Современные эволюционные теории формирования механизмов патогенности бакте­рий, обеспечивающих взаимодействие возбудителя со средой обитания в соот­ветствующих экологических нишах и сооб­щающих устойчивость к неблагоприятным условиям существования, являются основой для разработки новых подходов к изучению поведе­ния бактериальных патогенов под воздействием физико-химических, техноло­гических и иных условий производства и хранения продуктов.

Наиболее признанной в настоящее время теорией возникновения новых свойств и генетических систем, регулирующих экспрессию фак­торов патогенности бактерий, является концепция стрессовых ответов микроорганизмов на химические, физические и биологические воз­действия. Имеются многочисленные сообщения о роли так называемых стрессовых белков, синтезируемых бактериями под воздействием раз­личных неблаго­приятных факторов: температуры, pH и окислитель­но-восстановительного потенциала среды, осмотического давления, дефицита нутриентов и др. Предполагается, что регуляция синтеза стрессовых белков происходит на уровне транскрипции, при этом суще­ствуют основной тип регуляции, общий для различных типов стрессов, и индивидуальный – специфичный для того или иного стрессового сигнала [73].

В процессе производства и хранения лекарственных препаратов микроорганизмы подвергаются внешним воздействия, которые форми­руют соответствующие стрессовые ответы как на уровне повреждения клеточных оболочек, так и путем изменений ДНК, мембран и энзимов микробной клетки. Наиболее сильным стрессом считают нагревание, которое не только влияет на термотолерантность, но может вызывать устойчивость к другим стрессовым факторам. Стресс также может воз­никать под влиянием низких температур [72, 118].

Облучение, широко используемое при стерилизации, также вызы­вает стрессовый ответ, который индуцирует не только толерантность к этому воздействию, но формирует устойчивость к другим видам об­работки сырья и продукции.

Кислотный, щелочной или осмотические стрессы способствуют по­явлению более устойчивых популяций микроорганизмов и также ин­дуцируют толерантность к сопутству­ющим технологическим воздей­ствиям: например, осмотический стресс сопровождается появлением термотолерантных форм бактерий.

Влияние неблагоприятных воздействий внешней среды на жизненно важные функции бактериальной клетки и формирование стрессового ответа происходят на разных регуля­торных уровнях. Это может приво­дить к синтезу и экспрессии факторов патогенности или подавлению защитных механизмов бактерий вплоть до перехода их в состояние, при котором сохраняется метаболическая активность, но утрачивает­ся способность к непрерывному клеточному делению, необходимому для роста в питательных средах. Этот феномен известен под названием «некультивируемое состояние» (НС) или «некульти­вируемые формы» (НФ). При смене неблагоприятных условий существования клетки мо­гут быть рекультивированы, т. е. вновь обрести способность к размно­жению на привыч­ных для них средах. Способность патогенов к пере­ходу в НС имеет большое значение, поскольку обеспечивает им выжи­ваемость в неблагоприятных условиях внешней среды вне организма хозяина в межэпидемиологические периоды.

Нарушение основ генетического контроля состояния бактериальной клетки в условиях стрессовых воздействий под влиянием химических, физических и биологических стресс­совых агентов происходит на хро­мосомном и плазмидном уровнях. Многочисленные стрессы приво­дят к повреждению спирали ДНК, и при соответствующем уровне по­вреждающих эффектов наступает гибель бактериальной клетки. Менее интенсивные воздействия обусловливают появление мутаций на этапе дупликации молекул ДНК. Низкие дозы стрессовых воздействий, на­пример, щадящие режимы нагревания или охлаждения, приводят к ингибированию или прекращению белкового синтеза за счет нарушения функций рибосомальных транспортных или матричных РНК.

На клеточном и молекулярном уровнях стрессовые эффекты про­являются в повыше­нии проницаемости наружной клеточной мембраны за счет снижения уровня липополи­сахаридов и нарушения барьерных функций, вследствие чего в клетку могут проникать детергенты, бактериоцины и другие гидрофобные молекулы. Многие стрессорные агенты могут влиять на функционирование цитоплазматической мембраны, в том числе детер­генты, низин и другие, под воздействием которых грамположительные бактерии также становятся восприимчивыми к этим агентам без дополнительных повреждающих эффек­тов, напри­мер, тепловой обработки.

При некоторых стрессовых аффектах нарушается подвижность ми­кроорганизмов в результате воздействия на флагеллярную систему или пили. Эти структуры наиболее чувствительны к рН среды и разности давлений.

Наглядно стрессовые состояния отражаются на процессах кле­точного деления прокариот. При умеренном воздействии стрессовых факторов происходит клеточная филаментация с разделением ядер без септирования клеточных перегородок. Это особен­но важно учитывать при микробиологическом анализе, поскольку присутствие в пробе филаментных клеток грамотрицательных бактерий может не отражать уровней реальной контаминации; изменение условий культивирования и попадание бактерий в нестрессовое состояние приводит к резкому возрастанию числа жизнеспособных микроорганизмов.

Клеточные ферменты и другие эссенциальные белки могут инактивироваться при стрессах. Основным объектом повреждения клетки при стрессах является ДНК, тем не менее деструкция протеинов становится значимым фактором в оценке последствий стрессовых состояний для жизнедеятельности бактерий [74].

Многие стрессы индуцируют образование протеаз, атакующих спец­ифические группы белков, или имеют двойную функцию восстанов­ления либо расщепления протеинов. Специфическая активность этих протеаз направлена в основном на поврежденные стрессом белки или группы протеинов, которые не требуются клетке в фазе активного роста.

Стрессовая толерантность возникает в основном в стационарной фазе роста микроорганизмов и сопровождается усилением специфиче­ского RpoS-фактора, инициирующего транскрипцию большой группы генов, что приводит к увеличению числа толерантных протеинов. В log-фазе опероны clpP, сlрХ полностью включаются и активируют С1рХР-протеазу (Li С. et а1., 2000); СlpХР-протеаза не только расщепляет RpoS, но выполняет функцию восстановления поврежденных протеинов.

В целом формирование двойственной функции стрессовых белков и их роль в меха­низ­мах адаптации бактериальных патогенов к неблаго­приятным условиям внешней среды весьма сложны и многообразны, а потому требуют подробного изучения на генетическом и молекуляр­ном уровнях.

Важную роль в развитии стрессовой толерантности играет прикре­пление микроорга­низмов к поверхностям. Бактериальные клетки, при­крепленные к поверх­ностям, более толерантны к различным химиче­ским, физическим и биологическим воздействиям. Если бактерии при­креплены к частицам в природных водоемах, то они становятся более устойчивыми к потенциально летальным стрессовым воздействиям при очистке или стерилизации воды. Выжившие в этих условиях патогены могут с водой инфицировать сырье или продукты на разных стадиях технологических процессов. В природных условиях и при санитарной обработке воды и оборудования резистентность этих организ­мов может формироваться под влиянием температурных воздействий, кислот, ще­лочей, хлора, бактериофагов, колицинов, акрилатов, ионов металлов.

Наиболее высоким уровнем регуляции взаимодействия бактерий является феномен чувства кворума, который отчетливо проявляется и при формировании стрессовых отве­тов бактерий на изменение со­стояния окружающей среды. Механизм реализации чувства кворума заключается в продукции микроорганизмами внеклеточных сигналь­ных молекул – феромонов – и генерации ответной реакции. Чувство кворума отчетливо проявляется при синтезе факторов вирулентности: когда концентрация клеток культуры в популяции достигает высокой плотности, индуцируется синтез и секреция токсичных метаболитов. При высокой концентрации клеток этот феномен может проявляться путем взаимо­действия с внутриклеточными сенсорами и включения системы транскрипции на рибо­сомаль­ной РНК с последующим син­тезом факторов вирулентности.

При оценке результатов микробиологического анализа следует учитывать существо­вание некультивируемых форм бактерий, которые способны выходить из дремлющего состояния и инициировать инфек­ционный процесс. Этим свойством может обладать большинство эмерджентных бактериальных патогенов, вызывающих вспышки инфекций или токсикоинфекций.

Выявление некультивируемых форм (НФ) требует применения спе­циальных методов анализа, подтверждающих жизнеспособность бак­терий независимо от их возможности формировать колонии на селек­тивных и неселективных средах. Показано, что при постоянном уровне общего числа микробных клеток количество колониеобразующих бак­терий снижается, а основная часть микробной популяции переходит в метаболически неактивное состояние.

В настоящее время некоторые лаборатории используют методы определения жизнеспособности бактерий, основанные на биохимиче­ских реакциях, подтверждающих наличие метаболических процессов в дремлющих клетках, а также методы флуориметрии и ПЦР.

Показана эпидемиологическая значимость НФ и их роль в сохране­нии вирулентных штаммов возбудителей сапрозонов в объектах вешней среды в межэпидемиологические и межэпизоотические периоды.

Переход бактерий в некультивируемое состояние не является след­ствием воздействия ксенобиотиков (антибиотиков, хлора или других химических агентов), как правило, индукция НФ состояния происхо­дит под влиянием одного или нескольких природных стрессов, таких как дефицит нутриентов, резкие изменения температуры окружающей среды, повышение осмотического давления, воздействие солнечного света и др. Многие из перечисленных воздействий применяются в про­изводстве для снижения бактериальной контаминации и консервации. Скорость перехода в некультивируемое состояние на такие стрессы за­висит от физиологического возраста культур, а время некультивируемого состояния может колебаться от нескольких часов до месяцев. При этом длительность пребывания в некультивируемой форме варьирует у разных видов бактерий и даже среди штаммов одного вида.

Число бактериальных родов и видов, для которых описана способ­ность к переходу в некультивируемые формы, весьма значительно (бо­лее 60) и включает большое количество условно-патогенных и патоген­ных микроорганизмов-контаминантов, в том числе энтеро­геморрагические Е. coli, Salmonella и Shigella spp., Pseudomonas spp., Vibrio spp. и др.

Клетки, переходящие в некультивируемое состояние, приостанав­ливаются в развитии вследствие прекращения деления. Основные метаболические изменения, которые проис­хо­дят в клетке, включают сокращение транспорта нутриентов и дыхательных функций, синтеза макромолекул (белков, ДНК, РНК); при этом не происходит резкого снижения уровня АТФ, характерного для отмирающих клеток. Отме­чены изменения в составе пептидогликанов клеточной стенки, а также наличие или отсутствие плазмид, играющих определенную роль в фор­мировании НФ.

Выход из некультивируемого состояния происходит у разных ви­дов бактерий неоди­наково и связан с воздействием факторов внешней среды, условий культивирования, наличием специфических автоиндук­торов (ферриоксамина Е, сидерофоров, антиокси­дан­тов). Некоторые авторы подчеркивают протективную роль белков теплового шока в про­цессе возвращения бактерий в культивируемое активное состояние.

Важным аспектом проблемы присутствия некультивируемых форм бактерий в фармацевтической продукции является сохранение ими ви­рулентных свойств и способ­ности к синтезу факторов патогенности. Несмотря на то что некультивируемые клетки проявляют экстремаль­но низкую метаболическую активность, они сохраняют способность к транскрипции генов, что может сопровождаться продукцией одного или более виру­лентных факторов.

Анализ данных литературы о некультивируемых формах эмерджентных патогенов пока­зывает, что регистрируемые при вспышках пищевых инфекций низкие уровни возбу­дителей могут отражать присутствие в рутинно исследуемых образцах лишь незначи­тельной части популя­ции, тогда как основная масса клеток находится в некультивируемой форме и не выявляется традиционными методами, сохраняя способ­ность восстанав­ливаться при попадании в благоприятные условия и вызывать инфекционный процесс в макроорганизме. Феномен не­культивируемого состояния бактерий в определенной степе­ни может объяснять возникающие затруднения и ошибки при расследовании эпидемии­ческих вспышек заболеваний. Кроме того, в силу вышеназ­ванных обстоятельств не удается адекватное воспроизведение инфек­ционного процесса при экспериментальном заражении низкими дозами возбудителя, что может быть продемонстрировано на ряде эмерджентных патогенов.

В современных производственных условиях на предприятиях ми­кробные контаминанты сырья и готовые продукты подвергаются раз­нообразным внешним воздействиям (химическое действие консерван­тов и стабилизаторов, антиоксидантов, дезинфицирующих веществ, температурные и осмотические режимы, УФ-обработка и другие виды облучения), под влиянием которых может происходить как переход части бактериальных клеток в некультивируемые формы, так и выход из этого неактивного состояния потенциально патогенных видов бак­терий, способных вызывать заболевания.