Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т.е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом.
Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного; если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.
Устройство люминесцентного микроскопа и правила работы с ним отличаются от таковых обычного светового микроскопа в основном следующим:
- наличием мощного источника света в осветителе, излучающего преимущественно в коротковолновой (ультрафиолетовой, синей) части спектра (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогенная кварцевая лампа);
- наличием системы светофильтров: → возбуждающие светофильтры пропускают только ту часть спектра, которая возбуждает люминесценцию: → теплозащитный светофильтр защищает от перегрева другие светофильтры, препарат и оптику люминесцентного микроскопа. В некоторых отечественных люминесцентных микроскопах теплозащитную функцию, кроме того, выполняет кювета с плоскопараллельными стеклами, заполненная дистиллированной водой; → "запирающие" светофильтры расположены между препаратом и окуляром. Эти светофильтры поглощают возбуждающее излучение и пропускают свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.
В нашей стране разработан эффективный способ освещения препаратов для возбуждения люминесценции, который заключается в том, что препарат освещают светом, падающим на него через объектив. Благодаря этому освещенность увеличивается при использовании объективов, имеющих большую числовую апертуру, т.е. тех, которые используются для изучения микроорганизмов. Важную роль при этом способе освещения играет специальная интерференционная светоделительная пластинка, направляющая свет в объектив. Она представляет собой полупрозрачное зеркало, избирательно отражающее и направляющее в объектив область спектра, которая возбуждает люминесценцию, а пропускает в окуляр свет люминесценции.
Оптика объективов люминесцентного микроскопа изготавливается из нелюминесцирующих сортов оптического стекла и склеивается специальным нелюминесцирующим клеем. На оправе таких объективов выгравирована буква "Л". При работе с Объективами масляной иммерсии используется нелюминесцирующее иммерсионное масло.
Поскольку большинство микроорганизмов не обладают собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это флюорохромирование – окрашивание сильно разведенными (до нескольких мкг/мл) растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов). Этот метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некоторых инфекций: туберкулеза (аурамин), дифтерии (корифосфин), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами (примулин), и др. Этот же способ может применяться для Цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки (например, акридиновый оранжевый, связываясь с ДНК, флюоресцирует зеленым, а с РНК – красным).
В отличие от обычных красителей флюорохромы применяют в больших разведениях (до 1:500 000 и выше). Это дает возможность использовать их для прижизненного флюорохромирования, поскольку в таких разведениях значительно снижается их токсическое действие на клетки. Необходимо отметить, что повышение концентрации флюорохрома нередко приводит к снижению яркости флюоресценции (концентрационное гашение). Значительно снижают яркость флюоресценции или полностью ее гасят тяжелые металлы, железо и некоторые другие вещества. В связи с этим для фиксации не могут быть использованы жидкости, содержащие тяжелые металлы, а для промывки – вода, содержащая примесь железа.
Метод флюорохромирования нашел применение в бактериоскопической диагностике некоторых инфекций благодаря тому, что он обладает более высокой чувствительностью, поскольку ярко светящиеся на темном фоне бактерии легче обнаружить, чем при обычном окрашивании, даже при меньшем увеличении. В частности, при окрашивании по Цилю–Нильсену замена фуксина на флюорохром аурамин ОО позволяет более эффективно выявлять с помощью люминесцентной микроскопии кислотоустойчивые палочки в исследуемом материале. Флюорохром корифосфин избирательно окрашивает зерна волютина, что позволяет использовать его в бактериоскопической диагностике дифтерии.