. Пигмент может быть в виде кристаллов из-за плохой растворимости.

Положительный контроль: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomo­nas aerofaciens, Pseudomonas chlororaphs.

Отрицательный контроль: Escherichia coli.

 

Тест на образование флюоресцирующего пигмента предназна­чен для выявления флюоресцирующего пигмента у Pseudomo­nas (желто-зеленый), Beijerinckia, Azomonas, Azotobacter (зеленый или белый).

Принцип теста основан на способности разных родов мик­роорганизмов на специальной среде синтезировать флюорес­цирующие пигменты разного цвета.

Проведение теста. Методом штриха инокулируют пробирки или чашки со средой Кинга Б (рецепт 79) 18-часовой агаровой культурой. Инкубацию проводят при 23±2 °С с учетом резуль­татов через 24, 48 и 72 ч под УФ-лучами (<260 нм). Облучение не должно быть длительным из-за возможного антибактери­ального эффекта. Положительная реакция обнаруживается по флюоресценции участков вокруг зоны роста.

Положительный контроль: Pseudomonas fuorescens.

Отрицательный контроль: Escherichia coli.

 

Тест на каротиноидный пигмент у стафилококков предназна­чен для их идентификации по пигментообразованию.

Принцип теста основан на способности золотистого стафи­лококка продуцировать золотисто-желтый пигмент.

Проведение теста. Методом штриха или реплик чашки со средой Петрович (рецепт 80) инокулируют 18-часовой агаровой культурой. Через 18–24 ч инкубации при 25–30 °С проводят учет результатов. На поверхности чашек должны формировать­ся золотисто-желтые колонии Staphylococcus aureus.

Положительный контроль: Staphylococcus aureus.

Отрицательный контроль: Staphylococcus epidermidis.

9.3.5. Спорообразование у микроорганизмов

Споры у микроорганизмов (за исключением некоторых ша­ровидных и извитых бактерии Sporosarcina, Spirillum, Desulfo-tomaculum, Desuffovibrio) выявлены только у палочковидных мик­роорганизмов. Они формируются при неблагоприятных условиях обитания (голодание, высушивание, низкие температуры, чрез­мерная инсоляция, действие высокой температуры, изменение pH и др.). Споры образуются внутри клетки (эндоспоры) и выхо­дят из нее при аутолизисе. Они являются структурой, обеспе­чивающей сохранение жизнеспособности и наследственной ин­формации (за 50 лет хранения остаются жизнеспособными до 10 % спор). Помимо эндоспор, у некоторых микроорганизмов имеются хламидоспоры (Candida и др.), цисты ("артроспоры" у Beijerinckia, Azotobacter и др., "микроцисты" у Methylocystis и др.), а также экзоспоры (отдельные виды пурпурных и метан-утилизирующих бактерий и др.). Образование хламидоспор свя­зано с утолщением стенок вегетативной клетки и накоплением резервных веществ. "Артроспоры" формируются путем фраг­ментации бактерий. "Микроцисты" образуются из всей веге­тативной клетки, как правило, при истощении субстрата.

Характерным признаком спорообразующих бактерий явля­ется прекращение ростовых процессов и репликации ДНК и, следовательно, низкое содержание в ДНК пар оснований гуа­нина и цитозина (G+C), (на уровне 22–27 мол.%). Процесс спорообразования начинается с уплотнения участка цитоплаз­мы с нуклеоидом. Затем начинает формироваться проспора с отделением спорогенной области посредством врастания цитоплазматической мембраны внутрь клетки. Между наружной и внутренней мембранами споры создается пептидогликановый слой. Далее на внешней стороне мембраны появляется плотная оболочка, состоящая из белков, липидов и других биополиме­ров, которые отсутствуют в вегетативной клетке. Например, образуется дипиколиновая кислота и затем дипиколинат кальция, обеспечивающий споре термоустойчивость. Через 18–20 ч процесс спорообразования оканчивается отмиранием вегета­тивной клетки. Сформированная спора может быть разной формы (эллипсоидная, круглая, цилиндрическая). Спора зани­мает в клетке разное положение: терминальное (Clostridium tetani), субтерминальное (Clostridium botulinum, Clostridium novyi), центральное (Clostridium perfringens), парацентральное (Ba­cillus laterosporus, Bacillus macerans). За эндоспоры можно оши­бочно принять гранулы внутриклеточных включений (глобу­лы). Центральная часть споры содержит белки и нуклеиновые кислоты, составляющие до 50–60 % сухой массы споры. Кроме того, в споре содержатся рибосомы, ферменты, липиды и дру­гие биополимеры. У многих бактерий спора заключена в эк-зоспориум – многослойную структуру, сходную с мешком. Например, экзоспориум Clostridium botulinum имеет 15 слоев с общей толщиной 100 нм.

При попадании в благоприятную атмосферу происходит прорастание споры и превращение ее в вегетативную клетку. Процесс длится около 4–5 ч. При этом наблюдается набухание споры (увеличивается содержание в ней воды). Активизируют­ся ферменты энергетического и конструктивного метаболизма. Затем под действием литических ферментов происходит разру­шение споровой оболочки и выход из нее ростовой трубки. Возникшая вегетативная клетка начинает процесс деления. Процесс прорастания могут индуцировать различные вещества (глюкоза, аланин, кратковременное нагревание до 60 °С в те­чение нескольких минут и т.д.).

Существенное освобождение культуры от вегетативных кле­ток достигается стимуляцией спорообразования при оптималь­ных условиях роста или нагреванием суспензии бактерий. Для уеиления спорообразования были созданы специальные среды, например для выращивания микробов рода Bacillus (рецепт 82).

Способностью формировать споры обладает сравнительно небольшая часть патогенных и непатогенных микробов. Выяв­ление спор в культуре проводят, окрашивая бактериальные клетки с использованием специальных методов.

Наличие способности к образованию спор, а также их фор­ма, размер, локализация являются важными дифференциаль­но-диагностическими признаками микроорганизмов.

Тест на спорообразование (эндоспоры). Тест предназначен для выявления способности бактерий формировать эндоспоры.

Принцип теста основан на сохранении спор в клетках после их прогревания.

Проведение теста осуществляется засевом петлей 72–96-ча­совой агаровой культуры (рецепты 87–89, 93) в питательный бульон с 3 мл среды (рецепты 90, 92). Среда после засева должна оставаться прозрачной. Для пастеризации засеянную пробирку помещают в водяную баню (70 °С) на 15 мин, а затем инкубируют при 36±1 °С в течение 48–72 ч. Помутнение бу­льона после инкубации указывает на присутствие термоста­бильных спор. Для дополнительного тестирования суспензию окрашивают на наличие спор. Методика не должна использо­ваться с экстремальными термофилами.

Положительный контроль: Bacillus spp., Clostridium spp.

Отрицательный контроль: Escherichia coli, Staphylococcus aureus.

9.3.6. Тесты на другие физиологические признаки

Помимо приведенных физиологических тестов для иденти­фикации микроорганизмов используют также их свойство рас­ти в пределах определенных температур (см. раздел 9.2.2) и передвигаться с помощью жгутиков.

Тест на отношение микроорганизмов к температуре. Тест предназначен для определения предела оптимальной темпера­туры культивирования изучаемого микроорганизма.

Принцип теста основан на различии в оптимуме температур роста различных микроорганизмов. Поскольку большинство патогенных и непатогенных микроорганизмов, с которыми проводится работа в бактериологических лабораториях, отно­сятся к мезофилам, это объясняет выбор изучаемых темпера­тур.

Проведение теста. Для этого штрихом засевают 18-часовую тестируемую культуру в пробирки со скошенной питательной средой (рецепты 87–89, 93) (по 2 косяка на каждую темпера­туру) и помещают в термостаты с 20, 30, 37, 42, 48 °С. Одно­временно делают посевы с культурами на отрицательный и положительный контроль роста. Через 2–3 сут визуально от­мечают интенсивность роста микроба с оценкой по 4-балльной системе: 0 – отсутствие роста, 1⁺ – слабый рост, 2⁺ – хоро­ший рост, 3⁺ – очень хороший рост, 4⁺ – отличный рост. За­тем проводят 3 пассажа культуры, используя в качестве посев­ного материала предыдущие пассажи от соответствующей тем­пературы. На основании совокупных результатов делают заключение об оптимальной температуре роста микроорганиз­мов.

При необходимости определения оптимальной температуры у психрофилов и термофилов тестирование проводят в диапа­зоне температур соответственно от –5 до 20 °С и от 50 до 80 °С.

Положительный контроль для мезофилов: Escherichia coli, Sta­phylococcus epidermidis.

Отрицательный контроль для мезофилов: Bacillus subtilis, Ba­cillus coagulons.

Положительный контроль для психрофилов: Bacillus globis-porus, Candida species.

Отрицательный контроль для психрофилов: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis.

Положительный контроль для термофилов: Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulons.

Отрицательный контроль для термофилов: Candida sp., Esche­richia coli.

Тесты на подвижность и стимуляцию образования жгутиков. Тесты предназначены для выявления способности микробов к передвижению и образованию жгутиков.

Принцип теста основан на создании оптимальных условий для выявления подвижности микроорганизмов.

Проведение теста. Метод 1. Тестирование осуществляется посевом 18-часовой агаровой культуры методом укола в про­бирку с 8 мл полужидкого питательного агара (0,3–0,4 % агара) (рецепт 93) на глубину 5 см. Учет результатов проводят через 24–48 ч инкубации при 36±1 °С. При положительном резуль­тате отмечается диффузное помутнение среды или помутнение вокруг места посева. Неподвижные микробы растут только по месту укола петли. При отрицательном результате целесообраз­но провести тестирование в U-образных трубках с 0,2 % пита­тельном агаром, а также инкубировать засеянные пробирки при 23±2 °С в течение 5–7 дней, так как некоторые бактерии (энтеропатогенные иерсинии и др.) подвижны при температуре ниже 30 °С и неподвижны при 37 °С.

Метод 2. Тест выполняется на среде с высоким содержани­ем фосфатов (рецепт 83), стимулирующих образование жгути­ков. Особенностью инокуляции в этом тесте является исполь­зование 18-часовой посевной культуры, взятой с периферии роста полужидкого агара. Пробирки инкубируют при 23±2 °С в течение 18–24 ч. Помимо наблюдения подвижности в полу­жидком агаре, у выросших клеток после соответствующей ок­раски можно определить расположение и форму жгутиков.

Положительный контроль: Proteus vulgaris.

Отрицательный контроль: Staphylococcus aureus.