Наличие многих методов оценки антибиотикочувствительности (в том числе и коммерческих вариантов) неизбежно поднимает вопрос о выборе наиболее адекватного из них для повседневного использования в практической лаборатории. Оценивая Пригодность того или иного метода для практических целей, прежде всего необходимо выяснить возможность интерпретации получаемых с его помощью результатов. Эта проблема особенно актуальна для коммерческих методов. В инструкции на тест-системы или отдельные виды расходных материалов, предоставляемой изготовителем, должно быть четко указано, что получаемые при их использовании результаты можно интерпретировать в соответствии с критериями, приведенными в национальных рекомендациях. В Российской Федерации критерии чувствительности микроорганизмов к АБП регламентированы приказом Министерства здравоохранения.
- • В настоящей главе будут рассматриваться методы оценки антибиотикочувствительности только наиболее распространенных из клинически значимых микроорганизмов, не нуждающихся для культивирования в питательных добавках.
10.6.1. Методы серийных разведений
Несмотря на то, что методы серийных разведений являются наиболее информативными при оценке антибиотикочувствительности, их использование в рутинной практике большинства лабораторий представляется малореальным в силу значительной трудоемкости. Постановка методов серийных разведений для оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы:
- приготовление растворов АБП;
- приготовление питательных сред с растворами АБП;
- приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция;
- инкубация;
- учет результатов;
- интерпретация.
Методика приготовления растворов АБП одинакова для всех вариантов метода серийных разведений. Различают основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие – те, которые необходимо использовать ex tempore для приготовления питательных сред.
Для приготовления основных растворов антибиотиков предпочтительно использовать субстанции препаратов с известной активностью. Допускается использование готовых инъекционных лекарственных форм препаратов. Оральные лекарственные формы непригодны. Однако субстанции АБП для практических лабораторий малодоступны. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности.
Для приготовления навесок антибиотиков необходимо использовать аналитические весы или другие весы равного класса точности. Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000,0 мкг/мл и выше, их необходимо хранить в условиях глубокого замораживания при –70 °С.
После извлечения из холодильника перед открыванием флаконов с основными растворами их необходимо довести до комнатной температуры для предотвращения конденсации влаги.
Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготовления рабочих растворов, повторное замораживание не допускается.
Из основных растворов готовят рабочие двукратные разведения антибиотиков. За основу берется конечная концентрация АБП в питательной среде, равная 1,0 мкг/мл (более высокие – 2; 4; 8 и т.д.; более низкие –0,5; 0,25; 0,125 и т.д.). Таким образом, реальные концентрации рабочих растворов должны учитывать фактор последующего разбавления раствора антибиотика в питательной среде (обычно 1:10). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода.
10.6.2. Приготовление чашек Петри с растворами антибиотиков и постановка метода серийных разведений в агаре
Сухая агаризованная питательная среда растворяется и авто-клавируется в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48–50°С, где выдерживаются до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы антибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара). Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3–4 мм.
Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4–8°С в течение 5 сут. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые бета-лактамные антибиотики, особенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения (прежде всего ампициллин, метициллин, цефаклор, имипенем). В связи с этим стабильность антибиотиков в приготовленных в лаборатории чашках Петри целесообразно устанавливать экспериментально с использованием референсных штаммов. Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для контроля роста готовят чашки Петри без антибиотиков.
Для приготовления суспензии используют суточную бульонную или агаровую культуру исследуемых микроорганизмов.
Для получения бульонной культуры отбирают одну или несколько четко изолированных колоний, легким прикосновением петли к центру колонии переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0–5,0 мл жидкой неселективной среды, например МПБ. Инкубируют при 37 °С. Приблизительно через 5–6 ч инкубации мутность суспензии соответствует 0,5 стандарта МсFаrlаnd (1 – 2 х 108 КОЕ/мл). Концентрация доводится точно до 0,5 стандарта МсFагlаnd с помощью спектрофотометра или под визуальным контролем путем добавления стерильного изотонического раствора хлорида натрия.
Для получения агаровых культур можно использовать только четко изолированные колонии, выросшие на неселективных питательных средах. Суспензии по стандарту МсFаrlаnd - готовят на стерильном изотоническом растворе или бульонной среде.
Конечная посевная доза исследуемого микроорганизма на поверхности питательной среды должна составлять 104 КОЕ/мл. Поскольку коммерческие инокуляторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1–2 мкл жидкости, концентрация микроорганизмов в суспензии должна быть 107 КОЕ/мл.
Такую концентрацию можно получить при разведении суспензии 0,5 по стандарту МсFаrlаnd в 10 раз. Полученную суспензию необходимо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5–8 мм.
После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыхания, далее переворачивают и инкубируют при 37 °С в течение 16–20 ч.
Для контроля качества приготовления суспензий рекомендуется периодически проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на неселективные питательные среды.
Важнейшим требованием контроля качества постановки метода оценки антибиотикорезистентности является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду (например, МПА) для контроля чистоты культуры.
Результат оценки антибиотикорезистентности имеет смысл учитывать толькр при подтверждении чистоты культуры.
Учет результатов проводят, поместив чашку на темную, не отражающую света поверхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию видимого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.
При росте нескольких колоний исследование необходимо повторить, обратив особое внимание на чистоту культуры. В ряде случаев целесообразно получить субкультуру из единичных колоний, выросших на чашках с концентрацией антибиотика выше, чем явная МПК, и провести ее идентификацию.
Определенным преимуществом метода серийных разведений в агаре является его высокая производительность. Так, на одну чашку Петри можно инокулировать до 40–50 культур микроорганизмов.
10.6.3. Приготовление планшет и постановка метода серийных микроразведений в бульоне
Метод серийных макроразведений в жидкой неселективной среде (в пробирках) в силу его высокой стоимости в настоящее время практически не используют.
Наиболее удобной посудой для постановки метода серийных микроразведений в лабораторных условиях являются 96-луночные планшеты для иммунологических исследований.
Соответственно первым этапом является изготовление планшет, пригодных для хранения. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшет, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости создания в лунке конечной концентрации исследуемого микроорганизма 5×105 КОЕ/мл.
На практике применяются два наиболее распространенных варианта.
При первом варианте концентрация антибиотика в рабочем растворе, приготовленном на жидкой питательной среде, равна заданной. В этом случае объем инокулята должен составлять не более 10 % от объема в лунке. Так, если рекомендуемый объем раствора антибиотика в лунке будет составлять 0,1 мл, объем инокулята – 0,01 мл, его концентрация – 5×105 КОЕ/мл.
При втором варианте концентрация антибиотика в рабочем растворе должна быть в 2 раза больше, чем заданная. Рекомендуемый объем раствора антибиотика 0,05 мл, объем инокулята также 0,05 мл, а его концентрация – 106 КОЕ/мл, т.е. 105 КОЕ/мл × 2.
После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут храниться при температуре ниже –60 °С до момента использования. Повторное замораживание – оттаивание не допускается.
Для проведения исследования планшеты после извлечения из холодильника выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из агаровой или бульонной культуры по стандарту МсFаrland и доводят до заданной концентрации.
Инокуляцию необходимо провести в течение 15 мин после приготовления суспензии. Инкубацию осуществляют при 37°С в течение 16–20 ч. Для предотвращения высыхания содержимого лунок планшетка должна быть закрыта крышкой.
Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.
10.6.4. Коммерческие варианты метода серийных разведений
Имеющиеся на рынке коммерческие тест-системы для оценки антибиотикочувствительности микроорганизмов в подавляющем большинстве случаев представляют собой вариант "пограничных концентраций" метода серийных микроразведений в жидкой среде. Их основным преимуществом является высокая производительность, стандартность и простота в работе.
К недостаткам указанных методов относится полуколичественный характер результата исследования, т.е. методы, основанные на пограничных концентрациях, не позволяют получить значения абсолютных МПК исследуемых микроорганизмов. В то же время данные об абсолютных значениях МПК необходимы для наблюдения за тенденциями в динамике распространения антибиотикорезистентности.