Тела микробных клеток в преобладающем большинстве слу­чаев прозрачны и для того, чтобы увидеть четкие контуры микробных клеток, применяют метод биологического окраши­вания.

Окрашенные тела микроорганизмов, отчетливо выделяясь на серебристо-белом фоне препарата, позволяют ориентиро­вочно оценивать состав микробного пейзажа, изучаемого объ­екта; при применении специальных методов окраски исследу­ют некоторые анатомические структуры клетки: наличие кап­сул, спор, жгутиков, ядерного вещества, мембраны и т. д.

В качестве основных красок в микробиологии используют производные каменноугольной смолы, главным образом искус­ственные органические красители, получаемые из анилина (С6Н52,), его производных и других ароматических аминов, ряда нафталина и антрацена.

В зависимости от химической природы эти красители под­разделяются на две группы: катионные, обладающие свойства­ми оснований, и анионные (кислые). Соответственно этому они окрашивают противоположно заряженные структуры кле­ток. Так, например, ядерная ДНК клеток, относящаяся к кис­лым субстратам, будет окрашиваться катионными красками: кристаллметилвиолетом или сафранином, а цитоплазма клет­ки, обладающая щелочной реакцией, – кислыми красителями: фуксином, пикриновой кислотой и другими анионными крас­ками.

В табл. 6.1 представлены наиболее употребляемые красители катионной и анионной групп.

Таблица 6.1. Наиболее употребляемые красители катионной и анионной групп

Основные краски

(катионные)

Красные

Нейтральный красный

Пиронин

Сафранин

Фуксин основной

Синие

Виктория

Метиленовый синий

Фиолетовые

Ферциан фиолетовый

Кристаллический фиолетовый

Гематоксилин

Тионин

Зеленые

Малахитовый зеленый

Метиленовый зеленый

Янус зеленый

Коричневые

Везувин

Хризоидин

Черные

Индулин

Кислые краски

(анионные)

Красные и

розовые

Фуксин кислый

Эозин

Эритрозин

Тропеолин

Желтые

Лурантия

Конго

Пикриновая кислота

Флюоресцеин

Черные

Нигрозин (индийские чернила)

Из сухих анилиновых красок готовят обычно насыщенные спиртовые растворы, которые, не изменяя своих свойств, могут храниться длительное время. Из насыщенных спиртовых рас­творов для окрашивания бактерий изготавливаются рабочие, разбавленные спиртовые растворы нужной концентрации.

Для окрашивания микроорганизмов пользуются преимуще­ственно основными красителями.

6.2.1. Приготовление мазков для окрашивания

Мазки готовят из культур микробов, клинического материа­ла (мокрота, гной, моча, кровь и др.), из биоптатов, органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером ис­следуемого материала.

  1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (осадка центрифугированной мочи, ликвора и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериологической петлей на предметное стекло и круговыми движениями последней распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром с копеечную монету (рис. 6.2). Мазки должны содержать достаточно материала для полноценного исследования, но не должны быть чрезмерно толстыми, так как во время окрашивания они могут набухать и содержащиеся в них клетки
    невозможно будет дифференцировать.
  2. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе – шлифованное – стекло, которое должно быть уже предметно­го, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую ок­раску и одинаковую толщину на всем протяжении.
  3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериологической петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в "толстой капле" распределяется неравномерно, обра­зуя неровный край.
  1. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). При изготовлении мазков из мокроты для микроскопии следует выбирать участки, содержащие гнойные комочки, в Которых с наибольшей вероятностью содержится этиологичес­кий агент. Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу. После этого свободные концы стекол захватывают I и II пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны; при движении оба стекла должны плотно прилегать друг к другу (рис. 6.3). Полу­чаются мазки с равномерно распределенным материалом, за­нимающим большую часть предметного стекла.
  2. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого хорошо обезжиренного стекла нано­сят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериологичес­кой петлей небольшое количество исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу (1).
  3. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стекла­ми. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабли­вании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериологической петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу последовательно в нескольких участках, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.

  1. Приготовление мазков из слизистого отделяемого носоглот­ки, полости рта, носа и влагалища. Мазки с тампонов готовят посредством прокатывания тампона по предметному стеклу. Этот метод аппликации помогает сохранить морфологию и расположение клеток хозяина на участке, с которого получен материал.

6.2.2. Высушивание и фиксирование мазков

Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фик­сировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата мик­робные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие примене­ние химических средств, вызывающих коагуляцию белков ци­топлазмы.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препара­том берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за реб­ра мазком кверху и плавным движением проводят 2–3 ра­за над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фикса­ции должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков приме­няют также химические вещества и соединения (табл. 6.2).

Таблица 6.2. Химические вещества и соединения, применяемые для фиксации мазков

Фиксирующее вещество

Время фиксации, мин

Безводный метиловый спирт/

5

Этиловый (винный) спирт 96 %

10-15

Жидкость Никифорова (смесь спирта и наркозного афира в соотношении 1:1)

10-15

Жидкость Карнуа (спирта 96 % – 60 мл, хлорофор-ма – 30 мл, ледяной уксусной кислоты – 10 мл)

10-15

Ацетон

5

Жидкость Буэна (формалина неразбавленного – 10 мл, ледяной уксусной кислоты – 2 мл, насы­щенного водного раствора пикриновой кислоты – 30 мл)

5-10

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на Воздухе.