После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание, или, как принято говорить, найти титр фага.

Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: количеством активных частиц бактерио­фага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или вели­чиной наибольшего разведения, при котором бактериофаг про­являет свое литическое действие. Полученную при этом вели­чину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага.

Для титрования бактериофага предложены различные мето­ды, однако наибольшее распространение получили способ тит­рования фага в жидкой питательной среде, предложенный Ап-пельманом, и метод агаровых слоев Грациа.

Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по ме­тоду Аппельмана основано на внесении различного количества титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.

Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл 15 % мясопептонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага, содер­жимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносят во 2-ю, из 2-й – в 3-ю и т.д. до 10-й включительно. Из 10-й пробирки лишние 0,5 мл выливают; 11-я и 12-я пробирки – контрольные. Жидкость переносят из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получают разведение бактериофага от 10-1 до 10-10.

Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вно­сят по 1 капле (0,03 мл) взвеси смыва суточной агаровой или бульонной культуры, содержащей 109 микробных клеток в 1 мл по ОСО 42-28-85-01ОП (10 ед.) бактерий, одноименных тит­руемому фагу. Прибавляемая культура не должна содержать устойчивых к фагу клеток. Пробирка 11-я – контроль культу­ры, содержит 5 мл бульона и 1 каплю (0,03 мл) культуры микробов. Пробирка 12-я – контроль на стерильность, содер­жит 5 мл бульона без добавления бактерий и фага. Штатив с пробирками помещают в термостат при 37 °С на 18–20 ч.

Результаты учитывают через 18–20 ч после инкубации в термостате при 37°С. Титром считают то максимальное разве­дение бактериофага, при котором наблюдают полный лизис чувствительной к нему культуры. Практически это соответст­вует той последней пробирке в ряду, в которой бульон еще остается совершенно прозрачным.

Титрование бактериофага на плотной питательной среде по методу агаровых слоев Грациа основано на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую куль­туру бактерий и посеве смеси на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.

Накануне постановки опыта готовят питательные среды. В чашки Петри разливают 25–30 мл 1,5 % мясопептонного агара. Для подавления воздушной микрофлоры к расплавлен­ному питательному агару перед разливкой прибавляют 0,004 % спиртовой раствор генцианового фиолетового из расчета 0,1 мл краски на каждые 100 мл мясопептонного агара. Чашки со средой покрывают стерильной фильтровальной бумагой и под­сушивают 30 мин в термостате или 2–3 ч при комнатной температуре, после чего закрывают крышкой и оставляют на ночь в комнате.

Подготовленная среда должна быть совершенно сухой, так как даже незначительное увлажнение может изменить коли­чественные показатели содержания частиц фага в исследуемой жидкости.

Мясопептонный 0,7 % агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл и простерилизованный в них, может быть приготовлен за не­сколько дней до постановки опыта.

В день постановки опыта из жидкости, содержащей титруемый фаг, готовят в пробирках ряд последовательных разведе­ний (так же, как при титровании фага на жидких средах по методу Аппельмана). Для разведений фага можно пользовать­ся стерильным бульоном или изотоническим раствором хлори­да натрия.

Затем в пробирки с 0,7 % мясопептонным агаром, расплав­ленным в водяной бане и остуженным до 44 – 46°С, приливают по 1 мл разведений титруемого фага. Одновременно с фагом в каждую пробирку вносят по 0,1 мл одноименной чувствитель­ной к фагу культуры. Содержимое пробирок перемешивают, быстро вращая пробирки между ладонями, и выливают вторым слоем в чашки с 1,5 % агаром. После остывания среды чашки с посевом инкубируют при 37°С в течение 18–20 ч.

При титровании методом агаровых слоев следует засевать не менее двух чашек фагом одного и того же разведения. Титр фага определяют путем подсчета количества негативных коло­ний на параллельных чашках и умножением среднего арифме­тического на показатель разведения. Например, при посеве 1 мл фага в разведении 10-5 на одной чашке выявлено 128 негатив­ных колоний, на второй – 146. Титр фага равен 1,37 × 107.