После выявления бактериофага в исследуемом материале необходимо определить его количественное содержание, или, как принято говорить, найти титр фага.
Для выражения титра бактериофага можно пользоваться двумя показателями: количеством активных частиц бактериофага, содержащихся в 1 мл исследуемого материала, или величиной наибольшего разведения, при котором бактериофаг проявляет свое литическое действие. Полученную при этом величину выражают отрицательным логарифмом 10, где степень указывает разведение фага.
Для титрования бактериофага предложены различные методы, однако наибольшее распространение получили способ титрования фага в жидкой питательной среде, предложенный Ап-пельманом, и метод агаровых слоев Грациа.
Титрование бактериофага в жидкой питательной среде по методу Аппельмана основано на внесении различного количества титруемого бактериофага в бульон, засеянный одной и той же дозой культуры гомологичных микробов, с целью получения феномена бактериофагии.
Двенадцать пробирок, содержащих по 4,5 мл 15 % мясопептонного бульона, ставят в штатив в один ряд. В 1-ю пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 мл исследуемого фага, содержимое пробирки перемешивают и 0,5 мл жидкости из 1-й пробирки переносят во 2-ю, из 2-й – в 3-ю и т.д. до 10-й включительно. Из 10-й пробирки лишние 0,5 мл выливают; 11-я и 12-я пробирки – контрольные. Жидкость переносят из одной пробирки в другую каждый раз отдельной стерильной пипеткой емкостью 1 мл. Таким образом, в 10 пробирках получают разведение бактериофага от 10-1 до 10-10.
Во все 10 пробирок приготовленного ряда разведений вносят по 1 капле (0,03 мл) взвеси смыва суточной агаровой или бульонной культуры, содержащей 109 микробных клеток в 1 мл по ОСО 42-28-85-01ОП (10 ед.) бактерий, одноименных титруемому фагу. Прибавляемая культура не должна содержать устойчивых к фагу клеток. Пробирка 11-я – контроль культуры, содержит 5 мл бульона и 1 каплю (0,03 мл) культуры микробов. Пробирка 12-я – контроль на стерильность, содержит 5 мл бульона без добавления бактерий и фага. Штатив с пробирками помещают в термостат при 37 °С на 18–20 ч.
Результаты учитывают через 18–20 ч после инкубации в термостате при 37°С. Титром считают то максимальное разведение бактериофага, при котором наблюдают полный лизис чувствительной к нему культуры. Практически это соответствует той последней пробирке в ряду, в которой бульон еще остается совершенно прозрачным.
Титрование бактериофага на плотной питательной среде по методу агаровых слоев Грациа основано на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве смеси на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага.
Накануне постановки опыта готовят питательные среды. В чашки Петри разливают 25–30 мл 1,5 % мясопептонного агара. Для подавления воздушной микрофлоры к расплавленному питательному агару перед разливкой прибавляют 0,004 % спиртовой раствор генцианового фиолетового из расчета 0,1 мл краски на каждые 100 мл мясопептонного агара. Чашки со средой покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают 30 мин в термостате или 2–3 ч при комнатной температуре, после чего закрывают крышкой и оставляют на ночь в комнате.
Подготовленная среда должна быть совершенно сухой, так как даже незначительное увлажнение может изменить количественные показатели содержания частиц фага в исследуемой жидкости.
Мясопептонный 0,7 % агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл и простерилизованный в них, может быть приготовлен за несколько дней до постановки опыта.
В день постановки опыта из жидкости, содержащей титруемый фаг, готовят в пробирках ряд последовательных разведений (так же, как при титровании фага на жидких средах по методу Аппельмана). Для разведений фага можно пользоваться стерильным бульоном или изотоническим раствором хлорида натрия.
Затем в пробирки с 0,7 % мясопептонным агаром, расплавленным в водяной бане и остуженным до 44 – 46°С, приливают по 1 мл разведений титруемого фага. Одновременно с фагом в каждую пробирку вносят по 0,1 мл одноименной чувствительной к фагу культуры. Содержимое пробирок перемешивают, быстро вращая пробирки между ладонями, и выливают вторым слоем в чашки с 1,5 % агаром. После остывания среды чашки с посевом инкубируют при 37°С в течение 18–20 ч.
При титровании методом агаровых слоев следует засевать не менее двух чашек фагом одного и того же разведения. Титр фага определяют путем подсчета количества негативных колоний на параллельных чашках и умножением среднего арифметического на показатель разведения. Например, при посеве 1 мл фага в разведении 10-5 на одной чашке выявлено 128 негативных колоний, на второй – 146. Титр фага равен 1,37 × 107.