Взятие клинического материала. Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, кровь, слизь и другие биологические выделения. Взятие исследуемого материала производится в стерильные пробирки. Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала или уретры, произведенный с помощью одноразовых стерильных зондов, переносится в пробирку с 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия. Взятые пробы клинического материала могут храниться при температуре –16–20°С в морозильной камере или в морозильном отделении двухкамерного холодильника класса *** не более 2 нед.
Обработка клинических проб. Способ выделения ДНК зависит как от вида определяемого возбудителя, так и от вида клинического образца. Обычно детально способ выделения ДНК или РНК из образца описывается в инструкции по использованию набора реагентов, прилагаемых к диагностическим ПЦР-наборам. Рассмотрим типичный способ подготовки клинической пробы к анализу.
- Исследуемый материал центрифугируют 10 мин при 12 000 об./мин. Удаляют 600 мкл надосадочной жидкости. Оставшийся материал тщательно размешивают в пробирке на встряхивателе (вортексе). 100 мкл суспензии, содержащей клинический материал, переносят в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 300 мкл лизирующего раствора, имеющегося в составе набора реагентов, и 5 мкл суспензии двуокиси кремния. Пробы инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая на вортексе.
- Пробы центрифугируют 30с на микроцентрифуге при 12 000 об./мин, супернатант удаляют.
- К осадку добавляют 150 мкл раствора для отмывки, также входящего в состав набора, встряхивают его на вортексе и центрифугируют в течение 30 с при 12 000 об./мин. Супернатант удаляют.
- К осадку добавляют 700 мкл раствора для отмывки, встряхивают его на вортексе и центрифугируют в течение 30 с при 12 000 об./мин. Супернатант удаляют.
- Проводят повторную процедуру отмывки, как на предыдущем этапе.
- Дополнительным центрифугированием с последующим удалением супернатанта убирают остатки раствора 3. Пробы подсушивают 5 мин при температуре 45–55°С, оставляя пробирки открытыми.
- Добавляют 50 мкл деионизированной воды, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 5 мин при 45–55°С.
- Пробы центрифугируют 30 с, водную фазу отбирают в другую пробирку и используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакций амплификации либо хранят при –18–25 °С в течение 2 нед.
Проведение ПЦР
- Нумеруют пробирки объемом 0,5 мл для проведения амплификации и располагают их соответствующим образом в штативе. Приготавливают также пробирки для положительного и отрицательного контролей (промаркировав их "К+", "К-").
- Определенное количество образца из обработанной клинической пробы, обычно 10 мкл, вносят в пробирку. Затем в эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, буфера для проведения ПЦР, раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов, раствора праймеров и раствора фермента Тая-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Объем реакционной смеси составляет 25 мкл.
- Для удобства обычно амплификационную смесь готовят для общего количества анализируемых проб и разливают по 15 мкл в каждую пробирку для амплификации.
- В пробирку, маркированную "К+", вносят 2 мкл контрольного образца ДНК и 8 мкл воды, в пробирку, помеченную "К–", вносят 10 мкл деионизированной воды.
- Во все остальные пробирки вносят по 10 мкл подготовленных проб.
- Для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе реакции в каждую пробирку вносят по одной капле (15–20 мкл) вазелинового масла.
- • Пробирки закрывают, центрифугируют 5 с при 3000 об./мин, помещают в программируемый термостат для проведения реакции амплификации по программе, описанной в инструкции по использованию набора реагентов, прилагаемых к диагностическим ПЦР-наборам. Программа заключается в периодической циклической смене температур амплифи-кационной смеси, в диапазоне от 94 до 50 °С.
Регистрация результатов осуществляется методом электрофореза в 1,2 % агарозном геле, приготовленном на однократном трис-ацетатном (1 × ТАЕ) буфере.
- • Приготовление 1 × ТАЕ буфера: к 20 мл 50-кратного ТАЕ добавляют 980 мл дистиллированной воды и 50 мкл раствора бромистого этидия.
ВНИМАНИЕ! Бромистый этидий – сильный мутаген. Все манипуляции с ним необходимо выполнять в перчатках.
- Приготовление агарозного геля: агарозу (0,6 г) растворяют в 50 мл 1 х ТАЕ буфера нагреванием в кипящей водяной бане до полного и равномерного расплавления. Раствор охлаждают до 55–60°С и заливают в камеру согласно инструкции к аппарату для горизонтального электрофореза. Для создания стартовых лунок в кювету ставят гребенку с зубцами. Полимеризация агарозы происходит при температуре ниже 42 °С примерно в течение 10–20 мин.
- После застывания агарозы из геля осторожно вынимают гребенку и переносят его в аппарат для проведения электрофореза. В камеру заливают ТАЕ буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 1–2 мм.
- Смешивают 12,5 мкл амплифицированного образца с 2 мкл красителя и вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 120 V в течение примерно 30 мин, помещая начало агарозного геля ближе к катоду.
Учет результатов. 1. Гель вынимают из камеры и переносят его на стекло трансиллюминатора.
- Включают трансиллюминатор и просматривают гель. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся красно-оранжевых полос (рис. 14.4).
- Отрицательный контроль: полосы красно-оранжевого цвета отсутствуют. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов набора специфической ДНК.
- Положительный контроль: в результате ПЦР и электрофореза в геле выявляется красно-оранжевая флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту нужного размера.
Рис. 14.4. Электрофоре-грамма продуктов полимеразной цепной реакции при диагностике возбудителя бактериальной инфекции.
1 –3 – результат положительный; 4, 5 – результат отрицательный; 6 – отрицательный контроль; 7 – положительный контроль.
- Анализируемые пробы: при наличии в пробе анализируемого клинического образца ДНК искомого возбудителя в геле должна наблюдаться красно-оранжевая флюоресцирующая полоса строго на уровне полосы фрагмента ДНК в образце с положительным контролем. В отрицательных образцах полоса, соответствующая по размеру специфическому фрагменту ДНК, долями отсутствовать.
- Полученные результаты желательно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого светофильтра.
В заключение следует отметить, что в настоящее время разработаны и продаются диагностические тест-системы на основе ПЦР для идентификации очень широкого круга возбудителей инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы.