Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т.е. све­титься при освещении невидимым ультрафиолетовым или си­ним светом.

Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (пра­вило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного; если люминесцен­ция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные свето­фильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать срав­нительно слабое люминесцентное свечение.

Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от таковых обычного светового микроскопа в основном следующим:

  • наличием мощного источника света в осветителе, излучаю­щего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолето­вой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверх­высокого давления или галогенная кварцевая лампа);
  • наличием системы светофильтров: → возбуждающие свето­фильтры пропускают только ту часть спектра, которая воз­буждает люминесценцию: → теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа. В некоторых отече­ственных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию, кроме того, выполняет кювета с плоскопарал­лельными стеклами, заполненная дистиллированной водой; → "запирающие" светофильтры расположены между пре­паратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуж­дающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В нашей стране разработан эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который заклю­чается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличи­вается при использовании объективов, имеющих большую чис­ловую апертуру, т.е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференционная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив. Она представляет собой полупрозрачное зеркало, избирательно отражающее и направляющее в объектив область спектра, которая возбуждает люминесценцию, а пропускает в окуляр свет люминесценции.

Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготав­ливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оп­раве таких объективов выгравирована буква "Л". При работе с Объективами масляной иммерсии используется нелюминесцирующее иммерсионное масло.

Поскольку большинство микроорганизмов не обладают соб­ственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это флюорохромирование – окрашивание сильно разведенными (до нескольких мкг/мл) растворами флюоресци­рующих красителей (флюорохромов). Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некото­рых инфекций: туберкулеза (аурамин), дифтерии (корифосфин), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами (примулин), и др. Этот же способ может применяться для Цитохимического изучения живых и фиксированных микроор­ганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки (например, акридиновый оранжевый, связываясь с ДНК, флюоресцирует зеленым, а с РНК – крас­ным).

В отличие от обычных красителей флюорохромы применя­ют в больших разведениях (до 1:500 000 и выше). Это дает возможность использовать их для прижизненного флюорохромирования, поскольку в таких разведениях значительно сни­жается их токсическое действие на клетки. Необходимо отме­тить, что повышение концентрации флюорохрома нередко приводит к снижению яркости флюоресценции (концентраци­онное гашение). Значительно снижают яркость флюоресцен­ции или полностью ее гасят тяжелые металлы, железо и некоторые другие вещества. В связи с этим для фиксации не могут быть использованы жидкости, содержащие тяжелые металлы, а для промывки – вода, содержащая примесь железа.

Метод флюорохромирования нашел применение в бактериоскопической диагностике некоторых инфекций благодаря тому, что он обладает более высокой чувствительностью, поскольку ярко светящиеся на темном фоне бактерии легче об­наружить, чем при обычном окрашивании, даже при меньшем увеличении. В частности, при окрашивании по Цилю–Ниль­сену замена фуксина на флюорохром аурамин ОО позволяет более эффективно выявлять с помощью люминесцентной мик­роскопии кислотоустойчивые палочки в исследуемом материа­ле. Флюорохром корифосфин избирательно окрашивает зерна волютина, что позволяет использовать его в бактериоскопической диагностике дифтерии.