Культивирование, выделение и идентификация анаэробных микро­организмов имеет ряд особенностей, высокая и стабильная информа­тивность микробиологических данных при их изучении возможна только при выполнении ряда условий. Среди них: 1) асепти­ческое взятие исследуемого материала и исключение контаминации; 2) применение адекватных технических приспособлений; 3) соблюдение газовых, температурных и вре­мен­ных параметров в процессе транспортиров­ки и изучения материала, содержащего анаэробы; 4) использование широкого перечня технических средств для культивирования анаэро­бов; 5) контроль качества проводимых лабораторных исследований [2]. Особен­ность культивирования анаэробных микроорганизмов состоит в том, что воздух нормаль­ной атмосферы замещается бескислородны­ми газами, а питательные среды предвари­тельно восстанавливаются. В качестве бескислородных газов используют азот, водород, углекислый газ или их смеси. Предварительное восстановление сред снижает их окислительно-восстановительный потенциал (Eh) до отрицательных ве­личин. Для роста анаэробов необходимы Eh от –0,120 до –0,060 эВ [91 ].

В последние годы для выделения анаэробов все активно используют методы строгой анаэробной техники. Без применения этих методов эти­ологическая диагностика многих анаэробов не может быть достоверной. Под строгой анаэробной техникой понимают комплекс технических приемов и бактериологических методов, направленных на поддержание жизнедеятельности анаэробных микроорганизмов и защиту от токси­ческого действия молекулярного кислорода. Это условие необходимо соблюдать на всех этапах изучения материала, содержащего анаэробы.

В пищевой микробиологии разработаны ГОСТы по выявлению и определению коли­чества анаэробных микроорганизмов: ГОСТ 10444.9–88 Продукты пищевые. Метод опре­де­ления Clostridium perfringens; ГОСТ 2510202–90 Молоко и молочные продукты. Методы содержания спор мезофильных анаэробных бактерий; ГОСТ 29185–91 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества сульфатредуцирующих клостри­дий.

Принадлежность выделенных колоний к анаэробным микроорга­низмам (как в фарма­цевтической, так и в пищевой микробиологии) определяется по морфологическим и биохимическим признакам.

В настоящее время для выявления анаэробных микроорганизмов Европейская фарма­копея предлагает тест, подтверждающий отсутствие патогенных Clostridium perfringens. Представлено два метода определения клостридий. Первый метод – качественный, приме­няется для препа­ратов, в которых необходимо провести анализ на их отсутствие. Второй метод – метод полуколичественного определения, предназначенный для препаратов, у которых содержание этих микроорганизмов является критерием качества [75].

Для выявления микроорганизма предложены следующие питатель­ные среды: улуч­шенная среда для клостридий (Reinforced medium for Clostridia), Колумбийский агар (Columbia Agar) и лактозо-сульфитная среда (Lactose monohydrate sulphite medium) (EP, 2005). Наиболее рас­пространенные среды для культивирования анаэробов: среда Шэдлера (Schaedlier Broth), агар Вилкенса-Чалгрена для селективного выде­ления анаэробов (Wilkins-Chalgren Anaerobic Agar), среды для общего определения анаэробных микроорганизмов (Anaerobic Agar, Anaerobic Fermentation Medium Base, Anaerobic Tryptone Soya Agar (скрининг анаэ­робов в косметических продуктах), Колумбийский агар (Columbia Blood Agar) [93], Тиогликолевая среда (Fluid Thioglycoliate medium), «Brucella Agar» Glucose Yeast Extract Agar (для культивирования и определе­ния количества Lactobacilli в фармацевтических препаратах), Lactose Sulphite Broth Base (для определения количества и культивирования Cl. perfringens), Reinforced Clostridial Agar (для культиви­рования и подсче­та Clostridia и других анаэробов), Saline Agar (для определения
a-ток­си­на в Cl. perfringens), Tryptose Cycloserine Azide Agar Base (для подсчета суль­фит редуцирующих анаэробов, особенно клостридий) (HiMedia, 2007).

7.7.1. Современные технические средства культивирования анаэробов

В настоящее время для выделения анаэробов активно используют методы строгой анаэробной техники. Без применения этих методов этиологическая диагностика заболе­ваний не может быть достоверной. Например, некоторые факультативные анаэробные микроорганизмы (кишечная палочка, стафилококки, стрептококки и др.) не всегда вы­растают в воздушной атмосфере при первичном посеве. Свойство ро­ста в атмосфере кисло­рода появляется у них после этапа анаэробного культивирования.

Для выделения, идентификации анаэробных микроорганизмов и определения их чувствительности к антибиотикам используют специ­альное оборудование: герметичные пробирки, анаэростаты, анаэробные перчаточные боксы, и другие анаэробные системы.

Для минимизации потери жизнеспособности анаэробов или чрезмерно быстрого роста аэробных микроорганизмов необходима быстрая транс­портировка образцов. Транспорт­ные системы чаще всего представляют собой транспортные контейнеры, не содержащие кислорода; используют пробирки с притертыми каучуковыми пробками с предварительно соз­данными в них анаэробными условиями. Для анаэробного транспорта применяют предварительно восстановленные анаэробные стерильные среды, которые поддерживают анаэробную окружающую среду [93, 94].

Существующие в настоящее время анаэростаты (микроанаэростаты) могут работать по принципу вакуумзамещения воздуха на бескис­лородную газовую смесь или генерации бескислородной газовой смеси после сжигания кислорода, что исключает потребность в вакуумсоздающих насосах. Анаэростаты обеспечивают создание бескислородной атмосферы (5–10 % СO2, 5–10% Н2, и 80–90% N2). Создание анаэ­робной атмосферы в значительной степени упрощается с помощью коммерческого газа (газовые пакеты, таблетированные генераторы Н2 и СO2). После загрузки анаэростата к реактивам добавляют воду и герметично закрывают прибор. В качестве генераторов водорода и углекислого газа используют натрия борогидрид и смесь натрия би­карбоната с лимонной кислотой. При большем содержании кислоро­да используют палладиевый катализатор. На катализатор губительное действие оказывают влага и примеси сероводорода. Реактивация ка­тализатора может быть осуществлена путем нагревания до 160–180 °С в течение 2 ч. Контроль за концентрацией кислорода во внутренней газовой среде осуществляют с помощью традиционных индикаторов анаэробиоза резазурина, метиленового синего или феносафранинового индикатора.

Основной недостаток анаэростатов заключается в том, что анаэроб­ные условия создаются при их полном заполнении, что увеличивает время экспозиции на воздухе проб, вложенных в систему первыми. Кроме того, в процессе исследования часть чашек приходится менять, что также допускает периодический контакт исследуемого материала с атмосферным кислородом.

Основным преимуществом культивирования анаэробных микро­организмов в анаэро­статах являются его простота и доступность для широкого применения в диагностических лабораториях.

Отечественная промышленность выпускает анаэростат АЭ-01. Он предназначен для культивирования группы облигатных анаэробов (бак­тероидов) и микроаэрофилов (кампило­бактеров).

Улучшенный вариант Oxoid AnaeroGen Compact System позволяет сохранять микробный рост любое время без изменения внутренней атмосферы, делая их идеальными для применения в клинических и индустриальных лабораториях для культивирования медленно ра­стущих анаэробных микроорганизмов (www.oxoid.com, 2007). Ком­панией Click-Clack Ltd была разработана система для поддержания устойчивого анаэробиоза, включающая стандартные анаэробные ге­нераторы окружающей среды и Click-Clack сосуды. Невысокая стои­мость, легкость использования, долговечность этих контейнеров га­рантируют их использование в качестве альтернативной анаэробной системы [119].

В основе метода Хангейта (в усовершенствованном виде известен как VPI-метод) лежит использование предварительно восстановленной анаэробной стерильной среды, помещенной в специальные пробирки, в которых возможно продувание бескислородной газовой смеси. При этом каждая пробирка становится анаэробной микрокамерой. В Ин­ституте микробиологии и вирусологии (Украина) была разработана мо­дификация пробирки Хангейта для культивирования факультативных и строгих анаэробов [95]. Одним из основных достоинств методики Хангейта является полное исключение контакта исследуемого матери­ала с кислородом воздуха на всех этапах работы. Однако по сравнению с анаэростатами и анаэробными камерами методика Хангейта является более сложной и трудоемкой, но методически оправданной при целевом изучении анаэробов кишечного происхождения.

Анаэробные камеры (перчаточные боксы) [96] являются самосто­ятельной системой, которая позволяет обрабатывать образцы и вы­полнять большинство бактериологических операций для изоляции и идентификации анаэробов без доступа кислорода. Основной состав­ной частью камер является корпус со встроенными в него мягкими перчатками, системой ввода материала, инкубатором и микроскопом. В зависимости от конструкции корпуса выделяют жесткие и гибкие ка­меры. Жесткие перчаточные боксы могут быть сделаны из таких мате­риалов, как сталь, акриловый пластик или стекловолокно (анаэробный перчаточный бокс).

Существенное достоинство использования анаэробных камер при изучении нормаль­ной микробиоты состоит в том, что на протяжении всего хода исследования, начиная от обработки образцов и заканчивая анализом посевов, полностью исключается контакт материала с кис­лородом воздуха.

Анаэробный поддерживающий сосуд является удобным и недоро­гим дополнением к анаэростату и анаэробной камере (перчаточному боксу), который позволяет осмотр культур и колоний с минималь­ным соприкосновением анаэробных бактерий с атмосфер­ным кисло­родом.

Анаэробные одноразовые полиэтиленовые пакеты содержат восстанав­ливающие агенты, могут служить для поддержания анаэробных твердых сред, особенно при маленьком количестве образцов. Существует не­сколько видов таких систем.

Pouch System (BBL) – отдельные системы, которые после добавле­ния воды образует анаэробную атмосферу, содержащую приблизитель­но 10% СO2. Gas-Pack EZ Gas Generating Container Systems – системы мультииспользования, которые производят атмосферу, подходящую для поддержания первичных изолятов и культивирования анаэробных микроорганизмов при помощи пакетиков, производящих газ внутри контейнеров для инкубации многоразового использования (www.bd.com, 2006-2007).

Характеристика колоний, данные микроскопии, окраска по Гра­му и испытания на аэротолерантность особенно важны для началь­ной предварительной идентификации. Успешно применяют системы идентификации, содержащие флуорогенный и хромогенный суб­страты [97].

Система экспресс-анализа II (Oxoid) включает специальный диа­пазон биохимических и хромогенных тестов для определения основ­ных специфических ферментов. Система BBL Crystal (BD) разработана для определения различных групп микроорганизмов до вида, в том числе для анаэробных микроорганизмов (BBL Crystal Anaerobe ID Kit). Системы идентификации микроорганизмов – микробиологический анализатор БиоТрак 4250, иден­ти­фикатор микроорганизмов Микро-Такс, БакТрак 4300, МикроТакс основаны на тестировании различных биохимических реакций с последующим считыванием резуль­татов и ав­томатической компьютерной обработкой с помощью программного обеспе­чения. Система БакТрак 4300 позволяет определять клостри­дии и лактобактерии. Хроматографическая система идентификации микроорганизмов Sherlock (MIDI) автома­тически определяет состав комплекса жирных кислот, входящих в клетки бактерий или грибов, а затем идентифицирует его, сравнивая с комплексами жирных кис­лот известных микроорганизмов, которые хранятся в обширной базе данных системы MIDI Sherlock.
VPI база данных Sherlock, содержащая сведения о более 800 видах организмов, может оказать значительную помощь в идентификации клинических анаэробных организмов. Компанией Миллипор (США) разработаны эспресс-методы анализа на определение микробного загрязнения в фармацевтических препа­ратах и пищевых продуктах, осно­ванные на биохимических реакциях, протекающих с участием аденозинтрифосфата (АТФ) живых клеток (си­стемы Стерискрин, Бевскрин, Микрокаунт, Микростар). Система
API/ID32 (BioMerieux) включает 15 систем идентификации, охватывающих все группы бактерий, с которыми сталкиваются лаборатории индустри­альной микробиологии. API система продолжает вводить новшества, регулярно обновляя базы данных этих систем идентификации, и делая доступными их в любое время через Интернет с помощью APIWEB. Комплексные лаборатории системы включают оборудование, реак­тивы и прог­раммное обеспечение для микробного генотипирования бактерий и грибов. Они базируются на технологии ПЦР и обеспечива­ют высокий и безопасный уровень автоматизации. Система позволяет определить более 300 видов основных микро­организмов, в том чис­ле анаэробов. Полуавтоматический анализатор «Mini-Api» исполь­зует в своем принципе фотометрическое считывание результатов биохимических, ферментативных и ассимиляционных тестов в лунках стрипов для идентификации. Экспресс анализатор является быстрой панелью для определения анаэробов.

Использование быстрых микробиологических методов в фармацев­тических лаборато­риях улучшило анализ проверки качества воды, из­делий, сырья и увеличило анти­бак­те­ри­альное испытание эффективно­сти фармацевтических препаратов. АТР биолюмине­сценция, импеданс (волновое сопротивление), прямой подсчет жизнеспособных микро­организмов и цитометрия позволяют определять содержание микробов в данном фармацевтическом образце, в то время как ПЦР и иммуноло­гические исследования позволяют обнаружить присутствие определен­ных микробных видов. Сокращение време­ни при анализе, например, от 30 часов до 90 минут, при использовании быстрых методов, дает воз­можность фармацевтической промышленности приблизить процессы контроля к режиму реального времени [100,101]. В Японии разработан метод быстрого определения микробного загрязнения фитопрепаратов путем флуоресцентного окрашивания. Подсчет бактериальных клеток в фитопрепаратах флуоресцентным методом занимает менее 1 часа. Та­ким образом, данный метод может быть применен для быстрого микро­биологического контроля препаратов, содержащих ЛРС [98]. Показано, что определение кислой фосфатазы существенно упрощает анализ на Cl. perfringens в образцах воды и уменьшает время анализа для определения количества микроорганизмов.