Оборудование

Спектрофотометр-нефелометр

Хемилюминометр

Лабораторный микроскоп

Люминесцентный микроскоп

Центрифуга с горизонтальным ротором для выделения кле­точных популяций

96-луночные круглодонные и плоскодонные планшеты для иммунологических исследований

Титровальные планшеты

Автоматические пипетки-дозаторы с регулируемым объемом

на 10-50; 20-100; 100-500; 1000-5000 мкл

Пастеровские пипетки

Денситометр

Водяная баня

Магнитная мешалка

Камера Горяева

Счетчик форменных элементов крови

Пластиковые пробирки объемом 12 мл

Центрифужные пробирки

Термостат

СО2-инкубатор

Холодильник

Приготовление рабочих реактивов для микрометода определе­ния компонентов комплемента

Буфер хранить в холодильнике. Для приготовления рабочего раствора буфера (РРБ) к одному объему 5-кратного буфера добавить 4 объема дистиллированной воды.

Раствор "Глюгицир" для хранения эритроцитов (Гематологический научный центр, Москва).

Гемолитическая сыворотка (НПО "Биомед", Пермь) перед проведением реакции разводится РРБ так, чтобы ее титр в 3 ра­за (тройной титр) превышал рабочий титр, указанный на эти­кетке. Например, при рабочем титре 1:3000 сыворотку следует разводить в 1000 раз.

Стандартную взвесь эритроцитов барана (109 кл/мкл) гото­вят из отмытых несколько раз холодным рабочим раствором веронал-мединалового буфера, центрифугируя по 5 мин при 3000 об/мин до получения совершенно бесцветной надосадочной жидкости. Лучше всего эритроциты барана в растворе "Глюгицир" залить РРБ и оставить на ночь в холодильнике до полного отстаивания. Надосадок осторожно собрать пипеткой. К 1 объему осадка добавить 17 объемов РРБ. Для стандарти­зации взвеси эритроцитов барана 0,2 мл суспензии лизируют 2,8 мл дистиллированной воды. Оптическая плотность (ОП) лизата должна равняться 0,7 при длине волны 541 нм (в кювете толщиной 1 см против воды), что по концентрации гемогло­бина соответствует примерно 109 кл/мл.

Если ОП отличается от 0,7, то конечный объем, до которого необходимо развести имеющийся объем взвеси (Уисходн), оп­ределяют по формуле:

Если ОП больше 0,7, то к исходному объему взвеси добав­ляют РРБ до конечного объема, если ОП ниже 0,7, то необ­ходимый объем буфера отбрасывают после центрифугирования взвси.

Приготовление рабочей суспензии ЕА-комплекса (сенсиби­лизированных эритроцитов) в концентрации 1,5-108 кл/мкл. К 10 мл взвеси отмытых, как описано выше, эритроцитов барана в концентрации 1∙109 кл/мл добавляют 10 мл гемоли­тической сыворотки, разбавленной РРБ согласно наставлению по применению, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при 37°С, периодически перемешивая. Взвесь доводят до концентрации 1,5∙108 кл/мкл, добавляя 46,7 буфера. Смесь 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов с 2,8 мл воды долж­на иметь поглощение 1,0 при длине волны 412 нм. Эритроциты хранят в течение 7 сут при температуре 6±2 °С и перед каждой постановкой отмывают РРБ и стандартизуют.

Подготовка сухих реагентов. Реагенты представляют собой лиофилизированную сыворотку крови человека, в которой отсутствует тестируемый компонент. Реагенты выпускают во флаконах по 0,5 и 1,0 мл. Комплект состоит из 5 флаконов для определения активности С1, С2, СЗ, С4 и С5-компонентов комплемента. Реагенты растворяют дистиллированной водой при легком встряхивании до объема, указанного на этикетке. Непосредственно перед титрованием готовят рабочее разведе­ние реагентов с помощью РРБ, как указано на этикетке.

Растворы, реактивы

Фосфатный буфер (рН 7,2) на тридистиллированной авто-клавированной воде:

7,0 г NaС1

2,0 г Na2НРO4

0,3 г КН2РО4 до 1000 мл Н2O.

0,1 М веронал-мединаловый буфер (рН 8,6)

0,8 г веронала растворить при нагревании в 700 мл дистил­лированной воды, добавить 4,5 г мединала и общий объем довести до 1 л.

Приготовление реактивов для исследования фагоцитарной ак­тивности нейтрофилов и субпопуляций лимфоцитов

Гепарин: 1 мл стандартного раствора с активностью 5000 ЕД в 1 мл разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (1,0 мл концентрированного гепарина смешивают с 9,0 мл изотонического раствора хлорида натрия). Хранят в холо­дильнике. При взятии крови в пробирку вносят 0,2 мл (200 мкл) разведенного гепарина и 10 мл венозной крови. Конечная концентрация – 10 ЕД в 1 мл крови.

Инкубационная среда – 20 % раствор сыворотки крупного рогатого скота на 0,85 % стерильном растворе №С1 готовят в день проведения исследования. Не хранить!

Раствор Хенкса без фенолового красного (НИИ полиомие­лита и вирусных энцефалитов, Москва).

Раствор нитросинего тетразолия для НСТ-теста: 4 мг НСТ ("Sigma", мол.м. 817,6) смешивают с 1 мл фосфатного буфера (рН 7,2–7,4) или стерильного изотонического раствора хлори­да натрия. Для лучшего растворения помещают в термостат на 30–40 мин при 37°С. Фильтруют! Готовят непосредственно перед использованием. Необходимый объем раствора опреде­ляют исходя из числа исследуемых образцов крови.

Краситель – 1 % раствор метилового зеленого: 1 г метило­вого зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют и хранят в холодильнике. Недостаточно очищенный краситель имеет фиолетовый цвет, от которого можно изба­виться, экстрагируя примеси хлороформом. Для этого смешать водный раствор красителя с равным объемом хлороформа и после расслоения аккуратно слить водную часть. Повторить 2–3 раза до получения чистого зеленого цвета красителя. Про­цедуру проводить в вытяжном шкафу.

Опсонизированный зимозан. Используется зимозан, выпус­каемый для определения пропердина (НПО "Биохим-реактив", Олайне). Готовят смесь сывороток 10 доноров. Готовят навеску зимозана из расчета 20 мг на 1 мл сывороточного пула.

Зимозан суспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия (на 1 г зимозана – 100 мл раствора) и кипятят на водяной бане 30 мин. Отмывают центрифугированием два раза 0,85 % раствором хлорида натрия и добавляют к свежеприго­товленной сыворотке 10 доноров до конечной концентрации 20 мг/мл, инкубируют 45 мин при 37°С, периодически встря­хивая. Затем трижды отмывают путем центрифугирования рас­твором без кальция и магния, чтобы избежать агрегации клеток и ресуспендируют взвесь до первоначального объема. Приго­товленный зимозан разливают на аликвоты по 250 мкл и хра­нят при – 40–70°С на протяжении нескольких месяцев.

Раствор для отмывания клеток без Са2+ и Mg2+.

NaCl 8 г, KCl 0,4 г, Na2HPO4 0,4 г, К2РO4 0,4 г, 1 г глюкозы, 2,7 г HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N12-этансульфоновой кислоты) дистиллированной воды до 1 л (pH 7,0). Все растворы стерилизуют через мембранный фильтр.

Взвесь латекса с размером частиц 0,8–1,4 мкр для исследо­вания поглотительной активности нейтрофилов готовят на фосфатном буфере или на стандартном растворе Хенкса из стандартной 10 % взвеси. Рабочая концентрация латекса – 0,1 % (0,1 мл 10 % взвеси разводят в 10 мл буфера или раствора Хенкса).

Раствор фиколла и верографина (или урографина) для вы­деления клеток. Градиент с плотностью 1,076 г/см2 готовят следующим образом: к 20 г фиколла ("Pharmacia", Швеция) добавить 50 мл 76 % раствора урографина (ФАО "Ферейн", Россия) и 280 мл дистиллированной воды.

Градиент с плотностью 1,118 г/см2 готовят из предыдущего раствора с плотностью 1,076 г/см2, добавляя в него 76 % рас­твор урографина под контролем ареометра.

Рабочий раствор люминола для ХЛ анализа. 0,56 мМ люми-нола ("Aldrich", США) готовят следующим образом: 10 мг люминола растворяют в 80 мл раствора Хенкса без фенолового красного на магнитной мешалке в течение 18 ч в темноте при комнатной температуре, затем раствором Хенкса доводят объ­ем до 100 мл. Разливают на аликвоты по 3 мл и хранят при температуре от –18 до –20 °С в течение нескольких месяцев.

0,5 % краситель генциановый фиолетовый на 3 % уксусной кислоте для подсчета лейкоцитов готовят следующим образом: 3 мл ледяной уксусной кислоты (МХК "Лаверна", Москва) переносят в 97 мл дистиллированной воды, добавляют 0,5 г генцианового фиолетового (МХК "Лаверна", Москва) и раство­ряют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре, фильтруют через бумаж­ный фильтр и хранят в холодильнике несколько месяцев.

Приготовление агара для реакции иммунодиффузии

Для получения 1,5 % агара навеску добавить в соответствую­щий объем 0,1 М веронал-мединалового буфера. Колбу со смесью помещают в кипящую водяную баню, смесь периоди­чески перемешивают, не позволяя агару оседать на дно. Агар считается готовым, когда он приобретает стекловидную про­зрачность.

Материалы для исследования ИФ-статуса

Среда Игла однократная или двойная

Среда RPMI-1640

Гентамицин (0,08 мг/мл)

Глутамин (0,3 мг/мл)

Бычья сыворотка – 2% в среде

Культура клеток фибробластов человека М19

Вирус болезни Ньюкасла, штамм Канзас (ВБН)

Вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана (ВВС)

Фитогемагглютинин Р (ФГА), "Difco", США

Поли(И).поли(Ц), "Sigma", США

ДЭАЭ-декстран, "Upsula", Швеция

Гепарин

1 N HCl, 1 N NaOH

Индикаторная бумага

Референс человеческого ИФ-α, ИФ-ß, ИФ-γ

Антисыворотки к человеческим ИФ-α, ИФ-ß, ИФ-γ