Взятие клинического материала. Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, кровь, слизь и другие биологические выделения. Взятие иссле­дуемого материала производится в стерильные пробирки. Соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала или урет­ры, произведенный с помощью одноразовых стерильных зон­дов, переносится в пробирку с 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия. Взятые пробы клинического материа­ла могут храниться при температуре –16–20°С в морозильной камере или в морозильном отделении двухкамерного холодиль­ника класса *** не более 2 нед.

Обработка клинических проб. Способ выделения ДНК зави­сит как от вида определяемого возбудителя, так и от вида клинического образца. Обычно детально способ выделения ДНК или РНК из образца описывается в инструкции по ис­пользованию набора реагентов, прилагаемых к диагностичес­ким ПЦР-наборам. Рассмотрим типичный способ подготовки клинической пробы к анализу.

  1. Исследуемый материал центрифугируют 10 мин при 12 000 об./мин. Удаляют 600 мкл надосадочной жидкости. Оставшийся материал тщательно размешивают в пробирке на встряхивателе (вортексе). 100 мкл суспензии, содержащей кли­нический материал, переносят в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 300 мкл лизирующего раствора, имеющегося в составе набора реагентов, и 5 мкл суспензии двуокиси кремния. Пробы инкубируют в течение 15 мин при комнатной темпера­туре, периодически перемешивая на вортексе.
  2. Пробы центрифугируют 30с на микроцентрифуге при 12 000 об./мин, супернатант удаляют.
  3. К осадку добавляют 150 мкл раствора для отмывки, также входящего в состав набора, встряхивают его на вортексе и центрифугируют в течение 30 с при 12 000 об./мин. Суперна­тант удаляют.
  4. К осадку добавляют 700 мкл раствора для отмывки, встря­хивают его на вортексе и центрифугируют в течение 30 с при 12 000 об./мин. Супернатант удаляют.
  5. Проводят повторную процедуру отмывки, как на предыду­щем этапе.
  6. Дополнительным центрифугированием с последующим удалением супернатанта убирают остатки раствора 3. Пробы подсушивают 5 мин при температуре 45–55°С, оставляя про­бирки открытыми.
  7. Добавляют 50 мкл деионизированной воды, перемешива­ют на вортексе и инкубируют в течение 5 мин при 45–55°С.
  8. Пробы центрифугируют 30 с, водную фазу отбирают в другую пробирку и используют в качестве исследуемого образ­ца ДНК для постановки реакций амплификации либо хранят при –18–25 °С в течение 2 нед.

Проведение ПЦР

  • Нумеруют пробирки объемом 0,5 мл для проведения амп­лификации и располагают их соответствующим образом в штативе. Приготавливают также пробирки для положитель­ного и отрицательного контролей (промаркировав их "К+", "К-").
  • Определенное количество образца из обработанной клини­ческой пробы, обычно 10 мкл, вносят в пробирку. Затем в эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, со­стоящая из воды, буфера для проведения ПЦР, раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов, раствора праймеров и рас­твора фермента Тая-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Объем реакционной смеси составляет 25 мкл.
  • Для удобства обычно амплификационную смесь готовят для общего количества анализируемых проб и разливают по 15 мкл в каждую пробирку для амплификации.
  • В пробирку, маркированную "К+", вносят 2 мкл контроль­ного образца ДНК и 8 мкл воды, в пробирку, помеченную "К–", вносят 10 мкл деионизированной воды.
  • Во все остальные пробирки вносят по 10 мкл подготовлен­ных проб.
  • Для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе реакции в каждую пробирку вносят по одной капле (15–20 мкл) вазелинового масла.
  • • Пробирки закрывают, центрифугируют 5 с при 3000 об./мин, помещают в программируемый термостат для проведения реакции амплификации по программе, описанной в ин­струкции по использованию набора реагентов, прилагаемых к диагностическим ПЦР-наборам. Программа заключается в периодической циклической смене температур амплифи-кационной смеси, в диапазоне от 94 до 50 °С.

Регистрация результатов осуществляется методом электро­фореза в 1,2 % агарозном геле, приготовленном на однократ­ном трис-ацетатном (1 × ТАЕ) буфере.

  • • Приготовление 1 × ТАЕ буфера: к 20 мл 50-кратного ТАЕ добавляют 980 мл дистиллированной воды и 50 мкл раствора бромистого этидия.

ВНИМАНИЕ! Бромистый этидий – сильный мутаген. Все ма­нипуляции с ним необходимо выполнять в перчатках.

  • Приготовление агарозного геля: агарозу (0,6 г) растворяют в 50 мл 1 х ТАЕ буфера нагреванием в кипящей водяной бане до полного и равномерного расплавления. Раствор охлаждают до 55–60°С и заливают в камеру согласно ин­струкции к аппарату для горизонтального электрофореза. Для создания стартовых лунок в кювету ставят гребенку с зубцами. Полимеризация агарозы происходит при темпера­туре ниже 42 °С примерно в течение 10–20 мин.
  • После застывания агарозы из геля осторожно вынимают гребенку и переносят его в аппарат для проведения электро­фореза. В камеру заливают ТАЕ буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 1–2 мм.
  • Смешивают 12,5 мкл амплифицированного образца с 2 мкл красителя и вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 120 V в течение примерно 30 мин, помещая начало агарозного геля ближе к катоду.

Учет результатов. 1. Гель вынимают из камеры и переносят его на стекло трансиллюминатора.

  1. Включают трансиллюминатор и просматривают гель. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светя­щихся красно-оранжевых полос (рис. 14.4).
  • Отрицательный контроль: полосы красно-оранжевого цве­та отсутствуют. Появление полосы в отрицательном кон­троле свидетельствует о контаминации компонентов на­бора специфической ДНК.
  • Положительный контроль: в результате ПЦР и электро­фореза в геле выявляется красно-оранжевая флюорес­цирующая полоса, соответствующая фрагменту нужного размера.

Рис. 14.4. Электрофоре-грамма продуктов по­лимеразной цепной ре­акции при диагностике возбудителя бактери­альной инфекции.

1 –3 – результат положи­тельный; 4, 5 – результат отрицательный; 6 – отри­цательный контроль; 7 – положительный контроль.

  • Анализируемые пробы: при наличии в пробе анализируе­мого клинического образца ДНК искомого возбудителя в геле должна наблюдаться красно-оранжевая флюорес­цирующая полоса строго на уровне полосы фрагмента ДНК в образце с положительным контролем. В отрица­тельных образцах полоса, соответствующая по размеру специфическому фрагменту ДНК, долями отсутствовать.
  1. Полученные результаты желательно документировать фо­тографированием гелей с использованием оранжевого свето­фильтра.

В заключение следует отметить, что в настоящее время разработаны и продаются диагностические тест-системы на основе ПЦР для идентификации очень широкого круга возбу­дителей инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы.