Обнаружение бактериофага в жидкой питательной среде. Два сосуда (пробирки или колбы) с питательными средами засевают одной и той же культурой микроба, гомологичного искомому фагу. Одновременно с посевом или после 3–4-часового инкубирования в термостате в один из сосудов (опытный) вносят фильтрат исследуемого материала. Второй сосуд, содержащий питательную среду, засеянную культурой микробов, является контролем. Оба сосуда ставят в термостат при 37°С и через 24 ч учитывают результаты.
При учете результатов возможны следующие варианты:
- содержимое опытного сосуда прозрачно, в контроле – помутнение питательной среды. Полученные данные указывают на содержание в исследуемом фильтрате бактериофага высокой активности;
- в опытном сосуде имеется менее выраженное по сравнению с контролем помутнение среды, что свидетельствует о содержании в исследуемом материале бактериофага средней активности;
- при одинаковом помутнении в обоих сосудах для окончательного заключения об отсутствии бактериофага необходимо дополнительное исследование: высев на плотную питательную среду содержимого опытной и контрольной пробирок. Высев делают на среду в чашки Петри шпателем, чтобы получить сплошной рост микробов. Чашки ставят в термостат и после 24 ч инкубирования при 37 °С учитывают результаты. Посев из контрольного сосуда дает сплошной рост микробов. При наличии фага в исследуемом материале на фоне сплошного роста микробов появляются стерильные пятна – колонии бактериофага.
Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах по методу Отто. Мясопептонный 1,5 % агар разливают в чашки Петри (более высокая концентрация агара угнетает развитие негативных колоний бактериофага). Чашки с агаром, хорошо подсушенные, засевают 3–6-часовой бульонной культурой или смывом с суточной агаровой культуры бактерий, гомологичных искомому фагу. Для получения сплошного роста 2–3 капли культуры, нанесенные в центре чашки, растирают шпателем равномерно по всей ее площади или аккуратно распределяют бульонную культуру (около 2 мл) по поверхности чашки, избыток удаляют пипеткой. Затем 30 – 40 мин подсушивают при 37°С, накрыв стерильным бумажным фильтром. На подсушенную поверхность посева наносят каплями исследуемый фильтрат. На одной чашке можно поставить несколько проб. Для этого по дну чашки намечают разделение питательной среды на секторы и в каждый сектор вносят по калле фильтрата. После того как жидкость впитается в среду, чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат при 37 °С на 18–24 ч.
Учет результатов доказательством наличия бактериофага служит отсутствие роста культуры в месте попадания капли фильтрата (активный бактериофаг) или появление в этом участке мелких стерильных пятен – колоний бактериофага (бактериофаг слабой активности).
Обнаружение бактериофага на плотных питательных средах двухслойным методом Грациа. Мясопептонный 1,5 % агар разливают в чашки Петри в количестве 25–30 мл (первый слой). После застудневания среды чашки ставят на 1,5–2 ч для подсыхания. В пробирку с 2,5 мл 0,7% расплавленного и остуженного до температуры 45 °С агара вносят 1 мл исследуемого фильтрата и 0,1 мл густого смыва суточной агаровой культуры, соответствующей искомому фагу. Содержимое пробирок быстро перемешивают, чтобы не произошло застудневания агара, и выливают в ту же чашку вторым слоем. После застудневания агара посев ставят в термостат при 37°С. Учет результатов, как правило, возможен через 18–20 ч инкубации в термостате. Присутствие бактериофага определяют по наличию прозрачных пятен, хорошо видимых на матовом фоне глубинного роста бактерий.