В данной главе представлены традиционные и современные ме­тоды культивирования микроорганизмов, отличающиеся повы­шенной точностью, чувствительностью и селективностью. Пред­ставить полный перечень таких методов весьма затруднительно, так как их совершенствование идет непрерывно и очень высокими тем­пами. Можно с уверенностью сказать, что возможности той или иной области науки продиктованы прежде всего используемыми в ней методами, и материал, представленный здесь, крайне важен для пищевой микробиологии.

Принципиальной основой пищевой микробиологии являются методы анализа пищевых продуктов на наличие и количество ми­кроорганизмов или их метаболитов.

Но ни один из используемых методов не позволяет установить точное число микроорганизмов в продовольственном продукте, так как каждый метод имеет некоторые ограничения в использовании.

Гомогенизация – процесс уменьшения неоднородности смесей, состоящих из твердых веществ, в текучей среде (жидкостях или газах), путем измельчения и равномерного перераспределения их по объему. Например, при помощи гомогенизации жир в молоке может быть разбит так тщательно, что частицы повторно не рекомбинируются и сливки не образуются.

Техника гомогенизации состоит из следующих способов:

• перемешивания дисперсных систем с жидкой дисперсионной средой быстро враща­ющимся ротором диспергатора или вен­чиком;
• прокачивания дисперсных систем типа жидкость/жидкость (на­пример, молока) под давлением до 5–400 атм через отверстие головки гомогенизатора, возникающие при этом гидродинами­ческие силы дробят фрагменты дисперсной фазы на более мелкие;
• перемешивания порошков в многоосных, Y-образных или Z-образных смесителях;
• ультразвуковой кавитационной гомогенизации дисперсных систем газ/жидкость и жидкость/газ.

Любая проба, доставленная в лабораторию, нуждается в допол­нительной гомо­гении­зации перед ее сокращением – в противном случае ее представительность не может быть гарантирована. Если неоднородность пробы (наличие в ней различных фаз) видна на глаз, то качество гомогенизации может определять качество ре­зультатов анализа в целом. Стандартные рабочие методики, описы­вающие стадию подготовки пробы, должны предусматривать раз­нообразные способы гомогенизации. При оценке общей погреш­ности результатов необходимо количественно оценить погрешность, связанную со стадией сокращения пробы. Последняя погрешность определяет число сокращенных проб, которые следует проанализи­ровать, чтобы достичь требуемой точности результатов анализа.

Для выполнения процедур пробоподготовки используется необ­ходимое основное оборудование.

Вплоть до конца 1970-х гг. образцы перед посевом почти исклю­чительно измельчали механически – посредством растирания, раз­резания на мелкие кусочки и т.п. A.N. Sharpe и А.К. Jackson в 1971 г. разработали устройство для гомогенизации пищевых продуктов. Гомогенизатор – механическое устройство, которое за счет физи­ческого воздействия измельчает образец. Эффект удара состоит в разрезании образцов пищевых продуктов; выделяющиеся при этом микроорганизмы суспендируются в растворителе (рис. 4.1).

Рис. 4.1.
Гомогенизатор Stomacher лабораторный ECO Blender II (PBI)

Гомогенизатор Stomacher можно сопоставить с высокоскоростным блендером для анализа пищевых продуктов. Результаты опреде­ления числа микроорганизмов в образцах, гомогенезированных на Stomacher, не отличаются от таковых в образцах, подготовленных блендером. Устройство выгодно отличается от блендера, так как:

• не требуется очищать части гомогенизатора;
• сохраняется температура образца;
• подготовленные образцы можно сохранить в замороженном виде для дальнейшего исследования;
• создается меньше шума, чем в блендере.

Показано уменьшение летального действия Stomacher на Staphy­lococcus aureus, Enterococcus faecalis и Escherichia coli. по сравнению с блендером.

Stomacher предпочтителен для продуктов питания.

При гомогенизации мяса с использованием Stomacher не проис­ходит обширного разрушения тканей мяса и, как следствие, в со­ставе гомогената в меньшем количестве присутствуют восстанавли­вающие компоненты, взаимодействующие с резазурином. Тогда как при перемешивании уровень восстанавливающих компонентов, взаимодей­ствующих с резазурином, значительно выше.

Устройство под названием Pulsifier сходно с гомогенизатором Stomacher. В нем создается уровень турбулентности, позволяющий более полно извлекать из продукта микроорганизмы.

Гомогенизатор Pulsifier имеет электромотор, приводящий в дви­жение ударное кольцо из нержавеющей стали, которое дополни­тельно вибрирует для интенсивного перемешивания/взбалтывания пробы. Это обеспечивает максимальный переход микроорганизмов из образца в суспензию, не деформируя продукт. Он позволяет под­готовить пробу с максимальной экстракцией бактериальных клеток.

Проба помещается в специальный пакет, который плотно запеча­тывается во избежание попадания в окружающее пространство аэро­золя, содержащего бактерии. За процессом гомогенизации можно наблюдать через прозрачное окно. Контрольная LCD-панель по­зволяет устанавливать программу или время, она также имеет кнопку «Пауза», чтобы можно было остановить процесс, а затем продолжить его, не начиная заново.

Гомогенизатор Pulsifier имеет следующие преимущества:

• суспензия является более чистой и менее густой, чем при обра­ботке с помощью других приборов;
• образец после обработки содержит меньше пищевых частиц;
• образцы более пригодны для молекулярных методов исследо­вания;
• затрачивается меньше времени на подготовку образца.

Для подсчета числа микроорганизмов используют следующие ме­тоды исследования: СПК – стандартный подсчет колоний; КОЕ – определение колониеобразующих единиц; АПК – аэробный подсчет колоний; НВЧ – наиболее вероятное число жизнеспособных клеток; подсчет числа жизнеспособных клеток, обладающих редуктазной системой; прямой подсчет микроорганизмов.

 

4.2. СТАНДАРТНЫЙ ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ

Сущность метода заключается в подсчете жизнеспособных ми­кроорганизмов посредством посева на питательные среды, на ко­торых микробные клетки в процессе деления образуют колонии, видимые невооруженным глазом.

Метод СПК предусматривает измельчение и гомогенизацию образца пищевых продуктов, его растворение в растворителе. Затем некоторое количество гомогената, разбавленного в растворителе, высевают на агаровую среду (поверхностным или глубинным ме­тодом) и инкубируют при соответствующей температуре в течение определенного времени. Потом подсчитывают все видимые колонии с использованием счетчика колоний. Метод СПК наиболее широко используется для определения числа жизнеспособных клеток или колониеобразующих единиц (КОЕ) в пищевых продуктах. Коли­чество обнаруживаемых микроорганизмов рассматривается как функция следующих факторов: систематической группы микробиоты продукта; избранного метода исследо­вания; истории пище­вого продукта до исследования; состава плотных питательных сред; температуры и времени инкубирования; рН, влажности и окисли­тельно-восстано­вительного потенциала плотных питательных сред; относительного количества микро­организмов в образце; наличия других конкурентных или антагонистических организмов.

В основе СПК лежит чаще всего глубинный посев, однако нельзя исключать использования поверхностного посева, потому что ре­зультаты обоих методов вполне сравнимы. Растворенный методом серийных разведений образец в количестве 0,1, 0,5 или 1,0 мл нано­сится на поверхность питательной среды. Затем с помощью изогну­того стеклянного или пластикового шпателя образец круговыми движениями равномерно распределяется по всей поверхности. При использовании этого метода посева в пищевых продуктах со­храняются чувствительные к высокой температуре психрофилы, потому что микроорганизмы не контактируют с горячим расплав­ленным агаром. Для строгих аэробов предпочтителен поверх­ностный посев, но микроаэрофильные организмы при таком по­севе имеют тенденцию к медленному росту. При посеве на поверх­ность агаровой пластинки необходимо равномерное растирание инокулята, чего трудно добиться на влажной поверхности. Избе­жать этого неудобства можно кратковременным подсу­шиванием агаризированной среды в боксе.

Спиральный плоттер. Метод спирального плоттера (спирального посева) – это метод учета жизнеспособных микроорганизмов. Спиральный плоттер – механическое устрой­ство, которое распределяет жидкий гомогенат по поверхности вращающейся чашки Петри, со­держащей соответствующий жидкий или плотный агар (рис. 4.2).

Рис. 4.2.
Спиральный плоттер Eddy Jet 2

От центра пластины к ее краям, распределяя образец по Архиме­довой спирали, перемещается распределяющее устройство (рука), которое специальным прикрепленным шприцом отливает непре­рывно уменьша­ющийся объем образца так, что концентрация в центре и у края достигает соотношения 10 000 : 1. Инкубация по­сева в термостате позволяет выявить, что количество вносимых ми­кроорганизмов больше в центре пластины в отличие от края. После посева образца с помощью спирального плоттера выросшие колонии считают, используя так называемую сетку для подсчета (рис. 4.3).

Преимущества спирального плоттера: используется меньше агара; меньше чашек, растворителя и пипеток; в течение 1 ч может быть проанализировано в три-четыре раза больше образцов. Прибор в основном используют для исследований таких продуктов, как молоко. Для использования плоттера разработали лазерный счетчик. Высокая стоимость прибора требует его использования для анализа большого числа образцов. Метод описан М.А. Cousin, J.M. Jay и P.C. Vasavada (2001).

Метод спирального посева образцов является широко распро­страненной в микробиологии техникой, которая была разработана для сокращения количества чашек Петри с питательной средой, используемых для поверхностных посевов. Метод спирального по­сева позволяет не выполнять серийные разбавления образца, ко­торые необходимы при традиционном способе посева и которые отнимают много времени. Один спиральный посев позволяет сэко­номить три чашки питательной среды, что существенно сокращает время операции и расход материалов.

Рис. 4.3.
Сетка для подсчета колоний

Спиральный посев образцов проводится по так называемой Ар­химедовой спирали. Объем пробы, нанесенной вдоль спирали экс­поненциально, уменьшается так, что один посев содержит не­сколько концентраций образца, распределенных вдоль спирали. После инкубации результат подсчитывают с помощью специальной учетной сетки (вручную) или автоматически с помощью автомати­ческого счетчика колоний.

В приборе Eddy Jet 2 (производитель IUL) реализован новый подход, который заключается в использовании для нанесения ма­териала образца стерилизованных
g-радиацией одноразовых ми­крошприцев, что предотвращает перекрестную контаминацию. Ис­пользование стерильных микрошприцев делает ненужными этапы очистки, что позволяет сэкономить большое количество времени.

 

4.3. МЕМБРАННЫЕ ФИЛЬТРЫ

Мембраны с размером пор около 0,45 мкм при фильтрации растворенной пробы позволяют задерживать бактерии, но пропу­скать воду или растворитель. В результате на фильтре накапли­ваются бактерии. Мембрану помещают на агаровую пластину, со­держащую питательный субстрат, и термостатируют. Затем произ­водят подсчет колоний. Такие методы подходят для образцов, содержащих малое число бактерий.

Техника прямого флуоресцентного фильтрования. Подготов­ленный образец продукта фильтруют, используя фильтр с порами диаметром 5 мкм. Фильтрат обрабатывают тритоном и трипсином для растворения соматических клеток. Затем филь­тр­аты термостатируют и фильтруют через мембраны диаметром 0,6 мкм. Фильтрат окра­ши­вают флуорохромами. В высушенных мазочках подсчиты­вают клетки с помощью люминесцентного микроскопа. Метод по­зволяет определять от 6000 КОЕ/г в мясных и молочных продуктах.

 

4.4. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ

С помощью данного метода подсчитывают микроколонии на пи­тательном агаре, нанесенном на предметное стекло. На предметное стекло наносят суспензию из агара и исследуемого жидкого суб­страта. Смесь на стекле термостатируют, высушивают, окрашивают. Методом микроскопии подсчитывают число выросших микроко­лоний. С учетом объема нанесенной на предметное стекло суспензии (агар + субстрат) и площади распределения на стекле определяют количество выросших колоний в единице объема субстрата.

Петрифильмы. Метод петрифильма (сухих пленок) основан на применении двух пленок, между которыми помещены высушенная питательная среда и желеобразный компонент холодного раство­рения. Называется этот метод Petrifilm. Петрифильмы – это тесты, используемые для количественного подсчета микроорганизмов в пи­щевых продуктах. На подложку тестовой системы наносится пита­тельная среда, необходимая для роста конкретного вида или группы микроорганизмов. В питательную среду включено специальное веще­ство, которое при добавлении жидкости превращается в гель при комнатной температуре. Среда, используемая для роста микроорга­низмов, образуется из имеющихся компонентов только в момент по­сева образца. До этого момента петрифильм не активен и может хра­ниться длительное время. Для сохранения стерильности компо­ненты питательной среды покрыты сверху непроницаемой пленкой.

Для исследования 1 или 5 мл жидкой суспензии образец поме­щается между двумя пленками и распределяется в области питания. Метод используется как для аэробного подсчета колоний, так и для индикации и определения количества таксономических групп ми­кроорганизмов.

 

4.5. НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНЫЕ ЧИСЛА (НВЧ)

Количество микробиальных клеток определяют методом наиболее вероятных чисел (НВЧ), сущность которого состоит в статистической оценке возможности присутствия живых бактерий в се­рийных разведениях. Посев проводят из параллельных разведений в жидкую питательную среду, термостатируют и учитывают про­бирки, в которых отмечается рост бактерий. Метод НВЧ статисти­чески неэффективен, поскольку каждая пробирка соответствует только небольшой части поверхности чашки Петри. В связи с этим приходится использовать много пробирок либо удовлетвориться весьма приблизительным результатом.

Одним из преимуществ метода НВЧ является возможность его использования в отсутствие способа культивирования бактерий на твердой среде. Второе его преимущество заключается в том, что он удобен в случае высокой вариабельности кинетики роста.

Предположим, что некоторые клетки из смешанной культуры растут быстро, образуя на агаре крупные колонии, которые, рас­пространяясь по поверхности, маскируют появляющиеся позже мелкие колонии интересующего нас микроорганизма. Хотя коли­чество таких мелких колоний по сравнению с крупными может быть больше, их невозможно учесть на чашках из-за присутствия колоний более подвижных или быстрее растущих бактерий. Третье преимущество метода НВЧ состоит в том, что в присутствии не представляющих интереса организмов и в отсутствие подходя­щего метода селекции его можно использовать для выявления легко обнаруживаемых продуктов (например, пигментов или антибио­тиков), продуцируемых изучаемыми микроорганизмами.

Наконец, метод НВЧ используют, если агар или другие отвердители содержат некоторые факторы (например, тяжелые металлы), которые изменяют достоверность подсчета или взаимодействуют с изучаемыми бактериями.

 

4.6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ КРАСИТЕЛЕЙ

Метод применяют для определения количества живых микроор­ганизмов. С его помощью устанавливают биохимическую актив­ность микробов, продуцирующих фермент редуктазу, которая спо­собна обесцвечивать некоторые краски, в частности метиленовую синь и резазурин. В основу метода положено определение времени, необходимого для обесцвечивания метиленовой сини. Преиму­щество метода редуктазной пробы в сравнении с прямым бактери­ологическим методом состоит в быстроте получения результата (примерно через 5,5 ч). Однако не все микроорганизмы обладают редуцирующей активностью. В большей степени этим свойством обладают молочнокислые стрептококки, кишечные палочки, маслянокислые и гнилостные бактерии, в несколько меньшей сте­пени – сальмонеллы и стафилококки. Редуктазная проба с метиленовой синью дает неточное представление о степени бактериальной обсемененности продукта и его санитарном качестве. Поэтому по­казатели редуктазной пробы необходимо учитывать в комплексе с другими результатами исследований.

Преимущество резазурина состоит в том, что он обладает вы­соким окислительно-восстановительным потенциалом, что уско­ряет исследование. На показатели резазуриновой пробы темпера­тура продукта не оказывает заметного влияния.

 

4.7. ПРЯМОЙ МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ ПОДСЧЕТ

Чтобы определить общее количество микроорганизмов в раз­личных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксиро­ванных мазках, на мембранных фильтрах). Такие методы широко применяются в исследованиях микрофлоры воды и почвы.

Эффективность такого подсчета, как правило, в 10–10 000 раз выше, чем подсчета методом высева, так как многие микроорга­низмы не растут на питательных средах и учесть их можно только под микроскопом. Метод позволяет получить дополнительную ин­формацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Кроме того, прямой подсчет микроорганизмов осуществляется быстрее, он дешев, а оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.

Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского–Брида). Преиму­щество метода заключается в том, что фиксиро­ванные окрашенные препараты хорошо сохраняются и подсчет можно проводить в удобное для исследователя время.

Техника осуществления подсчета:

• на хорошо обезжиренном предметном стекле маркером ри­суют прямоугольник строго определенной площади (2, 4 или 6);
• на стекло в прямоугольник микропипеткой (или автомати­ческой пипеткой) наносят определенный объем суспензии клеток (0,01; 0,02 или 0,03 мл);
• суспензию равномерно распределяют петлей по всей площади прямоугольника;
• препарат высушивают на воздухе и фиксируют 15 мин 96%-м этанолом;
• проводят окрашивание препарата фуксином Циля (в течение 1–2 мин);
• краситель сливают, препарат промывают водой, последова­тельно погружая стекло в 5–6 стаканов с водой, и высушивают на воздухе.

Количество клеток микроорганизмов подсчитывают, используя иммерсионный объектив, в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа.

Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с по­мощью объект-микрометра. Последний помещают на столик ми­кроскопа вместо препарата и при том же увеличении, при котором проводили подсчет, определяют длину стороны квадрата окулярной сетки или диаметр поля зрения.

Для получения достоверных результатов клетки микроорга­низмов рекомендуется подсчитывать не менее чем в 50–100 полях зрения, а общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600.

Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл ис­следуемого материала, вычисляют по формуле

M = (AS/Vs)·n

где М – количество клеток в 1 мл; А – среднее число клеток в ква­драте окулярной сетки (поле зрения); s и S – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения) и приготовленного мазка в мкм² соответственно; V – объем нанесенной на стекло суспензии, мл; n – разведение исследуемого материала.

 

4.8. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОВЕРХНОСТЕЙ

Существующие методы микробиологической оценки поверх­ностей не позволяют собирать все микроорганизмы. Тем не менее их использование на пищевых предприятиях может обеспечивать получение ценной информации. Очевидно, что в пробах не могут быть представлены все микроорганизмы.

Например, для исследования микроорганизмов, имеющихся на поверхности мяса, обожженное предметное стекло прижимают к мясу, чтобы получить отпечаток с его поверхностных слоев. Го­товые отпечатки, полученные таким способом, фиксируют над пла­менем спиртовки и окрашивают по Граму. Готовые препараты рас­сматривают под микроскопом с иммерсией, подсчитывая коли­чество бактерий в поле зрения и записывая их форму. Исследуют не менее 10 полей зрения. Подсчитывают отдельно грам­положительные и грамотрицательные клетки и определяют среднее коли­чество клеток.

Смывы. Их берут стерильными увлажненными ватно-марлевыми тампонами объемом 5–7 см³, удерживаемыми стерильным пинцетом, или ватными, марлевыми тампонами, закрепленными на стержне из проволоки или дерева.

Тампоны стерилизуют завернутыми в бумагу. В случае закреп­ления тампона на металлической или деревянной палочке, пропу­щенной через ватную пробку, его вставляют в пробирку с 10 см³ смывной жидкости (водопроводной воды, физраствора, пептонной воды) или таким же количеством жидкой питательной среды для об­наружения БГКП (среда Кода, Кесслер, Хейфеца и др.). Тампон не должен касаться жидкости. Все вместе стерилизуют при (121 ± 1)°С в течение 30 мин. Современные методы позволяют пользоваться гото­выми наборами стерильных сред и тампонов на палочках.

Непосредственно перед взятием смыва тампон на палочке ув­лажняют, наклоняя пробирку или опуская тампон вниз. Тампоны без палочки, находящиеся в стерильной чашке Петри, увлажняют стерильной смывной жидкостью из расчета 10 мл на 1 тампон. Смывы крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 см². При взятии смывов с ровной поверхности используют ме­таллические рамки-трафареты, ограничи­вающие площадь 100 см². Перед каждым употреблением трафарет обжигают.

После взятия смыва тампон без палочки погружают либо в про­бирку со средой для БГКП, либо в пробирку со смывной жидко­стью, используемой в дальнейшем для посевов на питательные среды.

Смывы мелких объектов (поверхность которых < 100 см²) берут со всей поверхности.

После взятия смыва пробку с тампоном на палочке вновь встав­ляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в смывную жид­кость или жидкую питательную среду для БГКП. Посевы термоста­тируют при (37 ± 1)°С в течение 18–24 ч. В случае помещения там­пона в смывную жидкость после тщательного перемешивания она является исходным материалом для посева.

Для определения чистоты рук работников, которые непосред­ственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией, смоченным тампоном тщательно обтирают обе ладони и пальцы. Исследования смывов проводят не реже двух раз в месяц. Контроль обра­ботки рук проводится перед работой, после туалета, при пере­ходе с одного участка на другой.

Для сбора материала смыва с одной поверхности изготавливают стерильные трафареты с отверстиями конкретного размера, ко­торые обрабатывают тампоном, например, 1 дм² или 1 см².

После наложения стерильного шаблона поверхность, выступа­ющую в отверстии шаблона, протирают тампоном. Тампон возвра­щается в его держатель (пробирку), содержащий соответствующий растворитель, и хранится при температуре холодильника до посева. Растворитель, если необходимо, должен содержать нейтрализатор дезинфектанта.

Микроорганизмы подсчитывают методом стандартного под­счета колоний.

Посев отпечатком. Метод прямого посева микроорганизмов от­печатком на агаре предполагает использование чашек Петри. Их заполняют 15–16 мл плотной среды, которая после затвердевания создает агаровую пластинку. Чашки опрокидывают. Соприкасаясь с объектом исследования, агаровая плотная среда соприкасается с исследуемой поверхностью. После термостатирования засеянной таким образом чашки Петри в ней подсчитывают число колоний.

В опыте с исследованием поверхности металла, обсемененного спорами Bacillus subtilis, споры были обнаружены методом отпе­чатков более чем в 40% случаев, а методом смыва – в 50%.

Методы «агаровых колбасок». Этот метод предполагает исполь­зование модифицированного шприца для инъекций. У 100-миллилитрового шприца отрезают вместе с канюлей дно и получают полый цилиндр, который заполняют агаром. Поршнем выдвигают столбик агара до конца цилиндра и прикасаются им к исследуемой поверхности. Сверху столбик агара отрезают и помещают в чашку Петри, термостатируют и подсчитывают число колоний. Методику применяют для анализа микробиоты на поверхности мяса и рас­тений. Так как скопления микроорганизмов образуют одну ко­лонию, полученное методом «агаровых колбасок» количество ми­кроорганизмов меньше, чем методами с использованием пробоподготовки, которые позволяют дезинтегрировать скопления бактерий.

Другие поверхностные методы.

Липкая пленка. Ее приклеивают к исследуемой поверхности, затем контактировавшей стороной накладывают на агаровую пластинку. Данный метод менее эффективен, чем метод снятия смывов, но с успехом используется в оценке количества микроорганизмов на поверхности мяса.

Аэрозольная пушка. Метод основывается на нанесении аэрозоля промывного раствора на ограниченную область поверхности и по­следующем посеве промывного раствора на чашку. Для него необходим источник давления воздуха. Для смыва микроорганизмов с различных поверхностей методика аэрозольной пушки значи­тельно эффективней тампонового метода.

 

4.9. ТРАВМИРОВАННЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ И РЕАКЦИЯ НА СТРЕССОВЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ

Множество физических и химических факторов могут оказывать неблагоприятное действие на бактериальную клетку. Токсические вещества, неблагоприятная температура, рН, облучение в пределах видовой чувствительности организма не препятствуют существо­ванию бактерий. Существенные изменения условий в неблагопри­ятную сторону приводят к отмиранию клеток. При некоторых воз­действиях, которые обычно обозначают как сублетальные, клетки не погибают сразу, но оказываются травмированными. Их даль­нейшая судьба в значительной степени зависит от условий, в ко­торых они окажутся. У них во многих случаях нарушаются барь­ерные функции мембран, наблюдается выход в среду некоторых метаболитов, нарушается синтез белка, возникают нарушения в структуре ДНК. Условия, вполне благоприятные для развития нетравмированных бактерий, могут быть гибельными для травмиро­ванных клеток. Бактерии, подвергнутые ряду воздействий, гибнут на средах с повышенной концентрацией солей, совершенно не опасных для нормальных клеток, или на средах с поверхностно-активными соединениями, также в концентрациях, не влияющих на рост нормальных клеток. Эти факторы иногда определяют как селектирующие здоровые клетки от травмированных. В качестве таких факторов могут выступать рН, температура, даже опреде­ленные пищевые субстраты.

Травмированные клетки, помещенные в благоприятные условия, способны репарировать, т.е. исправлять повреждения различных структур. Внимание исследователей в последнее время привлечено к изучению механизмов восстановления повреждений ДНК. Что же касается репараций повреждений других структур клетки, то их ме­ханизмы еще мало изучены. Известно, что для репарации функций мембран требуется значительное время, и их восстановление свя­зано с синтезом белка и РНК, а иногда необходим синтез фосфолипидов. В различных случаях благоприятные для репарации условия могут в корне различаться. Например, иногда репарация идет лучше в богатых, а иногда в бедных средах. Это справедливо и для репа­рации повреждений ДНК.

Известен ряд систем репарации повреждений ДНК. Эти системы специфичны в отношении не тех или иных воздействий, а опреде­ленных нарушений структуры ДНК.

Прямая фотореактивация. Она наблюдается при освещении клеток видимым или ближним УФ-светом и состоит в разрезании пиримидиновых димеров в ДНК. Последние возникают обычно при воздействии на клетки среднего или дальнего УФ-света, по­этому особое значение фотореактивация имеет именно при его воз­действии. Процесс фотореак­тивации связан с действием фермента фотолиазы, которая связывается с пиримидиновыми димерами. Активация фермент-субстратного комплекса светом с длиной волны
300–600 нм приводит к мономеризации димеров.

Непрямая фотореактивация. Она имеет пик облучения в области 340 нм. Снижение эффекта УФ-облучения в этом случае объясня­ется задержкой роста бактерий, в результате чего удлиняется пе­риод протекания репарационных процессов. Непрямая фотореак­тивация, таким образом, не связана с работой каких-либо специ­альных репарационных систем.

Эксцизионная репарация. Она состоит в удалении поврежденного участка ДНК одной цепи и восстановлении нормальной последова­тельности оснований по матрице оснований на комплементарной цепи. Вырезание повреждений осуществляется непосредственно эндонуклеазой, которая узнает нарушения. У Е. coli эта функция вы­полняется комплексом эндуклеаз, кодируемых генами uvr А, uvr В, uvr С.

Рекомбинационная репарация включает рекомбинацию двух типов. При рекомби­нации первого типа заполняется пробел в по­следовательности оснований во вновь синтезированной цепи ДНК на месте поврежденного участка. При рекомбинации второго типа осуществляется восстановление двунитевых разрывов в ДНК, воз­никающих под действием УФ-света, ионизирующей радиации, других повреждающих факторов.

Травмированные клетки восстанавливают причиненные им по­вреждения, и под влиянием сублетальных воздействий неблагопри­ятных факторов происходят перестройки в процессах метаболизма клетки, имеющие очевидное адаптивное значение. Более того, ока­зывается, что воздействие неблагоприятных условий нередко вызы­вает ответную реакцию клетки, еще не приводя к каким-либо нару­шениям ее структуры.

Клетки, подвергшиеся неблагоприятным воздействиям, нахо­дятся в состоянии стресса. В различных случаях это состояние может быть связано или не связано с нарушениями клеточных структур, т.е. клетки могут быть или не быть травмированы. В со­временной ми­кро­биологической литературе термины «стресс» и «стрессор» используются очень широко.

Процессы, протекающие в клетках, находящихся в состоянии стресса, изучены преиму­щественно на модели кишечных бактерий, прежде всего Е. coli и Salmonella typhimurium.

В зависимости от природы стрессора и характера причиненных повреждений реакция клетки может быть различной. К настоящему времени у бактерий выявлено пять регуляторных систем ответа на стрессовые воздействия: 1) «строгий контроль»; 2) SOS-ответ; 3) адаптивный ответ; 4) синтез белков теплового шока; 5) ответ на окислительный стресс. Во всех случаях происходят глубокие пе­рестройки метаболизма, связанные с замедлением или прекраще­нием размножения и синтезом белков, необходимых для выжи­вания. В некоторых случаях в процессах регуляции принимают участие специальные соединения – клеточные гормоны, названные алармонами (от фр. Alarme – тревога). Перечисленные системы на­ходятся под контролем соответствующих генов и взаимосвязаны.

Система строгого контроля включается в ответ на исключение из среды необходимых клетке аминокислот, источника углерода, солевой шок, падение темпе­ратуры (по крайней мере у некоторых термофильных бактерий). В данном случае клетки необязательно должны быть травмированы. Система строгого контроля регулиру­ется продуктом гена rel А посредством синтетазы алармонов. У разных бактерий свойства этого фермента могут несколько раз­личаться. Повышение содержания алармонов в результате актив­ности синтетазы приводит к ингибированию синтеза иРНК, тРНК и некоторых рРНК, в результате снижается синтез фосфатидилэтаноламина, а соответ­ственно и мембранных липидов, снижается синтез нуклеотидов. Снижение уровня мета­болизма способствует выживанию клетки в условиях, не допускающих сбалансирован­ного обмена.

Система SOS-ответа включается при разнообразных наруше­ниях в структуре ДНК или в системах ее репликации. Эта система работает, например, после УФ-облучения, воздействия различ­ными химическими мутагенами. Белок Ree А, активированный сигналом-индуктором SOS-системы, приобретает свойства протеазы и инактивирует репрессорный белок Lex А. В результате разрушения белка Lex А снимается репрессия по крайней мере с 17 генов. Белок Ree А также участвует в рекомбинации и в процессах репарации ДНК.

При SOS-ответе функционирует также пострепликативная система репарации, при которой повышена частота мутаций. Ген umu С, также репрессируемый Lex А, определяет индуцированный мутагенез. Можно предположить, что стимуляция мутагенеза в про­цессе SOS-ответа имеет приспособительное значение – могут поя­виться мутанты, более приспо­собленные к условиям, индуциро­вавшим SOS-ответ.

Наличие SOS-системы обнаружено у различных представителей семейства Enterobacteriaceae – Streptococcus faecalis, Bacillus subtulis. У последней при SOS-ответе, кроме всего прочего, развивается компетентное состояние клеток, т.е. они приобретают способность воспринимать экзогенную ДНК в процессе генетической транс­формации.

Система адаптивного ответа – это индуцибельная антимута­генная система репа­рации. Облучение и мутагены в низких дозах вызывают снижение частоты мутаций при последующих воздей­ствиях. Например, облучение в дозе 12,5–50 рад может проявить защитный эффект в отношении последующего массированного об­лучения в дозах порядка 2–10³ рад. По мере инкубации в присут­ствии мутагена частота мутаций падает. Индукция системы проис­ходит при концентрациях мутагенов в 10–100 раз меньших, чем необходимые для проявления их мутагенного действия.

Синтез белков теплового шока (БТШ) возникает при субле­тальном температурном шоке. При этом наблюдается быстрое из­менение скорости синтеза большинства из 1000 белков, выявля­емых в клетках бактерий. Синтез некоторых белков прекращается, тогда как синтез БТШ усиливается более чем в 20 раз. У Е. coli вы­явлено 14 основных белков теплового шока. Ген теплового шока htp R необходим бактериям для роста при повы­шенной темпера­туре, например, для роста Е. coli при 42°С, но этот ген не нужен для роста при умеренной температуре. Независимо от продукта гена htp R тепловой шок приводит к угнетению синтеза белка. Синтез БТШ может быть вызван также воздействием этанола, УФ-облу­чения, вирусной инфекции.

Ответ на окислительный стресс. Клетки экспоненциально рас­тущей культуры S. typhimurium, обработанные в течение 1 ч 60 мМ перекисью водорода, приобретают устойчивость к 10 мМ перекиси; для необработанных клеток такая концентрация перекиси летальна. Как и ответы на другие стрессорные воздействия, система ответа на окислительный стресс находится под контролем специального гена – в данном случае оху R. Клетки, приобретшие устойчивость к перекиси, становятся устойчивыми и к тепловому шоку, однако тепловой шок не стимулирует устойчивости к перекисям. Среди белков, синтез которых стимулируется в условиях окислительного стресса, имеются и ферменты, участвующие в процессах репарации ДНК, поскольку окислители вызывают ее специфические повре­ждения.

После воздействия на бактерии экологических стрессов часть клеток становится подверженной метаболическому шоку, вызыва­ющему неспособность образовывать коло­нии на элективных средах. Избежавшие стресса клетки остаются нечувствительными.

Условия репарации повреждений. Поврежденные клетки, на­пример S. aureus, восстанавливаются в питательных средах при тем­пературе около 15°С, но не ниже 10°С. Процесс восстановления не мгновенен, а происходит поэтапно. Сохранение клеток от по­вреждений повышенной температурой и замораживания поддер­живается сложными питательными средами и составом или неко­торыми определенными их компонентами. Молоко обеспечивает большую сохранность, чем физиологический раствор или смесь аминокислот.

Показано, что травмированные высокой температурой споры С. perfringens приобре­тают повышенную чувствительность к анти­биотикам.

На питательных средах, содержащих пируват, получены большие количества клеток, поврежденных разнообразными агентами.

Поврежденные радиацией споры Clostridium botulinum не спо­собны расти при низкой температуре. Радиационное повреждение восстанавливается на специальных средах – телурит-полимиксиновом желточном агаре.

4.10. НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ

При резком изменении условий существования микроорга­низмы с помощью различных сенсорных и регуляторных меха­низмов перестраивают работу своего генетического аппарата, что позволяет им сохранять свою жизнеспособность. Но что проис­ходит, если крайне неблагоприятные условия сохраняются и ин­дукция стрессовых генов не в состоянии спасти клетку? До по­следнего времени считалось, что у грамотри­цательных бактерий следующей стадией является гибель клетки. Но в последние годы появилось достаточно экспериментальных данных, дающих осно­вание утверждать, что следующей «крайней мерой» в реакции грамотрицательных бактерий является переход в состояние «спячки», выражающейся во временной потере их воспроизводимости. У грамотрицательных бактерий морфологически дифференциро­ванные структурные образо­вания, подобные эндоспорам бацилл, не обнаружены, однако в настоящее время накоплено достаточно данных, свидетельствующих о способности неспорообразующих бактерий к длительному существованию во внешней среде в виде клеток со значительно сниженной метаболической активностью, не обнаруживаемых традиционными методами лабораторного культивирования на питательных средах. Подобное состояние покоя с временной потерей воспроизводимости у грамотрица­тельных бактерий, впервые обна­руженное в лаборатории R. Colwell, было предложено называть некультивируемым (НС), а сами бак­терии в таком состоянии некультивируемыми формами (НФ). В настоящее время способность к переходу в некультивируемое со­стояние обнаружена у множества бактерий.

Ниже представлен неполный перечень бактериальных видов, для которых к настоящему времени продемонстрирована способ­ность к переходу в HC: Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Pseudomonas putida, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteria, Vibrio chalerae и др.

Значимость некультивируемых форм бактерий. Феномен суще­ствования жизнеспо­собных бактерий в НС имеет серьезное зна­чение для санитарной микробиологии, поскольку установлено, что НФ патогенных, условно патогенных и токсигенных бактерий со­храняют свои вирулентные свойства. Прямые доказательства виру­лентности НФ бакте­рий получены при введении инокулята V. cholerae и энтеротоксигенных E.coli в перевя­занную петлю ки­шечника кролика. НФ Legionella Pneumophilia так же, как и нор­мальные вегетативные клетки, высевались из желточного мешка при их инокулировании в куриные эмбрионы. Надо отметить, что пассажи НФ через организм чувствительного живот­ного являются в большинстве случаев наилучшим способом рекультивации или вывода бактерий из НС. Вероятно, в этом случае бактерии попа­дают в условия, благоприятные для активного деления, а именно: оптимальная температура, богатая и сбалансированная смесь ро­стовых субстратов. Было показано, что введение культур двух виру­лентных штаммов S. typhimurium, находящихся в НС в течение трех месяцев, внутрибрюшинно беспородным мышам привело в одном случае к гибели животных, а во втором – к выделению культуры из их селезенки и печени. В обоих случаях штаммы были маркиро­ваны, что позволило легко отличить их от любого дикого штамма, случайно вызвавшего заболевание. Поскольку в данном случае не определяли точно дозу заражения НФ, довольно трудно оценить LD-50. Однако приблизительная оценка количества некульти­вируемых клеток методом ПЦР позволяет считать, что LD-50 в случае НФ несколько выше, чем при заражении культивируемыми клет­ками тех же штаммов. Это может свидетельствовать либо о неко­тором ослаблении вирулентных свойств, либо о том, что не все некультивируемые клетки сохраняют способность к рекультивации. Одновременное использование других лабораторных приемов ре­культивации НФ указанных штаммов, а именно: перенесение их в богатую питательную среду, повышение температуры инкубации до 37^°С, кратковременный тепловой шок, облучение слабыми до­зами УФ-света не дали положительных результатов. Аналогичные сведения рекультивации НФ разных видов бактерий в лабора­торных условиях имеются в научной литературе.

В настоящее время роль НФ в сохранении вирулентных штаммов в объектах внешней среды и пищевых продуктах продемонстриро­вана для возбудителей сапронозов – иерсиний и листерий.

В некоторых случаях результаты индикации микроорганизмов из пищевых продуктов показывают отсутствие какого-либо коли­чества колониеобразующих единиц (КОЕ) или их количество зна­чительно ниже, чем фактическое. Это можно расценить как ре­зультат метаболического повреждения клеток, как описано выше. Но некультивируемые клетки находятся в состоянии, которое от­личается от состояния поврежденных клеток. Метаболически по­врежденные клетки будут восстанавливаться при их культивиро­вании на неселективной среде, не содержащей ингибиторов, тогда как клетки жизнеспособные, но некультивируемые – нет.

Контрольные вопросы и задания

1. Перечислите и охарактеризуйте четыре метода исследования оценки общей численности микроорганизмов.
2. Назовите сущность и способы пробоподготовки.
3. Назовите сущность и способы гомогенизации. Опишите принцип действия гомогени­заторов.
4. Изложите сущность метода стандартного подсчета колоний (СПК).
5. Опишите работу спирального плоттера.
6. Поясните, как используются мембранные фильтры, в том числе путем введения флуоре­сцентного окрашивания.
7. Опишите методы микроскопического подсчета колоний: метод ага­ровых капелек, петри­фильмы.
8. В чем сущность методов наиболее вероятного числа и восстановления красителей?
9. Укажите особенности метода прямого микроскопического подсчета.
10. В чем сущность методов микробиологической оценки поверхностей: смывов, посевов отпечатков, «агаровых колбасок», липкой пленки, аэрозольной пушки?
11. Раскройте сущность и значимость репаративных свойств бактерий и некультивируемых форм бактерий.