Ложноположительные и ложноотрицательные результаты ПЦР – серьезная и часто недооцениваемая проблема, являю­щаяся оборотной стороной исключительно высокой чувстви­тельности метода.

Причинами ложноположительных результатов являются следующие три вида контаминации:

  • перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе раскапывания реакционной смеси), приводящая к появле­нию спорадических ложноположительных результатов;
  • контаминация рекомбинантными плазмидами, содержащи­ми клонированные последовательности детектируемого гена и использующимися в качестве положительного контроля;
  • контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположитель­ных результатов, поскольку в процессе ПЦР-генодиагностики ампликоны накапливаются в больших количест­вах и очень легко переносятся с аэрозолями и через при­боры.

Первые две формы контаминации легко устраняются при соблюдении известных мер предосторожности. В целях исклю­чения ложноположительных результатов подготовку исследуе­мого материала, проведение ПЦР и анализ результатов ампли­фикации необходимо проводить в отдельных помещениях. Ре­акционная смесь ПЦР должна храниться в стерильной посуде при –20 °С. Для работы используются только стерильные од­норазовые пробирки и наконечники для пипеток. Необходимо проводить регулярную обработку рабочих мест ультрафиолето­выми лучами и 0,3% раствором HCl.

На каждом этапе работы (выделение ДНК, проведение амп­лификации, электрофоретический анализ полученных резуль­татов) необходимо использовать собственные лабораторные контроли и периодически применять зашифрованные отрица­тельные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР-генодиагностических исследований. При каждой постановке ПЦР рекомендуется применять отрицательные контроли: на процедуру экстракции, буферный раствор, праймеры (пробирки, не содержащие ДНК-матрицы) ("Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", ГКСЭН РФ, утверждены 22 июня 1995 г.).

Наиболее серьезную проблему для преодоления представля­ет контаминация ампликоном. В настоящее время существует несколько методов инактивации продуктов ПЦР. Различают предамплификационную и послеамплификационную инакти­вацию. Метод инактивации продуктов ПЦР предамплифика-ционным облучением основан на известной способности ко­ротких волн УФ-света вызывать образование димеров тимиди-на и другие ковалентные модификации в молекулах ДНК. Основными преимуществами метода являются простота вы­полнения и отсутствие затрат. Эффективность инактивации ультрафиолетовым облучением находится в зависимости от длины и нуклеотидного состава ДНК-мишени. Установлено, что короткие ампликоны (менее 300 пар оснований) инактивируются не полностью.

К послеамплификационной инактивации ампликонов отно­сятся фотохимические и химические методы. С целью прове­дения фотохимической инактивации в реакционную ПЦР-смесь до начала амплификации вносят фурокумарины (псора-лен или изопсорален), устойчивые к температурным условиям ПЦР. После завершения амплификации перед детекцией про­дуктов ПЦР фотохимический реагент активируют облучением длинными волнами (300–400 нм) ультрафиолетового света. Возбужденные ультрафиолетовыми лучами фурокумарины ко -валентно связываются с нуклеиновыми кислотами, интерка-лируя между ними. Образующиеся фурокумарин-пиримиди-новые комплексы блокируют удлинение праймеров Тaq-полимеразой.

Одним из вариантов химической инактивации продуктов ПЦР является гидролиз праймеров. В этом случае используют праймеры, содержащие на конце 3' одно рибозное звено или более. В результате образуются ампликоны, содержащие фос-фатилированную рибозу, чувствительную к щелочному гидро­лизу. При добавлении NaОН к продукту ПЦР происходит удаление рибозных остатков праймеров из ампликонов. Моди­фицированные таким образом ампликоны не могут служить эффективными мишенями при проведении последующих амп­лификации.

Другой вариант химической инактивации продуктов ПЦР основан на способности гидроксиламина вызывать ковалент­ные модификации ДНК. Гидроксиламин избирательно реаги­рует с атомами кислорода в остатках цитозина, образуя кова­лентные связи, что предохраняет от формирования пар с ос­татками гуанидина. Тем самым происходит модификация сай­тов праймеров на последовательности мишени. Показано, что данный метод особенно эффективен для инактивации корот­ких ампликонов с высоким содержанием GС-пар.

Метод энзиматической инактивации продуктов ПЦР осно­ван на функции фермента урацил-N-глюкозидазы удалять ос­татки урацила, образуя спонтанную деаминацию цитозина в двунитевой ДНК. При проведении амплификации один из дезоксинуклеотидтрифосфатов дТТФ заменяется дУТФ, который также служит субстратом для Тaq-полимеразы. В резуль­тате происходит накопление ампликонов, содержащих остатки дезоксиурацила. Урацил-N-глюкозидаза, вносимая в реакцион­ную смесь до амплификации, удаляет остатки урацила в ампликонах-контаминантах. Происходит образование сайтов, вы­сокочувствительных к щелочному гидролизу при повышенных температурах. В связи с тем, что ПЦР обычно проводят в условиях слабощелочных рН и высоких температур, продукты амплификации, обработанные урацил-N-глюкозидазой, разру­шаются. Подобно фотохимической инактивации эффектив­ность энзиматической инактивации зависит от длины ампли-кона и содержания GС-пар. Установлено, что для коротких ампликонов с высоким содержанием GС-пар метод энзимати­ческой инактивации эффективнее, чем ультрафиолетовое об­лучение или фотохимическая обработка.

Быстрая экстракция ДНК или РНК из различных материалов, анализирующихся методом ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроба и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения микробной стенки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу К. Для экстракции ДНК используют различные модификации двух основных методов. Первый представляет собой классическую процедуру фенольно-хлоро-формной экстракции, при которой достигается хорошая очист­ка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Тая-полимеразы, но при этом неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией идентифицируемого агента. Второй способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, ос­нован на использовании нуклеосорбентов. Подготовка мате­риала с применением нуклеосорбента занимает меньше време­ни и более проста в исполнении, хотя не всегда может гаран­тировать удаление возможных ингибиторов.

Практическое применение ПЦР для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. Для организации ПЦР-лаборатории необходимо три (минимум два) несмежных помещения общей площадью не менее 25–30 м2. Персонал лаборатории комплек­туется двумя врачами-лаборантами, имеющими опыт проведе­ния биохимических, микробиологических и иммунобиологи­ческих исследований, и лаборантом со средним медицинским образованием. Из-за высокой чувствительности реакции не­обходимо территориально разделить различные стадии прове­дения анализа, проводя их в отдельных помещениях:

  • помещение для пробоподготовки, где производится обра­ботка клинических образцов и выделение ДНК;
  • помещение для постановки реакции амплификации, где готовится реакционная смесь и непосредственно проводится реакция;
  • • помещение для анализа результатов, где проводится детек­ция продуктов амплификации.

Работа должна производиться в лабораторной одежде, сме­няемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках, так как анализируемые биопробы яв­ляются потенциально инфицированным материалом. Обработ­ка одежды из разных помещений должна производиться раздельно. Желательно, чтобы на разных этапах проведения ПЦР-анализа работали различные сотрудники.

Следует использовать отдельные наборы полуавтоматичес­ких пипеток, предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое.

Все этапы работы необходимо проводить только с исполь­зованием одноразовых расходных материалов: наконечников для микропипеток, пробирок, перчаток и т.д. Обязательно ме­нять наконечники при переходе от пробы к пробе, желательно использовать наконечники с фильтром – аэрозольным барье­ром для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в специальные контейнеры или емкости, содер­жащие дезинфицирующий раствор (1N соляная кислота, 10 % гипохлорит натрия или 10 % хлорная известь).

Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов.

Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с длиной волны (л) 260 нм. Облуче­ние необходимо проводить в течение 1 ч после окончания работы.