Контроль качества исследований антибиотикорезистентности основан на параллельной оценке клинических и контрольных (референсных) штаммов. Референсные штаммы характеризуются генетической стабильностью по основным показателям, в том числе и по уровню чувствительности к антибиотикам. Величины МПК препаратов и диаметры зон ингибиции роста вокруг дисков с соответствующими антибиотиками для контрольных штаммов находятся в достаточно жестких пределах.
Если при оценке чувствительности контрольного штамма величина МПК или диаметр зоны ингибиции роста выходит за пределы значений, представленных в табл. 10.4 и 10.5, то это свидетельствует либо о наличии методических ошибок на каком-то этапе постановки исследования, либо о недостаточном качестве используемых питательных сред и реактивов. Результаты исследования чувствительности клинических штаммов в этом случае следует считать недостоверными. Необходимо тщательно проанализировать все этапы проведения исследования и проверить качество питательных сред и реактивов.
Таблица 10.4. Значения величин МПК (мкг/мл) для референсных штаммов микроорганизмов с обычными питательными потребностями
Антибиотик |
S.aureus АТСС 29213 |
E.faecalis АТСС 29212 |
Е.соli АТСС 25922 |
Р.аеruginosa АТСС 27853 |
Бензилпенициллин |
0,25-1 |
1-4 |
– |
– |
Ампициллин |
0,25-1 |
0,5-2 |
2-8 |
– |
Ампициллин/сульбактам |
_ |
2/1-8/4 |
_ |
|
Оксациллин |
0,12-0,5 |
8-32 |
– |
– |
Карбенициллин |
2-8 |
16-64 |
4. 16 |
16-64 |
Тикарциллин |
2-8 |
16-64 |
2-8 |
8-32 |
Тикарциллин/кла-вуланат |
0,5/2-2/2 |
16/2-64/2 |
2/2-8/2 |
8/2-32/2 |
Азлоциллин |
2-8 |
1-4 |
8-32 |
2-8 |
Мезлоциллин |
1-4 |
1-4 |
2-8 |
8-32 |
Пиперациллин |
1-4 |
1-4 |
1-4 |
1-4 |
Пиперациллин/та-зобактам |
0,25/4-2/4 |
1/4–4/4 |
1/4-4/4 |
1/4-8/4 |
Цефазолин |
0,25-1 |
– |
1-4 |
– |
Цефалотин |
0,12-0,5 |
– |
4-16 |
– |
Цефаклор |
1-4 |
– |
1-4 |
– |
Цефамандол |
0,25-1 |
– |
0,25-1 |
– |
Цефуроксим |
0,5-2 |
– |
2-8 |
|
Цефокситин |
1-4 |
– |
1–4 |
– |
Цефотетан |
4-16 |
– |
0,06-0,25 |
– |
Цефиксим |
8-32 |
– |
0,25-1 |
– |
Цефподоксим |
1-8 |
– |
0,25-1 |
– |
Цефтибутен |
– |
– |
0,12-0,5 |
– |
Цефоперазон |
1-4 |
– |
0,12-0,5 |
2–8 |
Цефотаксим |
1-4 |
– |
0,03-0,12 |
8-32 |
Цефтазидим |
4–16 |
– |
0,06-0,5 |
1-4 |
Цефтриаксон |
1-8 |
– |
0,03-0,12 |
8-32 |
Цефепим |
1-4 |
– |
0,015-0,06 |
1-4 |
Азтреонам |
– |
– |
0,06-0,25 |
2-8 |
Имипенем |
0,015–0,06 |
0,5-2 |
0,06-0,25 |
1-4 |
Меропенем |
0,03-0,125 |
2-8 |
0,008-0,06 |
0,25-1 |
Налидиксовая кислота |
– |
– |
1-4 |
– |
Циноксацин |
– |
– |
2-8 |
– |
Эноксацин |
0,5-2 |
2-16 |
0,06-0,25 |
2-8 |
Норфлоксацин |
0,5-2 |
2-8 |
0,03-0,12 |
1-4 |
Ципрофлоксацин |
0,12-0,25 |
0,25-2 |
0,004-0,015 |
0,25-1 |
Офлоксацин |
0,12-1 |
1-4 |
0,015-0,12 |
1-8 |
Ломефлоксацин |
0,25-2 |
2-8 |
0,03-0,12 |
1-4 |
Амикацин |
1-4 |
64-256 |
0,5-4 |
1-4 |
Гентамицин |
0,12-1 |
4-16 |
0,25-1 |
0,5-2 |
Нетилмицин |
<0,25 |
4-16 |
<0,5–1 |
0,5-8 |
Тобрамицин |
0,12-1 |
8-32 |
0,25-1 |
0,25-1 |
Канамицин |
1-4 |
16-64 |
1-4 |
– |
Эритромицин |
0,12-0,5 |
1-4 |
– |
– |
Азитромицин |
0,5-2 |
– |
– |
– |
Кларитромицин |
0,12-0,5 |
– |
– |
– |
Клиндамицин |
0,06-0,25 |
4-16 |
– |
– |
Хлорамфеникол |
2-8 |
4-16 |
2-8 |
– |
Тетрациклин |
0,25-1 |
8-32 |
0,5-2 |
8-32 |
Рифампин |
0,004-0,015 |
0,5-4 |
4-16 |
16-64 |
Нитрофурантоин |
8-32 |
4-16 |
4-16 |
– |
Ко-тримоксазол (1/19) |
<0,5/9,5 |
<0,5/9,5 |
<0,5/9,5 |
8/152– 32/608 |
Ванкомицин |
0,5-2 |
1-4 |
– |
– |
Примечание. Данные приведены для методов серийных микроразведений в бульоне.
Таблица 10.5. Значения величин диаметров зон ингибиции роста (мм) для референсных штаммов микроорганизмов с обычными питательными потребностями
Антибиотик |
Содержание в диске, мкг |
E.coli АТСС 25922 |
S.aureus АТСС 25923 |
P.aeruginosa АТСС 27853 |
Бензилпенициллин |
6 (10ЕД) |
– |
26-37 |
– |
Ампициллин |
10 |
16-22 |
27-35 |
– |
Ампициллин/суль-бактам |
10/10 |
20-24 |
29-37 |
– |
Оксациллин |
1 |
– |
18-24 |
– |
Карбенициллин |
100 |
23-29 |
– |
18-24 |
Тикарциллин |
75 |
24-30 |
– |
22-28 |
Тикарциллин/кла-вуланат |
75/10 |
25-29 |
29-37 |
20-28 |
Азлоциллин |
75 |
– |
– |
24-30 |
Мезлоциллин |
75 |
23-29 |
– |
19-25 |
Пиперациллин |
100 |
24-30 |
– |
25-33 |
Пиперациллин/ тазобактам |
100/10 |
24-30 |
27-36 |
25-33 |
Цефазолин |
30 |
23-29 |
29-35 |
– |
Цефалотин |
30 |
15-21 |
29-37 |
– |
Цефаклор |
30 |
23-27 |
27-31 |
– |
Цсфамандол |
30 |
26-32 |
26-34 |
– |
Цефуроксим |
30 |
20-26 |
27-35 |
– |
Цефокситин |
30 |
23-29 |
23-29 |
– |
Цефотетан |
30 |
28-34 |
17-23 |
– |
Цефиксим |
5 |
23-27 |
– |
– |
Цефподоксим |
10 |
23-28 |
19-25 |
– |
Цефтибутен |
30 |
27-35 |
– |
– |
Цефоперазон |
75 |
28-34 |
24-33 |
23-29 |
Цефотаксим |
30 |
29-35 |
25-31 |
– |
Цефтазидим |
30 |
25-32 |
16-20 |
22-29 |
Цефтриаксон |
30 |
29-35 |
22-28 |
17-23 |
Цефепим |
30 |
29-35 |
23-29 |
24-30 |
Азтреонам |
30 |
28-36 |
– |
23-29 |
Имипенем |
10 |
26-32 |
– |
20-28 |
Меропенем |
10 |
28-34 |
29-37 |
27-33 |
Налидиксовая кислота |
30 |
22-28 |
– |
– |
Циноксацин |
100 |
26-32 |
– |
– |
Эноксацин |
10 |
28-36 |
22-28 |
22-28 |
Норфлоксацин |
10 |
28-35 |
17-28 |
22-29 |
Ципрофлоксацин |
5 |
30-40 |
22-30 |
25-33 |
Офлоксацин |
5 |
29-33 |
24-28 |
17-21 |
Ломефлоксацин |
10 |
27-33 |
23-29 |
22-28 |
Амикацин |
30 |
19-26 |
20-26 |
18-26 |
Гентамицин |
10 |
19-26 |
19-27 |
16-21 |
Нетилмицин |
30 |
22-30 |
22-31 |
17-23 |
Тобрамицин |
10 |
18-26 |
19-29 |
19-25 |
Канамицин |
30 |
17-25 |
19-26 |
– |
Эритромицин |
15 |
– |
22-30 |
– |
Азитромицин |
15 |
– |
21-26 |
– |
Кларитромицин |
15 |
– |
26-32 |
– |
Клиндамицин |
2 |
– |
24-30 |
– |
Хлорамфеникол |
30 |
21-27 |
19-26 |
– |
Тетрациклин |
30 |
18-25 |
24-30 |
– |
Доксициклин |
30 |
18-24 |
23-29 |
– |
Рифампин |
5 |
8-10 |
26-34 |
|
Нитрофурантоин |
300 |
20-25 |
18-22 |
– |
Ко-тримоксазол (1/19) |
1,25/ 23,75 |
24-32 |
24-32 |
|
Ванкомицин |
30 |
– |
17-21 |
– |
Выбор референсных штаммов для проведения контрольных исследований определяется видом исследуемого микроорганизма. При контроле качества оценки антибиотикочувствительности отдельных групп микроорганизмов необходимо использовать следующие контрольные штаммы:
- Staphylococcus spp.– S.aureus АТСС 29213 – для методов серийных разведений и АТСС 25923 – для диско-диффузионного (рис. 10.5 – см. вклейку).
- Enterococcus spp. – E.faecalis АТСС 29212 – для метода серийных разведений и скрининга на высокий уровень резистентности к аминогликозидам; S.aureus АТСС 25923 – для диско-диффузионного.
- Enterobacteriaceae – E.coli АТСС 25922.
- Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. и другие неферментирую-щие – P.aeruginosa АТСС 27853 (рис. 10.6 – см. вклейку).
Исследования по контролю качества оценки антибиотикочувствительности рекомендуется проводить не реже 1 раза в неделю.
Методы контроля качества питательных сред. Качество питательной среды является одним из критических параметров для проведения корректной оценки антибиотикорезистентности. Важнейшими показателями качества питательной среды являются концентрации двухвалентных катионов Са2+ и Mg2+, влияющих на активность аминогликозидных антибиотиков и тетрациклинов, а также тимина и тимидина, являющихся антагонистами сульфаниламидных препаратов и триметоприма.
В международной практике основной средой, используемой во всех методах оценки антибиотикорезистентности, является среда Mueller–Hinton и др. (рецепты 85, 86)). Рассматриваемые в последующих разделах критерии величины МПК, позволяющие отнести исследуемые микроорганизмы к одной из категорий: "чувствительные", "устойчивые" или "промежуточные", – разработаны именно для среды Mueller–Hinton.
Следует признать возможность использования для оценки антибиотикорезистентности и других сред, например АГВ, в том случае если они удовлетворяют описанным ниже требованиям.
Перед использованием в экспериментах по оценке антибиотикорезистентности каждая новая партия среды (Mueller–Hinton или какой-либо другой) должна пройти контроль качества в соответствии с описанным ниже методом.
Определение pH среды проводят после автоклавирования, внесения всех необходимых добавок и охлаждения до комнатной температуры (25 °С); приемлемый диапазон 7,2–7,4. При величине pH среды, выходящей за указанные пределы, возможны существенные изменения в величине МПК.
Контроль катионного состава. Для получения воспроизводимых результатов оценки антибиотикорезистентности питательная среда должна содержать Са2+ 20–25 мг/л и Mg2+ 10–12,5мг/л. Применение метода атомной абсорбционной спектрофотометрии для непосредственной оценки концентрации двухвалентных катионов в среде в повседневной практике малореально.
Наиболее доступным интегральным методом оценки качества сред (как жидких, так и агаризованных) является сопоставление экспериментально полученной величины МПК ре-ференсных штаммов микроорганизмов с этим показателем, приведенным в их паспортной характеристике.
Наиболее подходящим штаммом для оценки качества жидких и плотных питательных сред, предназначенных для изучения антибиотикорезистентности, является штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если величина МПК гентамицина находится в пределах 0,5–2,0 мкг/мл. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов.
Для контроля на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis АТСС 29212. При величине МПК триметоприма/сульфаметоксазола <0,5/9,5мкг/мл среду следует признать удовлетворительной по качеству.
Определение величины МПК антибиотиков (или диаметров зон ингибиции роста) в отношении референсных штаммов в целях контроля качества среды проводят в. соответствии с описанными выше методами.