Глубинный метод посева в плотные среды. Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры 45±0,5 °С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4–5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязнила крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

Поверхностный метод посева на плотные среды. Среду наливают в чашку Петри и после застывания подсушивают. Для удаления влаги с поверхности среды чашки открывают, пере­ворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин при 48-50 °С.

На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разве­дение навески и равномерно растирают по поверхности шпа­телем – изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Метод посева в жидкие среды. В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведения навески. При определении количества микроорганизмов пита­тельные среды засевают продуктом и(или) разведениями наве­сок так, чтобы последовательно выдерживалась заданная крат­ность количества посевного материала.

Метод мембранных фильтров. Мембранные фильтры приме­няют для анализа легко фильтруемых жидких продуктов или продуктов, дающих растворы с высоким осмотическим давле­нием. При фильтрации раствора с высоким осмотическим дав­лением раствор предварительно разводят дистиллированной или пептонной водой в соотношении, позволяющем легко профильтровать разведенные растворы.

Жидкий продукт, содержащий небольшое число взвешен­ных частиц, фильтруют в два этапа. Для освобождения от частиц его фильтруют через фильтр со средним диаметром пор 4 мкм, а затем – через фильтр, диаметр и размеры пор кото­рого выбраны в соответствии с группой или видом выявляемых микроорганизмов. Оба фильтра культивируют в аналогичных условиях.

После осаждения микроорганизмов на фильтре из растворов с высоким осмотическим давлением или из растворов, содер­жащих антимикробные вещества, его промывают дистиллиро­ванной водой или пептонно-солевым раствором.

Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. Немедленно после окончания фильтра­ции фильтр переносят на плотные или в жидкие питательные среды. На плотную среду фильтр накладывают нижней сторо­ной так, чтобы она полностью соприкасалась с поверхностью среды. Посевы термостатируют в условиях, благоприятных для роста определяемых микроорганизмов.

Обработка результатов. После термостатирования, установ­ленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или менее другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

В некоторых случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, в присутствии инвазивных микроорганизмов). Эти случаи рассматриваются в соответствующих стандартах на кон­кретные методы испытаний.

Пример метода расчета (общий случай). Для получения до­стоверных результатов при подсчете количества колоний необ­ходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. Количество микроорганизмов N в 1 г (см3) пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле

где ΣС – сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний; V– объем посевного материа­ла, внесенного в каждую чашку, см3; n1 – количество отобран­ных для подсчета чашек в первом разведении; n2 – количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении; d – коэффициент разбавления, соответствующий первому разведе­нию.

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Для этого, если последняя цифра меньше 5, предшествующую цифру не изменяют; если последняя цифра равна или более 5, предшествующую увеличивают на единицу. Округление прово­дят поэтапно до получения двух значащих цифр.

За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см3 (жидкие продукты) или в 1 г (прочие продукты), выраженное в виде числа от 1,1 до 9,9, умноженного на 10 в соответствую­щей степени.

ПРИМЕР.

Округление результата дает 19 000, или 1,9·104 микроорга­низмов в грамме продукта.

Метод расчета при проведении идентификации. Если исполь­зуемый метод требует идентификации, определенное количе­ство колоний (обычно 5) пересевают с каждой чашки, ото­бранной для подсчета колоний. После идентификации рассчи­тывают для каждой чашки количество идентифицированных микроорганизмов а по формуле

где А – количество колоний, отобранных для идентификации; b – количество колоний, соответствующих критериям иденти­фикации; С – общее количество колоний.

Результат вычисления округляют до целого числа.

Количество N идентифицированных микроорганизмов, присутствующих в 1 г (см3) испытуемой пробы, рассчитывают как средневзвешенное значение, заменив ΣС на Σa.

ПРИМЕР.

Прямой подсчет жидкого продукта дал следующие резуль­таты:

  • в первом выбранном разведении (10-3) в двух чашках вы­явлено соответственно 66 и 80 колоний;
  • во втором выбранном разведении (10-4) – 4 и 7 колоний.

Результаты идентификации:

  • из чашки с 66 колониями для идентификации отобрано 8 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следо­вательно, а = 50;
  • из чашки с 80 колониями отобрано 9 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следовательно, а = 53;
  • из чашки с 7 колониями отобрано 5 колоний, из которых 4 соответствовали критериям; следовательно, а = 6;
  • из чашки с 4 колониями все 4 идентифицированы положи­тельно; следовательно а = 4.

Таким образом, количество обнаруженных в пробе микро­организмов составляет 5,1·104                    в 1 см3.

Приближенные оценки количества микроорганизмов.

Если в каждой из двух чашек содержится менее 15 колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то рассчитывают среднее ариф­метическое у колоний, подсчитанных на этих чашках.

Результат выражают следующим образом:

  • для жидких продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 см3 NE= Υ,
  • для прочих продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 г Ng = Υ/d, где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то результаты выражают следующим образом:

  • менее 1 микроорганизма в 1 см3 (жидкие продукты);
  • менее 1/d микроорганизмов в 1 г (прочие продукты), где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Метод подсчета с использованием жидкой среды. Метод наи­более вероятного числа (НВЧ). Возможны два способа посева.

В наиболее часто используемом способе, называемом "симмет­ричным", применяется одинаковое количество пробирок в каж­дом разведении, объемы соседних разведений обычно соотно­сятся как 1:10. Этот способ используют, если нужно определить не только превышение определенных предельных норм, но и количество присутствующих микроорганизмов.

Используют также способ, называемый "асимметричным", который предусматривает разное количество пробирок в от­дельных разведениях.

В действующих стандартах рассматривается только "сим­метричный" способ с десятикратными разведениями.

В зависимости от требуемой точности результатов засевают необходимое количество флаконов или пробирок одним и тем же разведением (например, три, пять или десять). Как правило, применяемые методы требуют трех пробирок или флаконов на разведение.

Значения индекса НВЧ для приемлемых сочетаний находят по табл. 22.1. С помощью индекса НВЧ определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов СS в заданном объеме VS по Формуле

где Миндекс НВЧ, взятый из табл. 22.1 для базового разве­дения V0; F число, обратное коэффициенту разбавления ис­ходной пробы. Это разведение (1,0) использовано в табл. 22.1 как базовое разведение (обычно F = 10,100 и т.д.); VS – задан­ный объем, выбранный для выражения содержания микроор­ганизмов; V0 - объем, использованный для посева базового разведения.

Если наименьшее разведение из отобранных соответствует пробирке, приготовленной из среды двойной концентрации (посев 10 см3), индекс НВС, взятый из табл. 22.1, делят на 10.

Если НВЧ меньше 0,3 микроорганизма в 1 см3 (жидкие продукты) или в 1 г (другие продукты) и если была использо­вана методика, предназначенная для малых количеств микро­организмов, результаты должны выражаться следующим обра­зом: менее                                    1 микроорганизма в 1 см3 для жидких продуктов или 1 г для прочих продуктов.

ПРИМЕР.

Для твердого продукта установлен индекс НВС, равный 24; первая выбранная пробирка соответствует посеву 1 см3 исход­ной суспензии (F = 10), отсюда СS в 1 г составляет

Число положительных пробирок трех выбранных разведений

НВЧ микроорганизмов

Категория оценки для одновременно проанализированных проб в количестве

Действительное число микроорганизмов в 1 (см3) с вероятностью

95%

99 %

1,0

0,1

0,01

1

2

3

5

10

от

до

от

до

2

2

1

2,8

3

2

2

2

1

0,9

9,4

0,5

14,2

2

2

2

3,5

0

0

0

0

3

0,9

9,4

0,5

14,2

2

3

0

2,9

3

2

2

2

1

0,9

9,4

0,5

14,2

2

3

1

3,6

0

3

3

3

3

0,9

9,4

0,5

14,2

3

0

0

2,3

1

1

1

1

1

0,5

9,4

0,3

14,2

3

0

1

3,8

1

1

1

1

1

0,9

10,4

0,5

15,7

3

0

2

6,4

3

3

2

2

2

1,6

18,1

1,0

25,0

3

1

0

4,3

1

1

1

1

1

0,9

18,1

0,5

25,0

3

1

1

7,5

1

1

1

1

1

1,7

19,9

1,1

2710

3

1

2

12

3

2

2

2

1

3

36

2

44

3

1

3

16

0

0

0

3

3

3

38

2

52

3

2

0

9,3

1

1

1

1

1

1,8

36,0

1,2

43,0

3

2

1

15

1

1

1

1

1

3

38

2

52

3

2

2

21

2

1

1

1

1

3

40

2

56

3

2

3

29

3

3

3

2

2

9

99

5

152

3

3

0

24

1

1

1

1

1

4

99

5

152

3

3

1

46

1

1

1

1

1

9

198

5

283

3

3

2

110

1

1

1

1

1

20

400

10

570

3

3

3

<110

 

Метод обнаружения. Метод обнаружения – это метод, который определяет наличие или отсутствие микроорганизмов в заданном объеме продукта. Если не установлено иное вы конкретных стандартах на методы испытаний, количество Р испытываемого продукта смешивают (жидкие продукты) или гомогенизируют (прочее продукты) с 9 см3 или 1 г элективной либо селективной среды. Все среды применяют в расплавленном виде. После термостатирования на поверхности селективной агаровой среды получают несколько изолированных колоний (обычно пять) и подвергают их идентификации.

Иногда имеет смысл использовать для тех же целей две или более элективные или селективные жидкие среды, а также две или более селективные агаровые среды. Если обнаружен микроорганизм, то указывают, в какой навеске исследуемого продукта.