9.2.1. Рост и размножение микроорганизмов

Ростом микроорганизмов называют генетически контроли­руемое увеличение биохимических компонентов клетки. Росту бактерий сопутствует увеличение размера и биомассы клеток. При этом следует разделять понятия "увеличение клеточной массы", или "плотности бактерий" (единицы массы на единицу объема среды), и "увеличение количества клеток" (концентра­ция бактерий в единице объема среды). Например, при кон­центрации клеток дрожжей 10¹⁰/мл биомасса составляет около 1 г. При малых размерах клеток масса 10¹⁰ бактерий/мл будет значительно меньше. Увеличение биомассы или концентрации бактерий в единице объема среды характеризует процесс раз­множения клеточной популяции, произошедшей из одного кло­на. Помимо этого, существует термин "развитие микроорганиз­мов", означающий совершенствование во времени их структур­ной организации и функций. Для этого часто используют тер­мин "плотность популяции". При размножении бактериальная клетка, достигая определенного размера, делится в различных плоскостях поперечной перегородкой на две дочерние клетки (бинарное деление). Это вегетативное (бесполое) размножение, при котором деление клетки связано с делением ее нуклеоида, с репликацией ДНК. Механизм репликации ДНК выражается в разрыве водородных связей между ее двумя полинуклеотидными цепями, раскручивании их и синтезе вдоль каждой старой цепи новых цепей с комплементарной последовательностью пуриновых и пиримидиновых оснований. После расхожденияв дочерние клетки по одной старой и одной новой полинуклеотидной цепи между ними восстанавливаются водородные связи и формируется полуконсервативная двухцепочечная ДНК. Однако репликация ДНК и деление нуклеоида не всегда син­хронизированы с делением клетки.

В связи с этим процессу деления присущи следующие осо­бенности:

• деление клеток многократно и опережает их расхождение, способствуя образованию цепочки кокков или многоклеточ­ных палочек;
• одновременно происходящие процессы деления нуклеоида и расхождения клеток обеспечивают формирование равно­ценных одноклеточных особей;
• деление нуклеоида предшествует клеточному делению, вследствие чего образуются многонуклеоидные микроорга­низмы.

Некоторые способы разъединения поделившихся клеток также могут оказать влияние на морфологические свойства бактерии:

• разрыв цитоплазматического мостика с последующим раз­делением клеток путем перелома (иногда многократного) и их сохранением вместе, как у Bacillus anthracis (с сохране­нием клеток внутри капсулы);
• разъединение, при котором одна из дочерних клеток, не отрываясь от точки деления, передвигается по дуге и создает V-образную форму (Corynebacterium, Arthrobacter, Bifidobac­terium, Brevibacterium и др.);
• разъединение с обособлением одной из клеток путем дви­жения по поверхности другой (некоторые виды Escherichia и др.).

Под влиянием неблагоприятных внешних факторов (соли желчных кислот, УФ-лучи, ПАВ, антибиотики и т.д.) деление клетки может остановиться с сохранением ее роста. В таком случае возможно образование удлиненных нитевидных клеток.

В соответствии с ориентацией плоскостей и особенностями деления образуются различные формы микроорганизмов: пар­ные клетки (Neisseria, Moraxella и др.), цепочки (Streptococcus и др.), гроздья (Staphylococcus и др.), пакеты (Sarcina и др.).

Некоторые облигатные внутриклеточные паразиты делятся би­нарно подобно бактериям (риккетсии), другие (Chlamydia) раз­множаются иным способом. К делению в клетках макроорга­низма способны лишь вегетативные формы хламидий (ретикулярные или инициальные тельца). Их цикл, состоящий из нескольких делений, завершается образованием промежуточ­ных форм, из которых формируются элементарные тельца, даю­щие начало вегетативным формам. После разрушения стенки вакуоли и клетки-хозяина элементарные тельца высвобожда­ются, и цикл повторяется. Цикл длится 40–48 ч.

Микоплазмы репродуцируются через мелкие элементарные овоидные или сферические тела (130–220 нм), которые делят­ся посредством фрагментации или почкования.

Интервал времени, в течение которого происходит удвоение количества бактерий, называют временем генерации (%). Важ­ным параметром является количество генераций (n). Количество удвоений в единицу времени называют абсолютной (общей или валовой) скоростью роста (v). Прирост биомассы за определен­ный период времени, отнесенный к единице биомассы, назы­вают удельной скоростью роста (μ):

где logX₁ – logX₀ – разность логарифмов конечной и началь­ной концентрации бактерий за период наблюдения; dX– при­рост количества биомассы за бесконечно малый промежуток времени (в г/мл или в микроб/мл); dt – период наблюдения (ч).

Поскольку активное деление клеток происходит в геомет­рической прогрессии (X₀→Х₀ ×2¹ →Х₀ ×2² →Х₀ ×2³ →… →Х₀ ×2ⁿ), применяются не абсолютные цифры, а их лога­рифмы.

Через несколько генераций клетки стареют и отмирают. Общую скорость отмирания (v) и удельную скорость отмира­ния (ε) определяют по тем же формулам, но со знаком "–" (минус).

Скорость размножения микроорганизмов и время генера­ции зависят от вида микроорганизма, величины и свойств инокулята, состава питательной среды, ее pH и Eh, аэрации, температуры инкубации, других факторов.

При благоприятных условиях у многих микроорганизмов деление происходит через 15–30 мин (например, у Escherichia coli, Salmonella typhi и др.). У прихотливых микроорганизмов (Streptococcus, Corynebacterium и др.) деление осуществляется через 45–90 мин и более (например, у Mycobacterium tuberculo­sis – через 18 ч).

В процессе питания микроорганизмов происходит убывание питательных веществ, потребляемых клеткой. Через определенный период, когда исчерпается ключевой (лимитирующий) ком­понент среды, рост прекращается. Количество биомассы, про­дуцируемой на единицу потребленного субстрата, называется экономическим коэффициентом (Y), часто со знаком "–", так как S (концентрация субстрата) уменьшается, а X (количество биомассы) возрастает. Следова­тельно, неограниченный рост в закрытой (от доступа дополни­тельных питательных веществ) периодической (статической) куль­туре невозможен.

Поскольку питательные вещества, помимо конструктивного обмена, используются для энергетического обмена, скорость потребления субстрата можно выразить через метаболический коэффициент.

В этом соотношении просматривается связь основных по­казателей, характеризующих физиологические процессы в клетке.

При определении количества биомассы (урожая) и интен­сивности клеточного метаболизма в клетке можно использовать различные методы:

• Взвешивание сырых или высушенных осадков бактериаль­ной массы после предварительного центрифугирования культуры, выросшей в жидкой или плотной среде (смыв физиологическим раствором). Метод неточен из-за нестан­дартности методических манипуляций.
• Определение нескольких показателей клеточного обмена: об­щего азота (например, по Кьельдалю), содержания клеточ­ного белка (часто используют методы анализа по Лоури или Фолину), содержания нуклеиновых кислот (например, по Спирину), общего количества углеводов, органических кис­лот – пировиноградной, α-кетоглутаровой и др. (любым био­химическим методом). Эти показатели являются в клетке относительно постоянными.
• Измерение оптической плотности (или экстинкции) клеточ­ных суспензий (бульонная культура или смыв с плотной среды). С этой целью используют методы нефелометрии или турбидиметрии.
• Определение общей концентрации клеток в счетной камере. В счетную камеру, представляющую собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками на ячейки (например, в камеру Тома глубиной 0,01; 0,02 мм для подсчета бактерий или в камеру Горяева для спорообразующих микроорганиз­мов) в виде сетки из вертикальных и горизонтальных квад­ратов, пипеткой или наконечником с тонким концом вносят суспензию бактерий (как правило, разведенную в 2,5; 5; 10; 20; 40 раз и т.д.). Затем осторожно накрывают сетку шлифованным плоскопараллельным покровным стеклом так, чтобы в жидкости не образовались пузырьки воздуха. Боль­шими пальцами рук покровное стекло притирают к плос­кости счетной камеры, слегка смоченной спиртом в местах их соприкосновения. Затем стекло двигают сверху вниз до образования радужных колец в местах шлифовки.

Перед микроскопированием после заполнения камеры не­обходим 2–3-минутный интервал, чтобы осевшие клетки ока­зались в одной плоскости для удобства подсчета. Подсчет про­водят с объективом ×8. Для более детального подсчета приме­няют большее увеличение. Подсчитывают количество по 10 малых квадратов на вертикальной и горизонтальной сторонах клетки, а также по диагонали. Поскольку точность определе­ния зависит от техники подготовки камеры к работе и коли­чества подсчитанных микробов, камера заливается суспензией не менее 3 раз с концентрацией по 150–200 клеток. Количе­ство клеток в пересчете на 1 мл суспензии подсчитывают по формуле:

где К – исходное разведение суспензии; n – количество под­считанных малых квадратов в сетке; Т– среднее количество бактерий в n малых квадратах; V – объем малого квадрата, см³.

• Определение колониеобразуюших единиц (КОЕ/мл). При вы­ращивании культуры микроорганизмов в благоприятных ус­ловиях роста на поверхности или в глубине плотной среды жизнеспособные клетки образуют колонии. Для получения отдельных колоний дозированно, стерильной пипеткой, на чашки Петри (в 3 повторностях или более) высевают сус­пензию микробных клеток, приготовленную в необходимой концентрации (по стандарту мутности, в разведении, с при­менением счетной камеры).

Затем внесенную суспензию растирают шпателем или зали­вают на первый слой среды 3,5 мл 0,7 % МПА с определенным разведением культуры. Для анаэробов после застывания полу­жидкого агара можно внести третий слой плотной среды. По­сле выращивания микроорганизмов при оптимальных для них температуре и времени инкубации в термостате или анаэро-стате подсчитывают количество колоний в 1 мл. Результат выражают в колониеобразуюших единицах на 1 мл (КОЕ/мл). Наиболее достоверным считается среднее арифметическое ко­личества колоний, выросших на одной чашке, в пределах 100– 150 колоний. При концентрации микроорганизмов на чашке больше этих значений возникает нехватка питательных ве­ществ, вырастает меньшее количество колоний, более мелких по размеру, т.е. происходит искажение результатов. При коли­честве колоний менее 10 достоверность результатов снижается.

Примеры расчета. Из суспензии, приготовленной по стан­дарту 10 единиц (10⁹ клеток/мл), делают серию последователь­ных 10-кратных разведений. Из разведения 10^-5 (10 000 кле­ток/мл), 10^-6 (1000 клеток/мл), 10^-7 (100 клеток/мл) высевают суспензию не менее чем в 3 чашки Петри (для каждого разве­дения) по 0,1 мл, чтобы получить соответственно 1000, 100 и 10 клеток на чашке.

Пример 1. В среднем на одной чашке из разведения 10^-5 выросло 600 мелких колоний, на 10^-6 – 90 колоний с типич­ной морфологией и размером, на 10^-7 – 6 типичных колоний. Наиболее адекватный результат получен в разведении 10^-6. Поэтому количество жизнеспособных бактерий в пересчете на 1 мл равно 90х107 или 90×10⁸ КОЕ/мл.

Пример 2. Среднее количество колоний оказалось: 10^-5 – 600 колоний, 10^-6 – 90 колоний, 10^-7 – 12 колоний. Расчет количества на 1 мл проводится по разведениям 10^-6 и 10^-7, так как в разведении 10^-7 количество колоний исчисляется не единицами, а десятками. Это число при пересчете на разведе­ние 10^-6 соответствует 120 колониям. Следовательно, средне­арифметическое количество жизнеспособных колоний в 1 мл будет:

Рост периодической культуры в закрытой системе происхо­дит в соответствии с определенными закономерностями, кото­рые отражает кривая роста.

На рис. 9.1 показаны 5 основных фаз роста периодической культуры в жидкой среде, каждая из которых характеризуется определенным размером клеток, скоростью размножения и потребления субстрата, синтезом метаболитов и т.д.

Фаза I – фаза задержки роста, или лаг-фаза (от англ. lag – отставание). Начало лаг-фазы связано с адаптацией клеток к среде обитания. При этом важную роль играет "предыстория" выращивания посевной культуры. Длительность лаг-фазы за­висит от многих факторов. Если использован инокулят из культуры с резко отличающимися условиями выращивания, клеткам требуется время на синтез новых рибосом, РНК и адаптивных ферментов. В этом периоде не только увеличива­ется размер клеток, но и в 8–12 раз повышается содержание РНК. Деления клеток при этом почти не происходит. Полно­ценная среда, физиологически активная посевная культура, которая подготовлена к синхронному делению и др., способ­ствуют короткой лаг-фазе (или ее отсутствию) и переходу ко II фазе. Синхронизации можно достичь с помощью понижен­ной температуры, ограничения питательных веществ, фильтрации, обеспечивающей пропускание клеток определенного раз­мера. Синхронизация длится 2–4 генерации, а далее наступает асинхронный рост. Лаг-фаза в среднем длится 1–2 ч.

Рис. 9.1. Основные фазы роста периодической культуры в жидкой среде.

Фаза II – фаза экспоненциального, или логарифмического, роста (отрезок кривой роста подчиняется логарифмической зависимости – логарифм количества клеток увеличивается ли­нейно). Это фаза наивысших физиологических показателей. Однако клетки имеют наименьший размер. Поскольку попу­ляция бактериальной культуры состоит из делящихся клеток, она достаточно стандартна по своим свойствам (содержание белка, НК, наиболее выраженные видовые признаки). Поэтому эта фаза удобна для определения многих параметров популя­ции (плотность бактерий, скорости роста и потребления суб­страта, содержание биополимеров клетки и т.д.).

В этот период отмечено снижение резистентности к агрес­сивным веществам. В среднем продолжительность фазы со­ставляет 5–6 ч.

Фаза III – фаза замедления скорости роста. Количество пи­тательных веществ существенно уменьшается (отмечается воз­действие на бактерии лимитирующих факторов), в культураль-ной жидкости накапливаются метаболиты, в том числе и ток­сичные для бактерий (отмечается ингибирующее воздействие). Эта фаза длится около 2 ч.

Фаза IV – стационарная фаза, или фаза максимальной кон­центрации (М-концентрация). Клетки перестают делиться. Ко­личество жизнеспособных бактерий соизмеримо с количеством отмирающих. В этот период клетки переходят на эндогенные субстраты (окисляют запасные вещества, белки, углеводы, липиды, в связи с чем уменьшается количество биомассы).

Длительность стационарной фазы различается у разных микроорганизмов. Например, у Escherichia coli она наступает через 18–24 ч, у Azotobacter – через 72 ч с момента внесения инокулята в питательную среду.

Фаза V – фаза отмирания, характеризуется массовой гибе­лью бактерий. В бактериальной популяции отмечается образо­вание инволюционных форм, аутолиз под действием собствен­ных ферментов. У бактерий меняются морфологические и био­химические свойства. Гибель может наступить через несколько дней, недель, месяцев.

Периодическое культивирование в жидких средах в пробир­ках, колбах, бутылях проводят на качалках или с барботажем, а в ферментерах – с механическими мешалками.

Периодическое культивирование на плотных средах имеет примерно такие же фазы, однако плотность культуры на 1 мл среды значительно выше.

В периодической культуре условия роста в процессе выра­щивания бактериальных клеток динамичны: изменяются коли­чество белкового и углеродного субстрата, величина pH, пока­затель Eh, содержание кислорода и т.д. Так, величина pH влияет на активность ферментов. В некоторых случаях необ­ходимо, чтобы клетки находились длительный срок в фазе экспоненциального роста, имея достаточное количество пита­тельных веществ. С целью равномерного распределения суб­страта и кислорода при выращивании микроорганизмов в фер­ментерах были разработаны способы культивирования, в рав­ной мере обеспечивающие эти условия.

• Продленный периодический процесс с "подпиткой" культуры, при котором периодически добавляют питательные вещест­ва.
• Многоциклическое культивирование, представляющее собой повторяющиеся циклы периодического выращивания, по­севной культурой в которых служит суспензия предыдущего цикла.
• Полунепрерывный способ, при котором в середине экспонен­циальной фазы роста отбирается половина культуральной жидкости, а вместо нее вносится свежая питательная среда.
• Непрерывно-проточный способ, при котором в ферментер с культурой постоянно подается питательная среда и слива­ются продукты метаболизма с биомассой. Таким способом можно поддерживать оптимальные условия роста с посто­янными скоростью роста и концентрацией бактериальных клеток. Это открытая система, стремящаяся к динамичес­кому равновесию. Фактор времени в ней отсутствует, т.е. культивирование может продолжаться неограниченно долго.

Для получения непрерывных культур применяют хемостаты и турбидистаты. В хемостатах рост регулируется через содержа­ние веществ в субстрате. Под действием лимитирующего фак­тора (например, концентрации глюкозы, фосфора, серы и т.д.) можно изменять плотность микробных клеток в единице объе­ма среды. Скорость разбавления среды не должна превышать µ_max. В турбидистате воздействие на популяцию осуществляется по сигналу фотоэлектрического элемента, контролирующего оптическую плотность культуры. Скорость разбавления свежей средой устанавливается в соответствии с требуемой плотнос­тью. Турбидистаты могут работать по принципу pH-стата, СO₂-стата, окси-стата и т.д.

Непрерывные культуры микроорганизмов целесообразно использовать для получения большого количества микробной массы или метаболитов.

9.2.2. Жизнеспособность микроорганизмов в искусственной и естественной среде обитания

Жизнедеятельность микроорганизмов в искусственной и ес­тественной среде обитания (соответственно питательные среды и окружающая среда) зависит от многих факторов, которые можно разделить на физические, химические и биологические.

Сведения о влиянии показателей, связанных с процессами питания, дыхания и размножения, изложены в разделах 9.1.1– 9.2.1. Среди физических факторов наибольшее значение имеет прежде всего температура, так как микроорганизмы не обла­дают механизмом терморегуляции и жизнеспособность микро­бов зависит от условий среды обитания. По отношению к температурному воздействию микроорганизмы подразделяют на психрофилов, мезофилов и термофилов.

Психрофилы (от греч. рзуспгов – холодный) – холодолюбивые (криофильные) микроорганизмы. Они растут и размножаются в температурных пределах, при которых вода доступна для них. С повышением температуры до неоп­тимальных значений активность ферментов, имеющих низко­температурный оптимум действия, быстро снижается, а ско­рость роста замедляется. Психрофилы обитают в пределах тем­ператур от –5 до +20 °С с оптимумом для размножения от 10 до 20°С. Факультативные психрофилы имеют более широкую температурную шкалу: от –5 до +30°С с оптимумом роста 20–25°С. Облигатные психрофилы характеризуются отсутстви­ем способности расти при температуре свыше 20 °С.

Ареал обитания психрофилов – северные моря, океаны, глубоководные озера, почва зон вечной мерзлоты. В эту группу входят также микроорганизмы, вызывающие порчу пищевых продуктов при низких температурах, а также некоторые светя­щиеся и железобактерии и т.д.

Мезофилы (от греч. mesos – средний) – микроорганизмы, обитающие в условиях средних температур от 10 до 45°С с оптимумом роста 28–37°С. Термотолерантные микробы про­должают расти при 50°С. К этой группе относятся все пато­генные микроорганизмы, вызывающие заболевания у человека и теплокровных животных, а также значительная часть сапрофитов.

Термофилы (от греч. termos – тепло, жар) – микроорганиз­мы с ареалом жизнеспособности в пределах от 30 до 75°С с оптимумом роста при 50–60°С. Их обнаруживают в самона­гревающемся субстрате (навоз, сено, зерно), в верхних слоях почвы, в кишечнике теплокровных животных и человека. Сре­ди них существуют факультативные термофилы, развивающие­ся как при температуре около 10°С, так и при 55–60°С. Они способны к метаболизму не только термофильного типа, но и мезофильного. Однако переход от одного метаболического ти­па к другому осуществляется после периода адаптации.

Кроме того, известны экстремальные термофилы с темпера­турным оптимумом около 70°С (Bacillus, Clostridium, Thermomi-crobium, Thermus, Thermotrix и др.), которые обитают в воде и иле горячих источников. Некоторые экстремальные термофи­лы обнаруживаются при 80°С (Sulfolobus acidocaldarius) и даже при 105°С (Pyrodictium occultum, анаэроб, восстанавливающий серу). Особенностью экстремальных термофилов является вы­сокая терморезистентность клеточной стенки, мембраны, ри­босом, а также ферментов (оптимум действия ферментов около 70°С).

Необходимо отметить, что способность расти и размножать­ся в определенных интервалах температур (см. разд. 9.3.6) не равнозначна способности переносить необычную для них тем­пературу, т.е. сохранять жизнеспособность. Высокие темпера­туры оказались более губительны для микробов, чем низкие. При попадании микроба в условия выше температурного пре­дела наблюдаются нарушение активности ферментных систем, денатурация белка, разрушение других структур и в целом микробной клетки. Наиболее чувствительны к повышению температуры психрофилы и мезофилы. Так, бактерии в веге­тативном состоянии погибают при 60°С через 30–60 мин, а при 80–100°С в течение 1–2 мин. Споры бактерий выдержи­вают кипячение в течение 10–20 мин, иногда даже до 6 ч (споры Clostridium botulinum). Однако при 165–170°С в течение 1–1,5 ч происходит гибель всех микроорганизмов и спор, а под давлением 2 атм (в стерилизаторе с нагревом до 120– 132 °С) – через 20–30 мин.

К низким температурам очень чувствительны лишь отдель­ные представители бактерий (менингококк, гонококк, бордетеллы и др.). При этом происходят остановка метаболических реакций и разрыв клеточной мембраны под действием кристаллов льда. Эта особенность учитывается бактериологами при транспортировке и хранении клинического материала. Извест­но, что жизнеспособность бактерий может сохраняться да­же при температуре жидкого водорода (–253 °С), а у спор бацилл – при –250 °С в течение 3 мес. Особенно губительно переменное воздействие высоких и низких температур (замо­раживание – оттаивание – нагревание).

Способность микроорганизмов к росту в определенном ин­тервале температур и термоустойчивость спор являются важ­ными физиологическими свойствами и используются при идентификации микроорганизмов (см. разд. 9.3.5 и 9.3.6).

Высушивание (т.е. обезвоживание цитоплазмы бактериаль­ной клетки с денатурацией белка) следует назвать среди других факторов, существенно влияющих на жизнеспособность мик­роорганизмов. Устойчивость микроорганизмов к этим факто­рам различна. Так, шигеллы выдерживают высушивание 7 дней, чумной микроб – 8 дней, стафилококки – 90 дней. В высохшей мокроте туберкулезных больных микобактерии сохраняются до 10 мес. Споры сибирской язвы остаются жизнеспособными 10 лет. Однако для длительного хранения микроорганизмов их подвергают лиофильному высушиванию, которое проводят с замораживанием биомассы до –50°С и последующим обезво­живанием в вакуумных аппаратах.

Излучение (прямые солнечные лучи, УФ-генерированные лучи, рентгеновские лучи и т.д.) губительно для микроорганиз­мов. УФ-лучи повреждают ДНК, вызывая в ней мутации или приводя бактерии к гибели. Ионизирующая радиация также приводит к повреждениям генома или к гибели клетки. Харак­терно, что летальные дозы ионизирующей радиации могут быть для микроорганизмов в нескольких сот или тысяч раз выше, чем для теплокровных или растений. Так, Micrococcus radiodurans, обитающий в воде атомных реакторов, и некоторые тионовые бактерии в урановых рудниках существуют при из­лучении в 2–3 млн рад, УФ-излучение, наоборот, более губи­тельно для микроорганизмов даже в незначительных дозах.

УФ-облучение используется в медицинских учреждениях для антимикробной обработки роддомов, операционных, гос­питальных палат, боксов и т.д.

Давление. Высокое атмосферное давление, действие которо­го испытывают определенные виды микроорганизмов, по-раз­ному переносится ими. Допустимый уровень давления, кото­рый выдерживают микробы, находится в пределах 100–900 атм, а в морских глубинах около 1000 атм. Некоторые виды бактерий, дрожжей, грибов могут переносить давление около 3000 атм.

Бактерицидными свойствами обладает также ультразвук. Не­которые его частоты вызывают деструкцию органелл и молекул, поэтому данный метод используют для получения дезин-тегратов клетки.

Среди химических факторов, влияющих на жизнеспособ­ность микроорганизмов, различают вещества с бактериостатическим и бактерицидным действием. Механизм действия таких веществ различен. Это может быть действие на клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, на биосинтез основных клеточных биополимеров, подавление функций ферментов и т.д. Известны также вещества, сходные с метаболитами бакте­рий, называемые "антиметаболитами", которые обладают ан­тибактериальной активностью. Кроме того, для микробов гу­бительны галогены и их производные, ПАВ, кислоты и щело­чи, спирты, альдегиды, красители, соли тяжелых металлов, антибиотики, сульфаниламиды и другие фармацевтические препараты.

Однако степень воздействия указанных веществ зависит от концентрации и продолжительности контакта с микроорганиз­мом.

Как известно, многие токсичные вещества в незначитель­ных концентрациях могут повышать биохимическую актив­ность микробов. По уровню токсического действия на микро­организмы металлы располагают в следующем порядке:

Sb > Ag > Си > Hg > Со ≥ Ni > Рb > Cr > V > Сd > Zn > Fe.

В то же время некоторые из них необходимы бактериям как микроэлементы, например Cu (хотя в дозе ≥0,5 мг/л медь токсична для некоторых микроорганизмов).

К химическим факторам, оказывающим существенное воз­действие на жизнедеятельность микроорганизмов, относятся концентрация водородных ионов (рН) и окислительно-восстано­вительный потенциал среды (редокс-потенциал, Eh). Приспо­собление к определенным значениям рН сложилось у микро­организмов в процессе эволюции, и существование их за этими пределами невозможно. Значительная часть микроорганизмов, в том числе патогенные бактерии, существует в среде с вели­чиной рН 6,5–8,0. Так, для энтеробактерий оптимальное зна­чение рН 6,8–7,2, для дифтерийной палочки 7,2–7,6, для туберкулезной палочки 5,8–8,0 и т.д. Сапрофиты могут оби­тать в среде с широким диапазоном рН (от 2,0 до 9,0). По-ви­димому, для существования некоторых бактерий (холерный вибрион) необходима более щелочная (рН 8,0–10,0), а для других (грибы) – более кислая среда (рН 4,0–6,0). Величина рН среды влияет на метаболизм бактерий, воздействуя на рас­творимость различных питательных веществ, диссоциацию кис­лот и оснований, взаимодействие ионов водорода с фермента­ми цитоплазматической мембраны и клеточной стенки (напри­мер, с пермеазами) и т.д.

В процессе жизнедеятельности величина рН может резкоменяться. Так, под действием кислых продуктов метаболизма рост бактерий может прекратиться (молочнокислые и другие бактерии).

Окислительно-восстановительная способность среды зависит от присутствия в ней окислителей и восстановителей. Для характеристики этого свойства используют величину Еп, кото­рая выражается в милливольтах и измеряется потенциометрическим методом по разнице потенциалов двух электродов. Од­нако окислительно-восстановительный уровень в среде чаще характеризуют с помощью величины rН₂ –отрицательного ло­гарифма давления молекулярного водорода в среде. Величина rН₂ обычно изменяется от 0 до 41,0. Минимальному значению rН₂ соответствует высокий восстановительный уровень (при на­сыщении среды молекулярным водородом с избыточным дав­лением 0,1 МПа). При rН₂ = 41,0 в среде существует высокий окислительный уровень, создаваемый при ее насыщении кислородом с тем же избыточным давлением. Равновесие окислительных и восстановительных условий имеет величину rН₂ = 28,0. У облигатных анаэробов развитие происходит при rН₂ = 0–20,0, хотя для размножения требуется rН₂ <7,0–8,0. Для факультативных анаэробов величина rН₂ находится в пре­делах от 0 до 30,0; для облигатных аэробов в пределах от 12,0 до 30,0. Среда с rН₂ >30,0, являясь средой с сильными окислитель­ными свойствами, непригодна для развития микроорганизмов. Добавление к среде редуцирующих веществ (муравьинокислый Na, глюкоза и др.) позволяет воздействовать на окислительно-восстановительный потенциал.

Исследования последних лет по внеорганизменным популя­циям микроорганизмов привели к новым представлениям о формах существования бактерий в среде обитания.

В естественных условиях микробам свойственно образование клеточных сообществ. В таких сообществах микроорганизмы приобретают качества, отличающие их от микробов, существу­ющих в изолированном виде. При размножении бактерии од­ного или разных видов покрываются белково-полисахаридной пленкой ("матом", "слизистыми тяжами"), в основе которой находится мембраноподобная структура. Это образование с иммобилизованными микроорганизмами, среди которых часто присутствуют водоросли, выполняет функции защиты и пита­тельного косубстрата. При строительстве биопленки могут ути­лизироваться трудно разлагаемые токсические вещества (фено­лы, сульфиды, сероводород), а также органические соедине­ния, такие как лигнины, латексы, гуминовые, жироподобные и другие соединения. Как оказалось, такое образование имеет признаки многоклеточного организма и возникает за счет меж­клеточных контактов. При этом происходит либо слипание микробных клеток с созданием общей клеточной стенки, либо образование цитоплазматических мостиков (тонкие мембранные трубочки), соединяющих цитоплазмы клеток. Это позво­ляет внеорганизменным популяциям микроорганизмов со­вместно реагировать на внешние факторы, придавая ассоциан-там большую резистентность к неблагоприятным воздействи­ям, а также обеспечивает возможность свободного переноса мелких молекул.

В организме человека и животных микроорганизмы также формируют сообщества, включающие нормальную микрофло­ру и патогенов. При колонизации органа микроорганизмы, иммобилизованные на биопленке, имеют очень высокую вы­живаемость при введении любых антибактериальных средств и повышенную резистентность к действию факторов иммунной системы.

Кроме этого, появились сведения о существовании в среде обитания "некультивируемых" форм микроорганизмов. Такое определение дано покоящимся неспорулирующим формам бактерий, которые временно утратили способность к росту на питательных средах вследствие неблагоприятного воздействия окружающей среды. Невыявляемые бактериологически некультивируемые микроорганизмы функционально сходны с эндо­спорами бацилл и клостридий. Некультивируемые покоящиеся формы обнаружены у Yersinia, Escherichia, Salmonella, Listeria, Legionella, Shigella, Klebsiella, Enterococcus, Campylobacter, Aero-monas, Agrobacterium, Vibrio, Staphylococcus, Micrococcus и др. При изменении условий существования на более физиологически оптимальные с применением индуцирующих факторов может происходить реверсия покоящихся клеток к вегетативному со­стоянию. Некоторые ситуации, в которых микробы считались нежизнеспособными, с момента применения ПЦР в исследова­ниях трактуются как условия перехода микробов в покоящуюся форму с сохранением способности к рекультивированию.

Причинами перехода микроорганизмов в некультивируемое состояние считаются голодание, недостаток питательных ве­ществ и другие стрессорные факторы. Например, с образова­нием "белков голодания" у бактерий появляется возможность утилизации необычных для них источников питания. Метабо­лизм клеток меняется так, что они становятся способны про­тивостоять неблагоприятным условиям среды.

Переход клеток из некультивируемого состояния в вегета­тивное осуществляется при появлении в среде обитания доста­точного количества питательных веществ, а также комплекса других оптимальных показателей. В экспериментальных усло­виях индукторами перехода покоящихся клеток в вегетативное состояние оказались фетальная сыворотка, витамин К (менадион), дрожжевой экстракт и др.

Существенный вклад в изучение вопроса о некультивируе­мых формах микроорганизмов внесли отечественные ученые А.Л.Гинцбург, В.Ю.Литвин, Ю.М.Романова, В.И.Пушкарева и др. По-видимому, обнаружение некультивируемого состояния у некоторых микроорганизмов повлечет за собой более детальное изучение сроков жизнеспособности микроорганизмов в экстре­мальных условиях или под действием различных факторов.

Среди биологических факторов, воздействующих в среде обитания на микроорганизмы, могут быть синтезируемые мик­робами антагонистические субстанции (бактериоцины, микро-цины, литические ферменты, ферменты агрессии, токсины и др.). Однако, помимо антагонизма между микроорганизмами, возможно несколько типов взаимоотношений, способствую­щих сохранению их жизнеспособности.

1. Симбиоз – сосуществование нескольких видов микроор­ганизмов, основанное на взаимной пользе и дающее им всем преимущества существования в данном микробиоценозе. Сим­биоз может проявляться в нескольких видах. Комменсализм – сосуществование, выгодное для одного из партнеров. Приме­ром комменсализма является микрофлора кишечника человека и животных. Мутуализм – взаимовыгодный симбиоз (дрожжи Rhodotorula rubra и гриб Mucor ramannianus). Паразитизм – один из членов ассоциации существует за счет другого, оказы­вая на него неблагоприятное воздействие, например Bdellovibrio bacteriovorus паразитирует на многих грамположительных и грамотрицательных бактериях. Нейтрализм – сосуществование без отрицательного воздействия друг на друга.
2. Синергизм – сосуществование с усилением физиологи­ческих функций (например, боррелии и фузобактерии или дрожжи и молочнокислые бактерии).
3. Метабиоз – взаимоотношения микроорганизмов, при ко­торых один микроорганизм начинает процесс, а другой про­должает его, утилизируя токсические метаболиты первого. При этом происходит дальнейшее размножение каждого из них. Так, разрушающие клетчатку бактерии, разлагая целлюлозу, накапливают сахара и органические кислоты для других мик­робов, например для азотобактера. Сателлизм – стимуляция одного микроорганизма другим. Например, сарцины и неко­торые грибы, продуцируя витамины и аминокислоты, стиму­лируют рост других микроорганизмов (уксуснокислых, молоч­нокислых и других бактерий).