Все существующие методы оценки антибиотикочувстви­тельности микроорганизмов можно разделить на фенотипические и генотипические.

Генотипические методы основаны на прямой детекции генов, кодирующих детерминанты устойчивости к АБП. Генотипичес­кие методы детекции антибиотикорезистентности являются крайне перспективными, однако до настоящего времени их практическое применение ограничено. Для прямой детекции детерминант устойчивости используют ДНК–ДНК гибридиза­цию, амплификацию в полимеразной цепной реакции и неко­торые другие методы.

Фенотипические методы предполагают оценку влияния АБП на жизнедеятельность микроорганизмов по таким параметрам, как скорость роста или биохимическая активность. Среди фенотипических методов хорошо стандартизованными являются методы серийных разведений и диффузионные, основанные на детекции роста исследуемых культур.

Методы серийных разведений позволяют непосредственным образом определять основной количественный показатель, ха­рактеризующий антибактериальную активность антибиотика, – величину минимальной подавляющей концентрации (МПК). Для определения величины МПК в посуду с питательной сре­дой (пробирки, чашки Петри, лунки планшет и т.д.) вносят АБП в возрастающих концентрациях (обычно с двукратным шагом). Затем питательную среду засевают культурой исследу­емого микроорганизма, после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста. Диапазон используемых кон­центраций АБП зависит от задач исследования (обычно от десятых долей мкг/мл до 100–200 мкг/мл). Длительность ин­кубации культур для большинства микроорганизмов составляет 18–20 ч (в ряде случаев длительность инкубации может быть увеличена).

Разновидностью метода серийных разведений является ме­тод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пороговым или пограничным (break­points). Эти концентрации отделяют "чувствительные" микро­организмы от "промежуточных" и "промежуточные" от "ре­зистентных". Метод обеспечивает получение качественных ре­зультатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности.

При использовании традиционного метода двукратных раз­ведений МПК, фиксируемая экспериментатором, не соответ­ствует истинной величине этого показателя. Истинная величи­на МПК будет находиться в промежутке между зафиксирован­ной экспериментатором и концентрацией, в 2 раза ей уступающей и не вызвавшей ингибиции видимого роста. Так, при ингибиции роста микроорганизма в присутствии 2,0 мкг/мл АБП и наличии роста в присутствии 1,0 мкг/мл препарата точное значение МПК будет находиться в промежутке между этими величинами. При более высоких значениях фиксируе­мой экспериментатором МПК, например при 64,0 мкг/мл, истинное значение этой величины оказывается локализован­ным в еще более широком диапазоне: от 64,0 до 32,0 мкг/мл.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или бульоне.

В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений. Благодаря возможности миниатюризации метод серийных раз­ведений в бульоне является наиболее популярным и распро­страненным. На основе этого метода разработано и выпуска­ется большое количество коммерческих тест-систем.

В классическом варианте метода серийных разведений на­личие (появление мутности) или отсутствие роста регистриру­ют визуально. В коммерческих вариантах метода часто исполь­зуют спектрофотометрическое измерение оптической плотнос­ти питательной среды. Поскольку для практических целей важно максимально сократить время исследования, разработа­ны методы детекции начальных стадий бактериального роста. Они основаны на внесении в инкубационную среду различных индикаторов (в том числе флюоресцентных), реагирующих на изменения pH.

Диффузионные методы. В настоящее время существуют два основных варианта диффузионного метода: диско-диффузион­ный и эпсилометрический (Е-тест). Исторически более старым и наиболее распространенным на практике является диско-диффузионный метод (Kirby–Bauer). Метод основан на фор­мировании вокруг бумажного диска, пропитанного антибиоти­ком, зоны ингибиции поверхностного роста микроорганизма на плотной питательной среде.

При проведении исследования диск с АБП накладывают на поверхность плотной питательной среды, предварительно засе­янной исследуемым микроорганизмом. Сразу же после нане­сения диска на поверхность среды начинается процесс диффу­зии АБП из диска в среду. В это же время начинается процесс адаптации микроорганизма к питательной среде (лаг-фаза рос­та). Можно представить, что по поверхности среды от центра диска к периферии движется фронт концентрации АБП, спо­собной подавить рост микроорганизма (рис. 10.3).

В самом общем виде следует лишь отметить, что рост мик­роорганизма (образование газона) начнется на тех участках поверхности среды, где к моменту окончания лаг-фазы кон­центрация АБП окажется ниже подавляющей. Таким образом, к окончанию периода инкубации на поверхности питательной среды сформируется сплошной газон культуры микроорганиз­ма, а вокруг диска – круглая зона ингибиции роста.

 
   

Рис. 10.3. Закономерности диффузии антибиотика из дисков.

Интерпретация результатов оценки чувствительности с по­мощью диско-диффузионного метода предполагает использо­вание пограничных значений диаметра зоны ингибиции роста. В результате экспериментального изучения большого количе­ства штаммов можно получить зависимость между величиной МПК препарата и диаметром зоны ингибиции роста вокруг диска, далее, зная пограничные значения МПК, можно рас­считать пограничные значения диаметров зон ингибиции роста (рис. 10.4).

Для получения достоверной корреляции между значением МПК и диаметром зоны ингибиции роста очень важно подо­брать оптимальное содержание АБП в диске.

В результате сопоставления пограничных и эксперименталь­ных значений зоны ингибиции роста возможно отнесение мик­роорганизма к той или иной категории чувствительности.

Диско-диффузионный метод имеет определенные ограниче­ния для некоторых комбинаций микроб – антибиотик. Напри­мер, для бета-лактамов и стрептококков группы "утоапв" не удается установить четкую зависимость между диаметром зоны ингибиции роста и величиной МПК препарата.

В эпсилометрическом методе в качестве носителя исполь­зуется узкая полоска полимера (0,5 х 6,0 см), пропитанная различными концентрациями АБП (от минимальных до мак­симальных). Ингибиция роста микроорганизма вокруг полос­ки-носителя происходит только в той зоне, где концентрация антибиотика, диффундирующего из носителя, выше МПК. Ре­зультатом диффузии антибиотика в питательной среде является образование вокруг носителя каплевидной зоны ингибиции роста. Величины концентрации антибиотика в каждом участке носителя типографским способом нанесены на соответствую­щем отрезке наружной (обращенной к исследователю) поверх­ности носителя. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны ингибиции роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по проведению Е-теста прилагаются изготовителем к набору реактивов.

 
   

Рис. 10.4. Обоснование пограничных значений диаметров зон инги­биции роста микроорганизмов.