Изготовление необходимых для постановки диско-диффу­зионного метода дисков в лабораторных условиях нецелесооб­разно. Это связано с жесткими требованиями к исходным материалам (субстанциям антибиотиков, картону) и со значи­тельной трудоемкостью методов контроля качества дисков.

Постановка диско-диффузионного метода оценки антибио­тикорезистентности включает следующие этапы:

  • приготовление питательных сред;
  • приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;
  • наложение дисков и инкубация;
  • учет результатов.

Для получения правильных результатов при постановке дис­ко-диффузионного метода необходимо жестко соблюдать пра­вила хранения и использования коммерческих дисков, в про­тивном случае содержание в них антибиотиков может снизить­ся ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлаж­нения) еще до истечения срока годности. Оптимальными ус­ловиями (особенно при длительном хранении) является замо­раживание при –20°С. Для регулярного использования целе­сообразно вскрывать не более одного флакона (картриджа) с дисками каждого вида АБП.

Диски должны храниться при температуре 4–8°С, плотно укупоренными, чтобы исключить попадание во флакон влаги. Для дополнительной гарантии во флаконах коммерческих дис­ков содержится влагоуловитель (силикагель). Флаконы с дис­ками целесообразно извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать закрытыми при комнатной температуре (это обеспечивает выравнивание температуры дисков и окру­жающей среды и соответственно предотвращает образование конденсата влаги после открывания флаконов).

Приготовление чашек с питательной средой. Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой (рецепты 84, 85) имеет некоторые особенности. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавлива­ют на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 3,0–4,0 мм, что достигается при внесении 20 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм или 60–79 мл в чашку диаметром 150 мм. Соблюдение указанных предосторожностей необходимо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномер­ности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной темпе­ратуре для застывания. При использовании свежеприготовленных чашек перед инокуляцией их необходимо подсушить, что достигается инкубацией при 37 °С с приоткрытой крышкой в течение 10–20 мин.

Хранить чашки можно запаянными в полиэтиленовые па­кеты при 4–8°С в течение 7–10 сут. При использовании чашек после хранения в холодильнике их также необходимо подсушить в течение 10–20 мин при 37 °С с приоткрытой крышкой.

Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсут­ствие конденсата жидкости на внутренней поверхности кры­шек.

Приготовление суспензии и инокуляция. Для приготовления инокулята используют 18–20-часовую агаровую (рецепты 87– 89, 93) или 5–6-часовую бульонную культуру (рецепты 90; 92) исследуемого микроорганизма. Суспензию или бульонную культуру доводят до мутности стандарта 0,5 МсFarland раз­водят еще в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (конечная концентрация 1–2 х 107 КОЕ/мл).

Приготовленный таким образом инокулят наносят в коли­честве 1–2 мл на поверхности чашки Петри с питательной средой, равномерно распределяют по поверхности покачива­нием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10–15 мин.

Однако более практичным способом инокуляции является использование коммерческих стерильных ватных тампонов. Тампон необходимо погрузить в суспензию микроорганизма, избыток влаги удаляют, отжимая тампон о стенку пробирки. Инокуляцию на поверхность агаровой среды проводят штри­ховыми движениями, периодически поворачивая чашку Петри на 60°.

Наложение дисков и инкубация. Не позднее чем через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками.

Диски наносят с помощью автоматического диспенсора или стерильным пинцетом. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15–20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверх­ностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Чашки непосредственно после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют 18–20 ч при 37°С кверху дном. Увеличение интервала между нанесением дисков на поверх­ность среды и началом инкубации (а соответственно и проли­ферации микроорганизма) приводит к "преддиффузии" анти­биотика и увеличению диаметра зоны ингибиции роста.

Учет результатов. После окончания инкубации чашки поме­щают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диа­метра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, предпо­чтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимание на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции рос­та, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции. В этом случае необходимы повторная идентификация и исследование на антибиотикорезистентность.

При оценке антибиотикорезистентности роящихся штаммов протея зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая не мешает установлению грани­цы зоны.

При оценке резистентности к сульфаниламидам и их ком­бинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80 %. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1–2 циклов размно­жения микроорганизма.

В отличие от описанного выше метода учета результатов, при оценке антибиотикорезистентности стафилококков в от­ношении оксациллина необходимо учитывать и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста.