Наличие многих методов оценки антибиотикочувствитель­ности (в том числе и коммерческих вариантов) неизбежно поднимает вопрос о выборе наиболее адекватного из них для повседневного использования в практической лаборатории. Оценивая Пригодность того или иного метода для практичес­ких целей, прежде всего необходимо выяснить возможность интерпретации получаемых с его помощью результатов. Эта проблема особенно актуальна для коммерческих методов. В ин­струкции на тест-системы или отдельные виды расходных ма­териалов, предоставляемой изготовителем, должно быть четко указано, что получаемые при их использовании результаты можно интерпретировать в соответствии с критериями, приве­денными в национальных рекомендациях. В Российской Фе­дерации критерии чувствительности микроорганизмов к АБП регламентированы приказом Министерства здравоохранения.

  • В настоящей главе будут рассматриваться методы оценки антибиотикочувствительности только наиболее распростра­ненных из клинически значимых микроорганизмов, не нуждаю­щихся для культивирования в питательных добавках.

10.6.1. Методы серийных разведений

Несмотря на то, что методы серийных разведений являются наиболее информативными при оценке антибиотикочувстви­тельности, их использование в рутинной практике большинст­ва лабораторий представляется малореальным в силу значи­тельной трудоемкости. Постановка методов серийных разведе­ний для оценки антибиотикорезистентности включает следую­щие этапы:

  • приготовление растворов АБП;
  • приготовление питательных сред с растворами АБП;
  • приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и  инокуляция;
  • инкубация;
  • учет результатов;
  • интерпретация.

Методика приготовления растворов АБП одинакова для всех вариантов метода серийных разведений. Различают основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие – те, которые необходимо использовать ex tempore для приготов­ления питательных сред.

Для приготовления основных растворов антибиотиков пред­почтительно использовать субстанции препаратов с известной активностью. Допускается использование готовых инъекцион­ных лекарственных форм препаратов. Оральные лекарственные формы непригодны. Однако субстанции АБП для практичес­ких лабораторий малодоступны. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их актив­ности.

Для приготовления навесок антибиотиков необходимо ис­пользовать аналитические весы или другие весы равного класса точности. Основные растворы антибиотиков готовят в кон­центрации 1000,0 мкг/мл и выше, их необходимо хранить в условиях глубокого замораживания при –70 °С.

После извлечения из холодильника перед открыванием фла­конов с основными растворами их необходимо довести до комнатной температуры для предотвращения конденсации влаги.

Размороженные основные растворы должны быть исполь­зованы для приготовления рабочих растворов, повторное замо­раживание не допускается.

Из основных растворов готовят рабочие двукратные разве­дения антибиотиков. За основу берется конечная концентра­ция АБП в питательной среде, равная 1,0 мкг/мл (более высо­кие – 2; 4; 8 и т.д.; более низкие –0,5; 0,25; 0,125 и т.д.). Таким образом, реальные концентрации рабочих растворов должны учитывать фактор последующего разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1:10). Для приготов­ления рабочих растворов используется дистиллированная вода.

10.6.2. Приготовление чашек Петри с растворами антибиотиков и постановка метода серийных разведений в агаре

Сухая агаризованная питательная среда растворяется и авто-клавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48–50°С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего рас­твора антибиотика на 9 частей расплавленного агара). Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3–4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застыва­ния. Приготовленные указанным образом чашки Петри пред­почтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4–8°С в течение 5 сут. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики, особенно при низких концент­рациях, не выдерживают даже указанный срок хранения (преж­де всего ампициллин, метициллин, цефаклор, имипенем). В свя­зи с этим стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экс­периментально с использованием референсных штаммов. Па­раллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибио­тиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибио­тиков.

Для приготовления суспензии используют суточную бульон­ную или агаровую культуру исследуемых микроорганизмов.

Для получения бульонной культуры отбирают одну или не­сколько четко изолированных колоний, легким прикосновени­ем петли к центру колонии переносят незначительное количе­ство материала в пробирку с 4,0–5,0 мл жидкой неселективной среды, например МПБ. Инкубируют при 37 °С. Приблизитель­но через 5–6 ч инкубации мутность суспензии соответствует 0,5 стандарта МсFаrlаnd (1 – 2 х 108 КОЕ/мл). Концентрация доводится точно до 0,5 стандарта МсFагlаnd с помощью спек­трофотометра или под визуальным контролем путем добавле­ния стерильного изотонического раствора хлорида натрия.

Для получения агаровых культур можно использовать толь­ко четко изолированные колонии, выросшие на неселективных питательных средах. Суспензии по стандарту МсFаrlаnd - гото­вят на стерильном изотоническом растворе или бульонной среде.

Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 104 КОЕ/мл. Поскольку коммерческие инокуляторы или стан­дартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1–2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в суспен­зии должна быть 107 КОЕ/мл.

Такую концентрацию можно получить при разведении сус­пензии 0,5 по стандарту МсFаrlаnd в 10 раз. Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5–8 мм.

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16–20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий рекомен­дуется периодически проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на неселективные питательные среды.

Важнейшим требованием контроля качества постановки ме­тода оценки антибиотикорезистентности является высев ис­пользованной для инокуляции суспензии на плотную неселек­тивную среду (например, МПА) для контроля чистоты куль­туры.

Результат оценки антибиотикорезистентности имеет смысл учитывать толькр при подтверждении чистоты культуры.

Учет результатов проводят, поместив чашку на темную, не отражающую света поверхность. За МПК принимают концент­рацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увели­чение. Появление единственной колонии на чашке с концент­рацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

При росте нескольких колоний исследование необходимо повторить, обратив особое внимание на чистоту культуры. В ря­де случаев целесообразно получить субкультуру из единичных колоний, выросших на чашках с концентрацией антибиотика выше, чем явная МПК, и провести ее идентификацию.

Определенным преимуществом метода серийных разведе­ний в агаре является его высокая производительность. Так, на одну чашку Петри можно инокулировать до 40–50 культур микроорганизмов.

10.6.3. Приготовление планшет и постановка метода серийных микроразведений в бульоне

Метод серийных макроразведений в жидкой неселективной среде (в пробирках) в силу его высокой стоимости в настоящее время практически не используют.

Наиболее удобной посудой для постановки метода серийных микроразведений в лабораторных условиях являются 96-луночные планшеты для иммунологических исследований.

Соответственно первым этапом является изготовление план­шет, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих раство­ров антибиотиков, вносимых в лунки планшет, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости создания в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма 5×105 КОЕ/мл.

На практике применяются два наиболее распространенных варианта.

При первом варианте концентрация антибиотика в рабочем растворе, приготовленном на жидкой питательной среде, равна заданной. В этом случае объем инокулята должен составлять не более 10 % от объема в лунке. Так, если рекомендуемый объем раствора антибиотика в лунке будет составлять 0,1 мл, объем инокулята – 0,01 мл, его концентрация – 5×105 КОЕ/мл.

При втором варианте концентрация антибиотика в рабочем растворе должна быть в 2 раза больше, чем заданная. Рекомен­дуемый объем раствора антибиотика 0,05 мл, объем инокулята также 0,05 мл, а его концентрация – 106 КОЕ/мл, т.е. 105 КОЕ/мл × 2.

После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при тем­пературе ниже –60 °С до момента использования. Повторное замораживание – оттаивание не допускается.

Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Суспензию исследуемого микроорганизма гото­вят из агаровой или бульонной культуры по стандарту МсFаrland и доводят до заданной концентрации.

Инокуляцию необходимо провести в течение 15 мин после приготовления суспензии. Инкубацию осуществляют при 37°С в течение 16–20 ч. Для предотвращения высыхания содержи­мого лунок планшетка должна быть закрыта крышкой.

Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

10.6.4. Коммерческие варианты метода серийных разведений

Имеющиеся на рынке коммерческие тест-системы для оценки антибиотикочувствительности микроорганизмов в по­давляющем большинстве случаев представляют собой вариант "пограничных концентраций" метода серийных микроразведе­ний в жидкой среде. Их основным преимуществом является высокая производительность, стандартность и простота в ра­боте.

К недостаткам указанных методов относится полуколичест­венный характер результата исследования, т.е. методы, осно­ванные на пограничных концентрациях, не позволяют полу­чить значения абсолютных МПК исследуемых микроорганиз­мов. В то же время данные об абсолютных значениях МПК необходимы для наблюдения за тенденциями в динамике рас­пространения антибиотикорезистентности.