Многие сложные дифференциально-диагностические методы окраски, например окраску по Граму, определение кислотоустойчивости, специфический метод окраски Леффлера и некоторые другие, можно рассматривать как один из первых этапов идентификации микроорганизма.
Дифференциальные методы окраски предусматривают следующие процедуры:
- подготовленный к окраске фиксированный мазок окрашивается первично тем красителем, которым надеются выявить предполагаемый возбудитель болезни;
- первичное окрашивание распространяется на все микроорганизмы, находящиеся в мазке. Поэтому вслед за ним следует протрава мазка химическим соединением, конкретным в каждом отдельном случае – кислотами, спиртом, щелочами, фенолом и пр., целью которой является обесцвечивание всех находящихся в мазке микроорганизмов, кроме искомых потенциальных возбудителей предполагаемого заболевания;
- после протравы следует вторичное дополнительное окрашивание краской контрастного цвета. Предыдущая протрава способствует прикреплению краски к обесцвеченным клеточным компонентам, и в дополнительный цвет окрашиваются практически все находящиеся в мазке микроорганизмы, кроме возбудителя болезни, для обнаружения которого применяется конкретный метод обесцвечивания, не влияющий на искомого возбудителя.
6.4.1. Дифференциальная окраска по методу Грама
В конце XIX столетия датский бактериолог Ханс Христиан Грам предложил метод дифференциальной окраски, разделивший большую часть известных патогенных бактерий на две группы: грамположительные и грамотрицательные.
Грамположительные микроорганизмы содержат в клеточной стенке большое количество тейхоевых и липотейхоевых кислот, связанных с пептидогликанами и образующих многослойную волокнистую структуру.
Поэтому при окраске по Граму эти микроорганизмы удерживают комплекс первичного красителя трифенилметиловой группы (генциан-, метил-, кристаллвиолет).
Грамотрицательные бактерии снаружи покрыты одним слоем пептидогликана, связанного с цитоплазматической мембраной посредством липопротеина, наружная мембрана состоит из липополисахаридов, фосфолипидов и белков. Из-за более Высокого содержания липидов клеточные стенки грамотрицательных бактерий имеют повышенную проницаемость и при Обесцвечивании спиртом первичный фиолетовый комплекс красителя легко удаляется через поры клеточной стенки, после чего бактерии приобретают цвет дополнительной окраски: ярко-малиновый при применении фуксина или желто-розовый – сафранина.
Таким образом, отношение к окраске по Граму определяется структурой клеточной стенки микроба.
Спектр окрашивания по Граму включает подавляющее большинство видов бактерий, имеющих то или иное значение в патологии человека. Исключение составляют плохо окрашивающиеся Leptospira, не окрашивающиеся Treponema, Mycoplasma, L-формы бактерий, у которых отсутствует клеточная стенка, а также очень мелкие внутриклеточные паразиты Chlamidia и Rickettsia.
6.4.1.1. Методика окраски бактерий по Граму
- • На мазок, фиксированный над пламенем горелки, кладут фильтровальную бумагу и наливают избыток основного красителя – карболового кристаллвиолета (рецепт 14). Прокрашивание продолжается 1–2 мин;
- снимают бумагу, сливают остаток красителя и, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя (рецепт 34) на 1–2 мин до почернения препарата;
- раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцвечивания мазка погружают несколько раз в стаканчик со спиртом. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости;
- препарат тщательно промывают водопроводной водой;
- докрашивают водно-спиртовым раствором фуксина (рецепт 16) в течение 2 мин.
Результаты окраски. Грамположительные бактерии окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.
В настоящее время более широкое применение в практике бактериологических исследований находит видоизмененный способ окраски Грама по Синеву.
Основной краситель в виде раствора заменяют фильтровальной бумагой, пропитанной 1 % спиртовым раствором кристаллического фиолетового (см. технику приготовления красящей бумаги по Синеву, рецепт 26). На препарат помещают красящую бумажку и наносят на нее 2–3 капли воды. Окрашивание идет в течение 1–2 мин. Затем бумажку снимают и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым способом.
6.4.1.2. Окраска нейссерий по Граму в модификации Г. П. Калины
- На предметное обезжиренное стекло наносят каплю воды, в ней суспендируют культуру. Добавляют каплю спиртового раствора бриллиантовой зелени (рецепт 19) и размазывают тонким слоем. Диаметр мазка примерно 1,0 см;
- после подсыхания препарат фиксируют над пламенем;
- на фиксированный мазок наливают основной реактив (рецепт 20) на 1,5–2,0 мин;
- по истечении указанного времени краску сливают и стекло в наклонном положении промывают вначале водой, затем спиртом (до отхождения облачков краски) и снова водой;
- промытый препарат докрашивают водным раствором фуксина в течение 2 мин, окончательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Результаты микроскопии. При микроскопии грамотрицательные бактерии выглядят ярко-розовыми, грамположительные – зеленовато-черными или темно-фиолетовыми. Желательно для контроля на отдельном стекле делать мазок культуры стафилококка и кишечной палочки.
6.4.1.3. КОН-тест для уточнения сомнительных результатов окраски по Граму
Обычно оценка результатов окраски по Граму не представляет ценностей. Однако в отдельных случаях грамположительные микроорганизмы, например спороносные палочки, приобретают грамотрицательную окраску, тогда как некоторые штаммы грамотрицательных бактерий родов Acinetobacter и Moraxella имеют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, вследствие чего выглядят как грамположительные.
Для уточнения таких сомнительных результатов японский ученый Е. Куи в 1938 г. предложил КОН-тест (тест Грегерсена).
В основе этого теста лежит способность клеточных стенок Грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных, сохранять целостность при воздействии на них гидроксида калия (КОН).
Для постановки этого теста петлю суточной агаровой культуры испытуемого штамма суспендируют на предметном стекле в капле 3 % раствора КОН.
При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, через несколько секунд жидкость а капле приобретает слизистую консистенцию, и при отрыве петли предметного стекла слизистые нити тянутся на 0,5– 2,0 см. Учет результатов пробы рекомендуется проводить на темном фоне.
Приобретение грамотрицательными бактериями слизистой Консистенции при обработке их гидроксидом калия связывают с выходом из клеток ДНК, представляющей собой вязкий Компонент.
6.4.2. Окраска по Романовскому-Гимзе
Рассматриваемый способ относится к сложным методам окраски. Применяют его главным образом при окраске мазков-отпечатков из органов, мазков крови, после фиксации в жидком фиксаторе Корнуа или Никифорова. Краситель Романовского–Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды (pH 7,0–7,2) прибавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского–Гимзы (рецепт 28).
Приготовленный раствор тотчас наливают на предметное стекло с окрашиваемым препаратом, или стекло погружают в стаканчик с красителем. Через 1 ч краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Краситель Романовского–Гимзы, имеющий в растворе сине-фиолетовый цвет, окрашивает протоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, так же, как и микробные тела, – в фиолетово-красный цвет (рис. 6.4 – см. вклейку).
6.4.3. Обнаружение менингококка в "толстой капле" крови при подозрении на менингококкемию
На середину предметного обезжиренного стекла наносят толстую каплю крови диаметром 1,0 см. Стекло оставляют в горизонтальном положении до полного подсыхания крови. Препарат окрашивают водным раствором метиленового синего в течение 2–3 мин (без предварительной фиксации!). После этого осторожно смывают краску водой. Мазок подсушивают на воздухе.
При микроскопии на голубом фоне видны темно-синие ядра лейкоцитов, а между ними – единичные и парные клетки кокков темно-синего цвета.
6.4.4. Окраска кислотоустойчивых микобактерий
Кислотоустойчивыми называют микробы, которые, будучи окрашенными карболовым фуксином, не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот.
Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Это свойство обусловлено наличием в клеточной стенке и цитоплазме кислотоустойчивых бактерий длинных цепочек жирных миколовой, туберкулостеариновой и других кислот с 50–100 атомами, которые делают клеточную стенку микроорганизма непроницаемой для кристаллвиолета и других красителей. Поэтому, чтобы обеспечить проникновение краски в клеточную стенку этих бактерий, приходится применять более концентрированные растворы красок в подогретом состоянии с добавлением детергентов и удлинением сроков окраски. После того как краска введена в клетку, ее нельзя обесцветить обычными кислотными и спиртовыми растворителями.
Для окрашивания кислотоустойчивых бактерий применяют обычно метод Циля–Нильсена или некоторые его модификации.
6.4.4.1. Окраска по методу Циля–Нильсена
- Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3–5 мин раствором карболового фуксина Циля (рецепт 17) или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения;
- дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой;
- окрашенный препарат обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты в течение 3–5 с или 95 % этиловым спиртом, содержащим 3 % по объему хлористоводородной кислоты (НСl), несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом;
- после обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой;
- докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффлера 3–5 мин (рецепт 9);
- окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
При окраске препаратов по методу Циля–Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой.
Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты обесцвечиваются и приобретают цвет дополнительного красителя.
6.4.4.2. Окраска по Бунге–Траутенроту
- Стекло с нанесенным на него мазком для извлечения жирных кислот опускают на 3 ч в абсолютный спирт;
- по истечении указанного срока стекло вынимают из спирта и погружают на 15 мин в 1N хромовую кислоту;
- промывают водой;
- окрашивают при подогревании карболовым фуксином (рецепт 17);
- в течение 3 мин обесцвечивают 10 % серной кислотой;
- докрашивают в течение 5 мин насыщенным спиртовым раствором метиленового синего (рецепт 7).
Метод Бунге–Траутенрота применяется для окрашивания осадка мочи при дифференциации М.tuberculosis, окрашенных в малиновый цвет, от менее кислотоустойчивых М.smagmatis, приобретающих синий цвет дополнительной краски.