Рецепт 45. Среды Гисса с углеводами (для определения окисления микроорганизмами Сахаров, гликозидов и спиртов)
Состав основы: г/100 мл
Пептон 1,0
Хлорид натрия 0,5
Дистиллированная вода 100
К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г пептона и 0,5 г хлорида натрия. Пептон и соль растворяют при нагревании воды в течение нескольких минут, фильтруют через бумажный фильтр, чтобы раствор был прозрачным. Устанавливают рН 7,2±0,2, прибавляют нужный для исследования углевод в количестве 0,5–1,0 г на 100 мл среды и затем индикатор Андреде (рецепт 37) в количестве 1,0 мл или 1,6 % раствор индикатора бромтимолового синего 0,1 мл (рецепт 36).
Готовую среду разливают по 3,0 мл в пробирки, стерилизованные с поплавками (трубками Durhema), расположенными запаянным концом кверху.
Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или автоклавированием при 112 °С в течение 20 мин.
Рецепт 46. Среда Ресселя (двухсахарный агар)
Среда предназначена для идентификации энтеробактерий по способности ферментировать сахара.
Состав: г/л
Панкреатический гидролизат
казеина 8,7
Натрия хлорид 4,3
Лактоза 10,0
Глюкоза 1,0
Бромтимоловый синий 0,03
Агар-агар 9,0
рН 7,2±0,2
Навеска среды 33 г растворяется в 1000 мл дистиллирован¬ной воды при нагревании. При необходимости проводят под¬ведение рН и фильтрацию. Стерилизация при 121 °С 20 мин. После стерилизации среду скашивают, оставляя внизу столбик высотой 2–2,5 см.
Готовая к употреблению среда имеет зеленовато-голубой цвет.
Рецепт 47. Среда Кларка для реакции с метиловым красным (MR) и Фогеса-Проскауэра (VP)
Состав г/100мл
Пептон 0,5
Гидроортофосфат калия
(K2HPO4) 0,5
Глюкоза 0,5
Дистиллированная вода 80 мл
Перечисленные ингредиенты размешивают при подогревании в течение 20 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до 20 °С и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой. Разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют три дня в текучепаровом аппарате по 30 минут.
а. Реактив к реакции с метиловым красным
Метиловый красный 0,1
Спирт этиловый 96 % 300 мл
Вода дистиллированная 200 мл
Краску растворяют в спирте, затем прибавляют воду. Да испытания реагент добавляют в количестве 5-6 капель.
б. Реактив к реакции Фогеса-Проскауэра (VP)
Реактив 1. Навеска α-нафтола 5 г растворяется в 100 мл 96 % этилового спирта.
Реактив 2. Навеска КОН 40 г растворяется в 100 мл дистиллированной воды.
Примечание. Раствор α-нафтола хранится при 40 °С не более 1 года.
Рецепт 48. Приготовление раствора О-нитрофенил-β-D-глактопиранозида для ONPG-теста
Навеску 0,08 г коммерческого О-нитрофенил-β-D-глактопиранозида растворяют в 15 мл теплой дистиллированной воды, затем добавляют 5 мл свежеприготовленного буферного раствора (буферный раствор: 6,9 г натрия дигидрофосфата NaH2PO4 • H2O растворяют в 45 мл дистиллированной воды), устанавливают рН 7,0 с помощью концентрированного раствора NaOH. Дистиллированной водой доводят объем до 50 мл. После перемешивания раствор должен быть бесцветным. При хранении в холодильнике и темноте при температуре 6±4 °С раствор, оставаясь бесцветным, может использоваться в течении месяца.
Рецепт 49. Трехсахарный агар с железом (Himedia, TSI, Triple Sugar Iron Agar,
cat. M021)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности расщеплять декстрозу, лактозу, сахарозу и продуцировать сероводород. Среда может быть использована для проведения ONPG-теста.
Состав: г/л
Пептон 10,0
Триптон 10,0
Дрожжевой экстракт 3,0
Говяжий экстракт 3,0
Лактоза 10,0
Сахароза 10,0
Декстроза 1,0
Железа сульфат 0,2
Натрия хлорид 5,0
Натрия тиосульфат 0,3
Феноловый красный 0,024
Агар 12,0
рН 7,4±0,2
Навеска среды 65 г растворяется при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды. Доводится до кипения. Разливается по пробиркам по 7 мл. Стерилизация при 121 °С 15 мин. После стерилизации среду скашивают с образованием в конце столбика 2-2,5 см. Готовая к употреблению среда имеет розово-красный цвет.
Рецепт 50. Среда для теста на эскулин
Среда используется для диагностики стрептококков и других микроорганизмов.
Состав: г/л
Пептон 10,0
Мясной экстракт 10,0
Натрия хлорид 5,0
Железа (ІІІ) цитрат 0,5
Ингредиенты смешивают, растворяют в 1000 мл дистиллированной воды при подогреве. Доводят рН среды до 7,0. Разливают по 3-5 мл в пробирки. Стерилизуют при 112 °С 30 мин. Готовая среда имеет светло-коричневый цвет.
Рецепт 51. Жидкая среда с крахмалом (к тесту на гидролиз крахмала)
Состав:
Пептон 5,0 г
Гидроортофосфат натрия
(Na2HPO4) 1,0 г
Лошадиная сыворотка 250 мл
Картофельный крахмал 25,0 г
Картофельная вода 325 мл
Спиртовой раствор
фенолового красного (0,02%) 40 мл
Дистиллированная вода 1250 мл
Картофельный отвар в количестве 25,0 г несколько раз промывают теплой дистиллированной водой для удаления рас¬творимых частиц. Затем заваривают 500 мл горячей дистиллированной воды и отстаивают. Надосадочный слой крахмальной воды сливают для дальнейшего использования.
Отдельно готовят пептонно-сывороточную воду: растворяют 5,0 г пептона и 1,0 г гидроортофосфата натрия (Na2HPО4) в 1250 мл дистиллированной воды, добавляют 250 мл лошадиной сыворотки, устанавливают рН 7,6.
Крахмальную воду 325 мл смешивают с 1250 мл пептонно-сывороточной воды, к смеси прибавляют 40 мл 0,02 % спиртового раствора фенолового красного и все кипятят на водяной бане в течение часа, затем фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд.
Готовая среда имеет насыщенно-розовый цвет.
Результат ферментации учитывают через 3 сут после посева испытуемой культуры.
При расщеплении крахмала цвет среды изменяется на желтый, и она свертывается.
Рецепт 52. Плотная среда с крахмалом (к тесту на гидролиз крахмала)
Состав: г/100 мл
Пептон 1,0 г
Натрия хлорид (NaCl) 0,5
Крахмал 0,5–1,0
Агар-агар 1,5
Сыворотка лошади или крупного
рогатого скота 10 мл
Дистиллированная вода 100 мл
Для обогащения среды при культивировании микробов, требовательных к биологически активным соединениям, к среде добавляется 10 % сыворотки лошади или крупного рогатого скота.
К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1,0 г пептона, 0,5 г химически чистого натрия хлорида. Устанавливают рН 7,4, кипятят 5 мин, фильтруют через бумажный фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой. К полученной основе добавляют 0,5–1,0 г взвеси крах¬мала в нескольких миллилитрах воды.
Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин или при 112 °С 30 мин. Готовые среды разливают в чашки Петри. Среда бесцветна.
Индикатором для плотной среды на крахмал, не измененный и гидролизированный, является люголь (рецепт 34).
Рецепт 53. Среда Симмонса (Himedia, Simmons Citrate Agar, cat. M099)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерии и других микроорганизмов по способности утилизировать цитрат.
Состав: г/л
Na3C6H5O7 5H2O (цитрат натрия) 2,0
NaCl 5,0
MgSO4 7Н2O 0,2
NH4H2PO4 1,0
К2НРО4 1,0
Бромтимоловый синий 0,08
Агар-агар 15,0
Ингредиенты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, нагревают, устанавливают рН 6,8±0,2. Разливают по 5–7 мл, стерилизуют при 112 °С 30 мин или при 121 °С 15 мин. Среду скашивают. Готовая среда имеет зеленый цвет.
Рецепт 54. Среда Кристенсена (Himedia Christensen Cit¬rate Agar, cat. M143)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерии и других микроорганизмов по способности утилизировать цитрат.
Состав: г/л
Na3C6H5O7 5H2O (цитрат натрия) 3,0
Глюкоза 0,2
Дрожжевой экстракт 0,5
Цистин гидрохлорид 0,1
К2НРО4 1,0
NaCl 5,0
Феноловый красный 0,012
Агар-агар 15,0
Компоненты среды размешивают в 1000 мл дистиллированной воды, доводят до кипения. рН среды доводят до 6,9±0,2. Разливают в пробирки по 5–7 мл, стерилизуют при 112 °С 30 мин или при 121 °С 15 мин. Готовая среда бесцветная или имеет бледный оранжево-розовый цвет.
Рецепт 55. Среда Козера (Himedia, Koser Citrate Medium, cat. M069)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерии по способности утилизировать цитрат.
Состав: г/л
Натрий-аммония фосфат 1,5
Калия фосфат однозамещенный 1,0
Магния сульфат 0,2
Натрия цитрат 3,0
рН 6,7±0,2
Навеску среды 5,7 г растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, разливают в пробирки по 3–5 мл. Стерилизация при 121 °С – 15 мин. Готовая к употреблению среда бесцветна, прозрачна.
При необходимости к среде после стерилизации может добавляться 0,5 % спиртовой раствор бромтимолового синего из расчета 10 мл индикатора на 1 л среды.
Рецепт 56. Среда для теста на органические кислоты (D-, L-, I-тартрат, мукат, цитрат)
Предназначена для дифференциации сальмонелл и близко¬родственных микроорганизмов.
Состав: г/л
Основа среды: пептон 10,0
Бромтимоловый синий 0,024
Варианты ингредиентов:
D-тартрат (правовращающая соль), 10,0
или L-тартрат (левовращающая соль), 5,0
или I(мезо)-тартрат (оптически инертная соль), 5,0
или мукат (слизевая кислота), 10,0
или натрия цитрат (нейтральный) 10,0
Пептон и индикатор растворить в 1000 мл дистиллирован¬ной воды, добавить 1 % соответствующей соли винной кислоты (D-, L-, I-тартрат, натриевая или калийная соль). Довести рН до 7,4 с помощью 10 % NaOH. Разлить по 3–5 мл в пробирки. Стерилизовать при 112 °С 20 мин. Готовая к употреблению среда имеет сине-зеленый цвет.
Основу среды для определения утилизации муката (слизевой кислоты) вначале стерилизуют при том же режиме. Затем в горячую среду асептически вносят слизевую кислоту (до 1 %), доводят рН до 7,4 10 % раствором NaOH. Разливают по 3–4 мл в стерильные пробирки (допускается стерилизация среды со слизевой кислотой при 112 °С 10 мин). Необходим строгий контроль стерильности готовой среды.
Рецепт 57. Среда с малонатом натрия, модификация Ewing (Himedia, Malonate Broth, Ewing modified, cat. M779)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по утилизации соли малоновой кислоты.
Состав: г/л
Дрожжевой экстракт 1,0
(NН4)2SО42,0
КН2РO4
К2НРО, 0,6
NаСl 2,0
Малонат натрия
(СН2СООНСOONa) 3,0
Глюкоза 0,25
Бромтимоловый синий 0,025
Ингредиенты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, доводят lо кипения, при необходимости фильтруют. Устанавливают рН 6,7±0,2. Среду разливают в серологические про¬бирки по 2–3 мл. Стерилизуют при 112 °С 30 мин или при 121 °С 15 мин. Готовая среда имеет светло-зеленый цвет.
Рецепт 58. Бульон для гидролиза гиппурата
Среда предназначена для идентификации микроорганизмов по признаку ферментативного гидролиза гиппурата натрия.
Состав: г/л
Сухой сердечный бульон 10,0
Пептический гидролизат ткани
животных 10,0
Хлорид натрия 5,0
Гиппурат натрия 10,0
Окончательная величина рН 7,4+0,2
Навеска среды 35 г растворяется в 1000 мл дистиллирован¬ной воды при нагревании. При необходимости доводят рН до нужного значения и фильтруют. Разливают по 5 мл в про-бирки. Стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин.
Готовая к употреблению среда имеет желтовато-коричневый цвет.
Для теста на гидролиз гиппурата может быть использован любой коммерческий питательный бульон с добавлением 1 % гиппурата натрия.
Реагент для реакции на гидролиз гиппурата натрия
Тест предназначен для дифференциальной диагностики стрептококков, энтерококков, кампилобактера, хеликобактера и других микроорганизмов.
В 100 мл раствора (5,4 мл 37 % НСl, разведенной в 94,6 мл дистиллированной воды) вносят 12 г FеCl3 • 6Н20.
Рецепт 59. Среда для определения дезоксирибонуклеазы (ДНКазы; Himedia, D-nase Test Agar, cat. M482)
Состав: г/л
Триптон 15,0
Соевый бульон 5,0
ДНК 2,0
Натрия хлорид 5,0
Агар 15,0
рН 7,3±0,2
Перечисленные выше ингредиенты суспендируют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, добавляют 0,025 г бромтимолового синего, продолжая при постоянном помешивании подогрев до полного растворения веществ, содержащихся в воде. Затем среду стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 5 мин
После стерилизации охлажденную до 40–45 °С среду разливают в чашки Петри.
Реактив на ДНКазу: 1 N раствора хлороводорода (НСl). Чашки заливают раствором кислоты после 18–24 ч инкубации посевов при 35 °С.
Рецепт 60. Среды с аминокислотами (для определения лизин- и орнитиндекарбоксилазы и аргининдегидролазы)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерии и других микроорганизмов.
Состав: г/л
Пептон 5,0
Глюкоза 1,0
Бромтимоловый (бромкрезоловый)
синий 0,03
L-аминокислота (лизин, или
орнитин, или аргинин) или 10,0
DL-аминокислота 20,0
Ингредиенты среды вносят в 1000 мл дистиллированной воды, доводят до нагревания, при необходимости фильтруют. Подводят величину рН до 6,0–6,1. Разливают в бактериологические пробирки по 2,5–3 мл. Стерилизуют при 110 °С 30 мин. Контрольная среда не содержит аминокислоты. Готовая среда имеет желтовато-зеленый цвет.
Рецепт 61. Агар с фенилаланином для определения дезаминазы
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерии и других микроорганизмов.
Состав: г/л
Дрожжевой экстракт сухой 3,0
NaCl 5,0
Na2HPO4 1,0
L-фенилаланин 1,0
(DL-фенилаланин) 2,0
Агар-агар 12,0
Ингредиенты среды вносят в 1000 мл дистиллированной воды, растворяют при нагревании, при необходимости фильтруют. Разливают в бактериологические пробирки по 3–4 мл. рН среды 7,0–7,2. Стерилизацию проводят при 112 °С в течение 30 мин, затем среду скашивают. Готовая среда не окрашена.
Тест-реактив для определения фенилаланиндезаминазы
FeCl3 10,0 г
Дистиллированная вода 100 мл
Изготовляется 10% раствор FeCl3. Хранение реактива при 6±4 °С в темноте.
Рецепт 62. Среда для определения индолообразования
Предназначена для выращивания энтеробактерии и других микроорганизмов с целью определения индола. Готовится из бульона на основе триптического перевара казеина или на основе бульона Хоттингера, к которому прибавляется 0,3 % раствор триптофана. Среда разливается в пробирки по 5 мл. Готовая среда имеет цвет бульона.
Реактивы на индол
1. Реактив Эрлиха
Парадиметиламинбензальдегид 1,0 г
Спирт этиловый 96 % 95 мл
Кислота соляная (НСl)
концентрированная 20 мл
2. Реактив Ковача
Парадиметиламинбензальдегид 5,0
Спирт амиловый 75 мл
Кислота соляная (НCl) 25 мл
Парадиметиламинбензальдегид растворяют в спирте. Смешивают с кислотой. Оба реактива имеют желтый цвет. Хранят¬ся при 6±4 °С.
Рецепт 63. Среда с цистиназой для постановки теста Пизу
Состав: г/100 мл
Мясопептонный агар 2 % 90 мл
Раствор цистина 1 % в 0,1 N в
растворе гидроксида натрия
(NaOH) 2 мл
Раствор серной кислоты 0,1 N
(H2SO4) 2 мл
Раствор 10 % ацетата свинца 1 мл
Лошадиная нормальная сыворотка 9 мл
Способ приготовления: к 90 мл расплавленного 2 % мясопептонного агара (рН 7,6) добавляют 2 мл раствора цистина (1 % раствор цистина в 0,1 N растворе гидроокиси натрия), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 N раствора серной кислоты.
Среду стерилизуют 30 мин при 112 °С. К расплавленной и остуженной до 50 °С среде добавляют 1 мл 10 % раствора ацетата свинца (стерилизованного двукратно текучим паром), перемешивают и добавляют 9 мл лошадиной нормальной сыворотки. Среду стерильно разливают по маленьким пробиркам по 2 мл. Посев производят уколом.
Рецепт 64. Среда с цистиназой на основе коммерческой среды АГВ для теста Пизу
Для приготовления среды Пизу можно использовать доступ¬ную, сбалансированную по составу коммерческую среду АГВ (рецепт 84), применяемую в бактериологической практике для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Навеску сухой среды АГВ в количестве 2,7 г вносят в 90 мл дистиллированной воды и кипятят до ее полного растворения.
Готовят 5 % раствор гидрокарбоната натрия. Для этого растворяют 0,5 г NaHCO3 в 10 мл дистиллированной воды. Затем в раствор вносят 0,1 г L-цистина и кипятят до полного растворения. Далее 2 мл кипящего щелочного раствора цистина вносят в 90 мл расплавленной среды АГВ, доводят рН до 7,6 и стерилизуют при 112 °С в течение 10 мин.
К расплавленной и охлажденной до 45 °С основе последовательно добавляют 10 мл сыворотки крупного рогатого скота, 1 мл 10 % раствора уксуснокислого свинца, 1,5 мл стерильного свежеприготовленного 10 % тиосульфита натрия. Готовую среду разливают по пробиркам.
Растворы уксуснокислого свинца и тиосульфита натрия готовят ex tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане в течение 30 мин.
Данный вариант среды Пизу используют при отсутствии агара Мартина. Дифференциально-диагностические свойства этой среды по сравнению со средой, приготовленной на агаре Мартина, менее выражены.
Рецепт 65. Кровяной агар для определения гемолиза
К 100 мл растопленного и остуженного до 45–50 °С 2 % питательного агара рН 7,4–7,6, соблюдая правила асептики, добавляют 5 мл стерильной дефибринированной крови: кроличьей, лошадиной, бараньей или человеческой, не содержащей консервантов или антибактериальных препаратов.
Смесь тщательно перемешивают, остерегаясь образования пены, и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно подогретые в термостате.
Перед розливом чашки устанавливают на ровную поверхность. Слой агара должен быть не более 3 мм, одинаковым по всей площади чашки.
Рецепт 66. Среда с мочевиной по Преусу (для определения уреазы)
Среда предназначена для дифференциальной диагностики энтеробактерий и других микроорганизмов.
Состав: г/л
Мочевина 50 % (стерильный
водный раствор) 20 мл
Глюкоза 5
Агар-агар 15
Бромтимоловый синий 0,02
Бульон Хоттингера 1000 мл
Ингредиенты растворяют в бульоне, доводят до нагревания, устанавливают рН 6,9–7,0. Стерилизуют при 112 °С 30 мин. Скашивают. К стерильной среде асептически добавляют моче¬вину. Цвет готовой среды светло-зеленый.
Рецепт 67. Питательный желатин (для определения желатиназы)
Среда предназначена для определения протеолитической активности микроорганизмов.
Состав:
Бульон Хоттингера 1000 мл
Желатин пищевой высшего сорта 100,0
Желатин вносят в бульон для набухания на 1,5–2 ч, нагревают на водяной бане при 40–50 °С до полного расплавления. Подводят рН до 7,2. При необходимости среду фильтруют или осветляют с помощью суспензии из куриных яиц (2 яйца, размешанных в двойном объеме холодной воды, вносят в среду, нагревают до свертывания белка, затем снова фильтруют).
Разливают в пробирки по 8–9 мл. Стерилизуют при 112 °С 30 мин. Готовая среда имеет желтовато-коричневый цвет.
Рецепт 68. Молочный агар Эйкмана (для теста на пептонизацию казеина)
Состав: г/л
Пептон 100,0
Хлорид натрия 50,0
Агар 20,0
Дистиллированная вода 1000 мл
Перечисленные ингредиенты растворяют в дистиллированной воде, смесь нагревают до кипения, фильтруют горячий раствор через ватно-марлевый или полотняный фильтр, при-бавляют 100 г глюкозы, устанавливают рН 7,4±0,2.
Стерилизуют при 116 °С в течение 20 мин. К ЮОО мл стерильной расплавленной на водяной бане смеси добавляют, соблюдая правила асептики, 300 мл стерильного снятого молока.
Среду используют без дополнительной стерилизации, так как совместная стерилизация молока с агаром неприменима из-за свертывания казеина с образованием хлопьев.
Рецепт 69. Бульон с куриным яичным белком (для теста на протеолиз куриного белка)
В пробирки со стерильным бульоном Хоттингера нейтральной реакции прибавляют кусочки вареного куриного белка, нарезанные в форме кубиков с гранями 5–8 мм. Белок куриного яйца нарезают в стерильной посуде и затем стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С. Простерилизованные кубики коагулированного белка прибавляют к стерильному бульону, соблюдая асептические условия.
Рецепт 70. Среда для определения лецитиназы
Среда предназначена для выявления фермента у стафилококков, иерсиний, анаэробов.
Состав: г/л
Казеин панкреатического
расщепления 40,0
Na2HPO4 5,0
К2НРO4 1,0
NaCl 2,0
MgSO4•7H20 0,1
Глюкоза 2,0
Агар-агар 25,0
Ингредиенты смешивают, растворяют при нагревании в 1000 мл воды. Устанавливают рН 7,6. Стерилизуют при 121 °С 15 мин. Основа среды бледно-желтого цвета. К охлажденной до 50–55 °С основе добавляют желтки куриного яйца (1 желток на 500 мл среды). Перед использованием яйца тщательно моют в теплой воде, выдерживают 1 ч в 96 % этиловом спирте. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Рецепт 71. Среда для определения липазы с кукурузным маслом
Состав: г/л
Пептон 10,0
Дрожжевой экстракт 3,0
Натрия хлорид 5,0
Агар-агар 20,0
Дистиллированная вода до 900 мл
Растворить при нагревании ингредиенты в воде, довести рН до 7,8, добавить 100 мл водного раствора индикатора (Victoria blue, 1:1500). Внести в среду кукурузное масло до 3 % (об.) и тщательно перемешать с использованием магнитной мешалки, смесителя или ультразвукового воздействия, разлить в пробирки, стерилизовать при 115 °С 30 мин. Для охлаждения агара положить их в наклонном положении для получения длинного косяка. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.
Рецепт 72. Молоко с метиленовым синим (для теста на редуцирующую способность)
Свежее молоко доводят на огне до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки, освобождают его от сливок, вторично кипятят, оставляют снова на сутки и вторично снимают верхний слой. Обезжиренное таким образом молоко фильтруют через толстый слой ваты, подщелачивают 10 % раствором углекислого натрия до рН 7,2.
К 100 мл молока добавляют 2 мл 1 % водного раствора метиленового синего. Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин.
Среда после остывания имеет насыщенно голубой цвет.
Рецепт 73. Лакмусовое молоко в прописи Минкевича (для теста на редуцирующую способность)
100 мл свежего молока подщелачивают 10 % раствором питьевой соды до слабощелочной реакции (по лакмусу), кипятят и прибавляют 100 мл дистиллированной воды и 5 мл лакмусовой настойки. Приготовленную таким образом среду сливают в бутыли, прибавляют на 1 л 10 мл хлороформа, закрывают плотно резиновой или корковой пробкой, хорошо встряхивают и ставят на 2–3 дня в темное место. Будучи тяжелее воды, хлороформ оседает на дно, увлекая за собой растворившиеся в нем сливки. Обезжиренную таким образом среду осторожно сливают, разливая по пробиркам по 5 мл, и стерилизуют 20 мин при температуре 115 °С.
Вынутая из автоклава среда вследствие редукции лакмуса имеет желтый цвет и только через несколько часов приобретает характерный для нее бледно-фиолетовый оттенок.
В результате роста различных видов бактерий лакмусовое молоко изменяется неодинаково. Изменение среды отмечают в протоколе исследования, пользуясь условными обозначениями:
N – рост бактерий, не сопровождающийся изменением ре¬акции среды и, следовательно, изменением ее цвета;
К – кислотообразование в среде с четко выраженным порозовением ее;
NK – слабовыраженное кислотообразование, вызывающее изменение оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении опытной пробирки с контрольной (незасеянная среда);
Щ – щелочеобразование, сопровождающееся явно выраженным посинением среды;
МЩ – слабовыраженное щелочеобразование, сопровождающееся изменением оттенка среды, улавливаемое только при сопоставлении с цветом контрольной пробирки.
Рецепт 74. Среда для определения редукции ТТХ (энтерококковая дифференциально-диагностическая среда – ЭДДС)
Предназначена для диагностики энтерококков и других микроорганизмов.
Состав: г/л
Сухой питательный агар 35,0
Сухой экстракт дрожжей
(автолизат дрожжей) 3 (20 мл)
Глюкоза 10,0
Дистиллированная вода 800 мл
Ингредиенты смешивают, растворяют при кипении. Доводят величину pH до 7,2–7,4. При необходимости фильтруют. Стерилизуют при 112 °С 15 мин. Основа среды имеет желтовато-коричневый цвет. Перед розливом в чашки в среду добавляют 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) –0,1 г, 0,01 % водного раствора кристаллического фиолетового – 12,5 мл, налидиксовой кислоты – 0,1 г, подогретого до 40–44 °С обезжиренного молока – 200 мл, свежей дефибринированной крови – 50 мл. После осторожного перемешивания разливают в чашки Петри.
Рецепт 75. Реактивы на оксидазу (цитохромоксидазу)
1. Реактив Gaby, Hadley (на постановку оксидазного теста)
А. L-нафтол 1,0 г
Спирт этиловый (95–96%) до 100 мл
Б. N, N-диметил-n-фенилендиамин
(можно заменить n-аминодиметил-
анилин гидрохлоридом в
том же количестве) 1,0 г
Спирт этиловый (95–96%) до 100 мл
Растворы сохраняются в темных флаконах с притертыми пробками: раствор А – до 1 мес, Б – до 1 нед. Перед употреблением к 3 частям раствора А добавляют 7 частей раствора Б.
Через 2–3 мин соприкосновения раствора с культурой микроорганизма при положительной реакции появляется ярко-си¬нее окрашивание.
2. Реактив Ковача (готовят ex tempore)
Тетраметил-п-фенилендиамина
гидрохлорид 0,5 г
Дистиллированная вода* до 100 мл
*Для получения дистиллированной воды рекомендуется использовать воду, полученную с применением стеклянного дистиллятора.
При положительной реакции через 20–30 с соприкосновения с культурой дает пурпурно-красный цвет.
Каждый раз перед постановкой теста реактивы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами, дающими положительную (Р.aeruginosa, P.fluorescens) и отрицательную оксидазную реакцию (E.coli).
Рецепт 76. Среда Хью–Пейфсона для OF-теста, модифицированная (Himedia, Hugh Leifson Medium, cat. M826)
Среда предназначена для определения способа утилизации карбогидратов у микроорганизмов по анаэробному или аэробному пути (ферментация, окисление или отсутствие утилизации).
Состав: г/л
Пептон 2,0
Натрия хлорид 5,0
Калия гидрофосфат (К2НРО4) 0,3
Глюкоза (в растворе) 10,0
Бромтимоловый синий 0,03
Агар-агар
Ингредиенты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды при нагревании. Доводят рН до 7,1–7,2. При необходимости фильтруют. Стерилизуют при 112 °С 20 мин. Разливают в пробирки по 3–4 мл. Готовая среда имеет зеленовато-синий цвет. После стерилизации асептически добавляют глюкозу до конечной концентрации 1 % (используется 10 % стерильный раствор глюкозы). Глюкоза может быть заменена на другие карбогидраты. Для использования среды готовят стерильное вазелиновое масло.
Рецепт 77. Среда для определения редукции нитратов (тест на нитратредуктазу)
Среда предназначена для определения принадлежности бактериальной культуры к энтеробактериям, для дифференциации нейссерий и других микробов.
Состав: г/л
Пептон 5,0
КNО3 (свободный от KNO2) 0,2
Ингредиенты растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, подогревают, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки по 5 мл. Стерилизуют при 121 °С 15 мин. Готовая среда имеет желтовато-коричневый цвет.
Тест-реактив для определения нитратредуктазы (редукция нитратов) (реактив Грисса)
Состав: г/л
Раствор 1. Сульфаниловая кислота 8,0 г
Уксусная кислота (5 N раствор) 1000 мл
Раствор 2. α-Нафтиламин 5,0 г
Диметил α-нафтиламин 6,0 г
Уксусная кислота (5 N раствор) 1000 мл
Реактивы готовят при слабом нагревании с особой осторожностью из-за их токсичности. Хранение при 6±4 °С в герметично укупоренных емкостях из темного стекла. Срок годности 2–3 мес.
Рецепт 78. Среда Кинг А (для определения пиоцианина и других феназиновых пигментов)
Среда предназначена для усиления пигментации у псевдомонад.
Состав: г/л
Пептон 20,0
Калия сульфат 10,0
Магния хлорид 1,4
Глицерин 10,0
Агар-агар 15–20
Сухие ингредиенты разводят при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, в которую внесены 10 мл глицерина. Доводят рН среды до 7,0±0,2. Среду стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин. Готовая среда желтоватого цвета.
Среда может быть использована в пробирках (косяки) и в чашках Петри.
Рецепт 79. Среда Кинг Б
Среда предназначена для выявления флюоресцирующего пигмента.
Состав: г/л
Протеозный пептон № 3 20,0
Глицерин 10 мл
К2НРО4 (безводный) 1,5
MgS04 · 7Н20 1,5
Агар-агар 15
Вода дистиллированная до 1000 мл
Сухие ингредиенты сред смешивают, разводят в дистиллированной воде с добавленным к ней глицерином. Доводят рН до 7,1. Среды разливают по 7 мл в пробирки или в чашки по 15–20 мл. Стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин. Готовая к употреблению среда желтоватого цвета. Пробирки охлаждают и используют в скошенном состоянии.
Рецепт 80. Молочно-солевой агар Петровича (для определения каратиноидного пигмента стафилококков)
К расплавленному мясопептонному агару с рН 7,2±0,2, содержащему 5–7,5 % натрия хлорида, добавляют ex tempore 10 % стерильного топленого молока, хорошо обезжиренного, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.
Рецепт 81. Желточная среда Чистовича (для определения каратиноидного пигмента стафилококков)
Мясопептонный питательный агар, приготовленный по общепринятой прописи, стерилизуют, охлаждают до 45–50 °С и добавляют к нему, соблюдая правила асептики, 20 % желточную взвесь (1 желток на 150–200 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида).
Рецепт 82. Кукурузно-пептонный агар (для спорообразования)
Среда предназначена для получения быстрого спорообразования у бактерий рода Bacillus.
Состав: г/л
Крахмал 10,0
NaCI 5,0
Кукурузный экстракт 5,0
Агар-агар 20,0
Ингредиенты среды растворяют в 1000 мл водопроводной воды. Устанавливают pH 7,0. Стерилизация при 112 °С 20 мин.
Готовую к употреблению среду разливают по 4–5 мл в пробирки, затем скашивают. Кукурузный экстракт придает среде коричневый оттенок.
Рецепт 83. Среда на подвижность и стимуляцию образования жгутиков
Среда предназначена для определения подвижности и выявления жгутиков у микроорганизмов.
Состав: г/л
Бактотриптоза 10,0
К2НРO4 (безводный) 1,0
NaCl 2,5
Ингредиенты смешивают, растворяют при нагревании в 1000 мл дистиллированной воды, доводят pH до 7,0. Среду разливают в пробирки по 5 мл. Стерилизуют при 121 °С в течение 15 мин. Готовая среда имеет светло-коричневый цвет.