Общие колиформные бактерии (ОКБ) – это грамотрицательные, оксидазоотрицательные палочки, не образующие спор, растущие на дифференциальных лактозных средах, фер­ментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при тем­пературе 37±1 °С в течение 24–48 ч. Термотолерантные коли­формные бактерии (ТКБ) входят в число ОКБ, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лак­тозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.

ОКБ и ТКБ в воде, согласно действующим МУ 2.1.4.1018–01, определяют мембранным и титрационным (бродильным) мето­дами. Титрационный метод используют только при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации, наличии в воде большого количества взвешенных веществ и в случае преобла­дания посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний.

18.3.1. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации

Сущность метода заключается в концентрировании бакте­рий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с подращиванием их на среде Эндо при 37±1,0 °С, дифферен­цировании по культуральным и биохимическим тестам и под­счете выросших колоний.

Первый день. 1. Подготовка мембранных фильтров. Мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм и разме­ром диска 35 или 47 мм (ацетатцеллюлозные, нитратцеллюлозные, ядерные и др.), имеющие сертификат качества, выпуска­ются стерильными, в противном случае их стерилизуют методом кипячения по инструкции, предложенной изготовителем.

  1. Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат, воронку и столик фильтровального аппарата обтирают и фламбируют марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на столик фильтровального аппа­рата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембран­ный фильтр, прижимают его воронкой. Если вода содержит большое количество взвешенных веществ или клеток, ее сна­чала фильтруют через фильтр с большим диаметром пор, по­мещая его поверх основного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
  2. Фильтрование воды. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум. При посеве нескольких объемов одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сна­чала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы при­бор обеззараживают. Вначале фильтруют пробы обеззаражен­ной воды или предположительно незагрязненные, а затем фильтруют загрязненные пробы. При фильтровании 1 мл ис­следуемой воды в воронку наливают предварительно не менее 10 мл стерильной воды, а затем вносят анализируемую воду.

После окончания фильтрования и осушения фильтра от­ключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно подни­мают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду Эндо (рецепты 96, 97), разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку помещают 3–4 фильтра с усло­вием, чтобы фильтры не соприкасались. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при тем­пературе 37±1 °С в течение 24±2 ч.

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

Объем воды водоемов для посева выбирают в зависимости от степени ее предполагаемого загрязнения. Рассчитывают, чтобы не менее чем на двух фильтрах выросли изолированные колонии. Из них не более 30 колоний на фильтрах диаметром 35 мм или не более 50 колоний на фильтрах диаметром 47 мм должны быть образованы колиформными бактериями. При этом можно ориентироваться на результаты предыдущих ис­следований.

При исследовании воды неизвестной степени бактериаль­ного загрязнения следует засевать не менее четырех-десяти-кратных ее объемов.

Так, например, для воды водоемов, загрязняемых сточными водами, рекомендуется брать объемы 10; 1; 0,1; 0,01 мл. При анализе воды водоемов в зоне влияния выпуска сточных вод – 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл; для чистых водоемов – 100; 50; 10; 1 мл. При анализе воды незагрязненных шахтных колодцев фильтруют 100; 10; 1 и 0,1 мл.

Второй день. По окончании инкубации производят про­смотр посевов:

  • • отсутствие микробного роста или обнаружение колоний, не характерных для ОКБ (пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые), позволяет на этом этапе ана­лиза закончить исследования с выдачей отрицательного ре­зультата (отсутствие ОКБ и ТКБ в исследуемом объеме воды). Анализ заканчивают через 24 ч;
  • • при обнаружении на фильтрах типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, красных с металличес­ким блеском или без него либо других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра) иссле­дования продолжают. Подсчитывают число колоний каждо­го типа отдельно и приступают к подтверждению их при­надлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на наличие оксидазной активности (см. гл. 9, рецепт 75). Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семей­ства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семей­ства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитов, которые в отличие от кишечных бактерий вырабатывают фермент оксидазу.

Готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют или определяют принадлежность к грамотрицательным бакте­риям постановкой теста Грегерсена, не требующего использования оптики (см. гл. 6). Подтверждают ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две про­бирки с лактозной средой (рецепт 99).

  • — для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 48 ч;
  • — для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры 43–44 °С, и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверж­дающих полужидких средах и СИБ-лактозы (коммерческие полоски) возможен через 4–6 ч. При обнаружении кислоты и газа в среде с лактозой дают положительный ответ. При отсут­ствии кислоты и газа или при наличии только кислоты про­бирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного ре­зультата оставляют для окончательного учета до 48 ч.

При лабораторно-производственном контроле качества воды поверхностных водоемов анализ может быть завершен подсчетом колоний, которые отнесены к ОКБ по двум призна­кам: отрицательному оксидазному тесту и ферментации лакто­зы на среде Эндо до кислоты и альдегида. Дальнейшее под­тверждение ОКБ по способности образовывать газ на лактозных средах проводят только при отсутствии достаточно четкой дифференциации лактозоположительных колоний, при росте мелкоточечных или мелких плоских колоний, не характерных для колиформных бактерий, при небольшом опыте работы выполняющего анализ.

Учет результатов. Грамотрицательные колонии учитывают­ся как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и фермента­ции лактозы при температуре 37 °С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при от­рицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кислоты и газа.

При анализе питьевой воды, воды водоемов число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильт­рах и выражают результат анализа в КОЕ на 100 мл воды.

Вычисление проводят по формуле:

где X – число колоний в 100 мл; V – профильтрованный через фильтры объем воды; а – число подсчитанных на этих фильт­рах колоний в сумме.

Примеры:

  1. При посеве по 100 мл воды на 3 фильтрах выросло две колонии на одном фильтре, на остальных двух фильтрах нет роста. Число общих или термотолерантных колиформных бак­терий будет:
  1. При посеве 10, 40, 100 и 150 мл воды на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные колонии, с профильтрованным объемом 100 мл – 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 и 150 мл заросли и учету не подлежат. Суммируют общее число колоний ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, пересчитывают это чис­ло на объем 100 мл.

Питьевая вода, вода водоемов удовлетворяют требованиям в том случае, когда ОКБ и ТКБ не обнаруживают в 100 мл воды. При установлении бактериальной загрязненности воды свыше допустимых норм прибегают к повторному исследова­нию воды.

18.3.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Первый день: а) при исследовании питьевой воды засевают 3 объема по 100 мл (качественный метод). При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл, трех объемов по 1 мл;

б) посев воды водоемов производят в двух или трех повторностях. Воду водоемов, не загрязняемых сточными водами, засевают в объемах по 10; 1; 0,1; 0,01 мл; воду водоемов, загрязняемых сточными водами, – по 1; 0,1; 0,01; 0,001 мл; воду водоемов в зоне влияния выпусков сточных вод – в объе­ме по 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозопептонную среду (рецепт 95). Посев 100 и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозопептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Второй день. Посевы инкубируют при 37±1 °С. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из ем­костей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образова­ние газа, производят высев бактериологической петлей на сек­тора среды Эндо (рецепты 96, 97) для получения изолирован­ных колоний.

Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными, и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 18–20 ч.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий (темно-красных или красных, с металличес­ким блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде), дают положительный ответ на присутствие ОКБ в данном объеме пробы.

Отрицательный ответ выдается, если в среде накопления и на секторах среды Эндо не отмечено роста; на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии; все колонии оказались оксидазоположительными; все бактерии оказались грамположительными; не отмечено га­зообразования в подтверждающем тесте на среде с углеводом.

Для определения секторов среды Эндо, где выросли типич­ные лактозоположительные колонии, делают посев 2–3 изо­лированных колоний каждого типа с каждого сектора в про­бирки с любой из лактозных сред (рецепты 99, 100).

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки по­мещают в термостат и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4–6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способ­ности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях выдают отрицательный ответ.

Для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ произво­дят высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком и прогретой предварительно до тем­пературы 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при темпе­ратуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

Учет результатов. При обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из трех объемов питьевой воды выдается ответ об обнаружении ОКБ и ТКБ в 100 мл.

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ питьевой воды (табл. 18.1), воды водоемов (табл. 18.2).