5.4.1. Видовой состав микофлоры сырья

Состав микробиоты включает многие виды бактерий, грибов, ви­русов. Он зависит от вида растения, возраста, высоты стебля, типа по­чвы, условий произрастания. При повышении влажности численность эпифитных микроорганизмов возрастает, при пони­жении влажности – уменьшается.

Отрицательными последствиями использования больными контаминированного ЛРС могут быть снижение или полная утрата терапев­тической ценности, развитие аллергии­ческих реакций, возникновение инфекционных заболеваний, попадание токсических продуктов. Сре­ди последних особенно опасны токсины грибов (Fusarium, Penicillium, Aspergillus и др.), вызывающие микотоксикозы. Чтобы ограничить риск отрицательных последствий попадания микробной контаминации сы­рья и вспомогательных материалов, введены фармакопейные требова­ния к микробиологической чистоте этих объектов фармацевтического производства (табл. 5).

Таблица 5

Видовой состав микофлоры, выделенной из НЛС и сырья

Категория ЛС

Виды грибов-контаминантов ЛС

1. Препараты из сырья природного происхождения

A. flavus, A. Candidus, A. lanosum, A. flavipes, A. ventii, Р. capsu­latum, P. fellutanum, P. tardum, P. steckii, P. raciborskii, P. gorlenkoanum, P. purpurogenum, P. chermesium, P. herqei, P. wakzmanii, P. verrucosum, Rhodotorula sp., Pichia sp., Cryptococcus laurentii, Aureobasidium pullulans, Alternaria consortiall, Mucor sp., M. strictus, M. racemosus, Rhizopus sp., Botrytis cinerea

2. Лекарственное
растительное
сырье

A. orysae, A. niger, A. fumigatus, A. Candidus, A. chevalieri, A, ustus, A. flavus, P. roseo-purpureum, P. verrucosum, P. meleagrinum, P. asperosporum, P. raciborskii, P. frequentans, P. steckii, P. decumbens, P. diversum, Trichoderma sp., T. hamatum, Mucor sp., M. racemosus, Al. consortial, Rhizopus sp., Cladosporium transchelii

При использовании контаминированного лекарственного расти­тельного сырья (ЛРС) микробы-загрязнители попадают в субстанцию и готовую лекарственную форму. Особое значение имеет использова­ние такого ЛРС для приготовления водных вытяжек: настоев, отваров и других лекарственных форм в домашних условиях.

Медицинские растения содержат большое количество микроор­ганизмов с различными отдельными свойствами и со значительными различиями относительно качественных аспектов. На спектр микро­организмов влияют условия внешней среды в данном регионе, нали­чие источников живой и неживой природы. Микроорганизмы легко передаются через воздух и с почвой (см. рис. 10). Свойства постоянства и неизменности микрофлоры растений также определены внешними условиями, которые вызваны естественными, сельскохозяйственными, экологическими и техногенными факторами (см. табл. 5). Хотя бакте­риальные эндоспоры и грибковые конидии могут быть расценены как две домини­рующие группы загрязнителей, связанных с лекарственны­ми растениями, на растении и внутри него может находиться широкое разнообразие бактериальных, грибковых клеток и вирусов. Среди этих микроорганизмов могут также присутствовать фитопатогенные микро­организмы, что снижает качество и ограничивает использование этих растений. Кроме того, по аналогии со специями и травами, использу­емыми в пище, не может быть исключен факт присутствия в некото­рых препаратах загрязнений от грызунов, насекомых и неорганических источников (например, камеди). Впервые при изучении растительно-микробных взаимодействий Антон де Бари) ввел в биологию понятие симбиоз, определив его как «длительное сосуществование разноимен­ных организмов».

Выбор микроорганизмов, нормирование которых предусмотрено законодательно (ГОСТы, Фармакопея и др.), определяется их опасно­стью для здоровья населения и способностью служить критерием оцен­ки гигиенического состояния производства, предусмотренного GMP. Этот выбор достаточно ограничен по экономическим сообра­же­ниям, но в настоящее время признан достаточным для получения результатов, адекватно отражающих качество продукции по микробиологическим показателям, и со временем может быть расширен. Например, суще­ствует мнение, что в воде, используемой при изготовлении нестериль­ных офтальмологических препаратов должны отсутствовать псевдо­монады, не только Р. aeruginisa, но и Р. (Burkholderia) cepacia. Однако сущее­ствующие методы анализа исключают выделение и идентифика­цию последнего вида. В фармацевтической микробиологии обсуждается вопрос о некультивируемых видах микро­организмов, определение кото­рых в настоящее время не предусмотрено. Известно значение бактери­альной биопленки, вызывающей загрязнение системы водоснабжения и служащей резервуаром патогенных бактерий, попадающих в питьевую воду, системы гемодиализа, госпитальные системы водоснабжения и др. В отношении экологии водо­снаб­жения фармацевтического производ­ства этот вопрос пока не рассматривается при необходимости нужно будет изменить критерии микробиологической оценки качества воды.

Далее будут рассмотрены особенности микроорганизмов, содержа­ние которых регламентировано для продукции фармацевтической про­мышленности, а также некоторые микроорганизмы, близкие по своим свойствам регламентированным видам.

5.4.2. Грамотрицательные аэробные (микроаэрофильные) палочки

Род Pseudomonas. Прямые или слегка изогнутые, но не спиральные подвижные палочки 0,5–1,0×1,5–5,0 мкм (полярные жгутики). Они представляют собой аэробные бактерии, которые способны к ана­эробному дыханию с использованием нитрата в качес­тве акцептора электронов. Некоторые виды – факультативные автотрофы. Широко рас­пространены в природе. Некоторые виды патогенны для челове­ка, животных и расте­ний. В настоящее время на основании гомологии ДНК некоторые виды, относившиеся к роду Pseudomonas, выделены в род Burkholderia (В. mallei, В. pseudomonas, В. cepacia, род Brevundimonas (В. diminuta) и др.).

Pseudomonas aeruginosa – основной возбудитель гнойно-воспа­лительных процессов, особенно в условиях стационаров, описаны и вспышки токсикоинфекций вследствие употребления пищевых продуктов (мясо, рыба), контаминированных Pseudomonas aeruginosa (Ps. Aeruginosa).

Ps. Aeruginosa строгий аэроб растет на простых питательных средах в широком диапа­зо­не температур (4–42 °С), оптимальная температура для роста 37 °С.

5.4.3. Факультативно анаэробные грамотрицательные палочки

Семейство Enterobacteriaceae

Семейство Enterobacteriaceae представляют собой прямые палочки, подвижные (пере­трихи) или неподвижные, оксидазоотрицательные и каталозоположительные, за исклю­чением Shigella dysenteriae, распростра­нены повсеместно. Ряд видов вызывает желудочно-кишечные и другие заболевания, оппортунистические и госпитальные инфекции (Salmo­nella, Shigella, Klebsiella, Yersinia, Proteus, Morganella, Providencia, и др.).

Для определения наиболее вероятного числа (НВЧ) энтеробактерий гомогенат разводят в серийно селективной среде № 3. В три про­бирки с 10 мл среды № 3 вносят разведения гомогената. Инкубируют при 32–35 °С 24-48 ч. При наличии роста делают высев на среду Эндо и после термостатирования отмечают появление типичных колоний. НВЧ определяют по таблице.

Род Citrobacter. Прямые палочки 1×2–6 мкм, одиночные и в парах, обычно подвиж­ные. Факультативные анаэробы. Обнаружены в почве, воде и пищевых продуктах, входят в состав нормальной микробиоты кишечника. Штаммы определенных серогрупп вызывают гастроэнтери­ты и пищевые токсикоинфекций, оппортунистические и госпи­таль­ные инфекции.

Род Enterobacter. Прямые подвижные.палочки 0,6–1,0×0,2-3,0 мкм. Оптимальный диапазон температуры 30–37 °С. Вызывает внутрибольничные и оппортунистические инфекции.

Род Escherichia. Прямые палочки 1,1–1,5×2,0–6,0 мкм одиночные или в парах. Для многих штаммов характерны капсулы и микрокапсулы.

Виды рода Escherichia различаются по подвижности и биохимиче­ской активности.

Escherichia coli и колиформные бактерии. Е. coli – постоянный оби­татель и важный представитель нормальной микробиоты кишечника человека и теплокровных животных. Большая часть штаммов Е. coli не считается патогенной, однако вид включает условно-патогенные и патогенные штаммы. Последние индуцируют токсины и вызывают тяжелые заболевания.

В 1892 г. было предложено использовать Е. coli как санитарно-показательный микро­организм. По фенотипическим признакам Е. coli имеет много общего с другими родами сем. Enterobacteriaceae (Klebsiella, Citrobacter и Enterobacter). Поэтому было предложено эту группу бактерий называть колиформными. Этот термин не является таксономическим, но служит рабочим определением группы грамотрицательных факуль­тативно анаэробных палочковидных бактерий, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа за 48 ч культивирования при 35 °С.

Некоторые колиформные бактерии способны обитать во внешней среде. Поэтому группу санитарно-показательных колиформных бак­терий было предложено называть фекальными колиформами. На ос­новании работ Eijkman (1904) фекальные колиформы рассматривают как представителей общих колиформ, которые растут и ферментируют лактозу при повышенной температуре инкубации (термотолерантные колиформы). Эта группа включает в основном Е. coli; однако виды Klebsiella также способны ферментировать лактозу при температуре 44–45 °С. Для дифференциации Е. coli и Klebsiella spp. используют спе­циальные методы.

Показатель общего числа колиформ используют в качестве ин­дикатора санитарного состояния воды или как основной индикатор санитарного состояния производства в пищевой и фармацевтической промышленности; показатель термотолерантных колиформ – для ха­рактеристики санитарного состояния воды; Е. coli – показатель свежего фекаль­ного загрязнения.

Род Klebsiella. Прямые палочки 0,3–1,0×0,6–6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Неподвижные. Для К. Pneumonia и К. Oxytoca характерна массивная полисаха­ридная капсула, определяю­щая образование крупных мукоидных колоний. Известно более 80 капсульных антигенов, используемых для серотипирования клебсиелл. Ши­роко рас­про­странены, встречаются в почве, воде, на фруктах и овощах.

Тепературные границы роста 12–43 °С, оптимум рН 7,2.

Вызывают оппортунистические и внутрибольничные инфекции.

Род Morganella. Прямые палочки 0,6–0,7×1,0–1,7 мкм. Подвижны (перитрих). Роение отсутствует. Выделяется из фекалий млекопитаю­щих. Вызывает оппортунистические инфекции.

Род Proteus. Прямые палочки 0,4–0,8x1–3 мкм. Подвижны (пери­трих). У большинства штаммов имеет место роение с периодическими циклами миграции, приводящей к образованию концентрических зон или распространению в виде однородной пленки по влажной поверх­ности среды. Встречаются в кишечнике позвоночных, в почве, навозе, загрязненных водах. Вызывают инфекции мочевых путей, вторичные поражения, часто при ожогах.

Род Providenсia. Прямые палочки 0,6–0,8×1,5–2,5 мкм, подвижные (перитрих), роение отсутствует. Вызывают желудочно-кишечные рас­стройства, инфекции мочевых путей, вторичные поражения при ранах и ожогах.

Род Salmonella. Прямые палочки 0,7–1,5×2–5 мкм. Подвижны (пе­ритрих). Встречаются у человека и животных, в пищевых продуктах и в природной среде. Вызывают брюшной тиф, кишечные инфекции, токсикоинфекции, септицемию.

Температурный оптимум 35–37 °С. Диапазон pH 4,1–9,0 (оптимум 7,2–7,4). Рост подавляют или ограничивают высокие концентрации соли и сахара.

5.4.4. Определение сальмонелл в лекарственных препаратах и сырье (ГФ ХI)

Активирование роста энтеробактерий перед посевом в накопительную среду.
10 г (мл) пробы вносят в лактозный бульон (среда № 11). Инку­бируют при (32,5±2,5) °С 2–5 ч.

Селективное обогащение. 10 мл инокулума со среды № 11 перено­сят в 100 мл нако­пительной среды № 3. Инкубируют при (32,5±2,5) °С 18–24 ч. При наличии роста 1 мл обогащенной культуры на среде № 3 вносят в пробирку с 10 мл селективной селенитовой среды № 12 для накопления сальмонелл. Инкубируют при такой же температуре 16–18 ч. Далее делают пересев петлей на висмут-сульфитный агар (среда № 5). Инкубируют при (32,5±2,5) °С 14–18 ч. На этой среде сальмо­неллы образуют черные колонии с металличес­ким блеском, среда под колонией окрашивается в черный цвет.

Подтверждающие тесты: окрашивание по Граму, посев на трехсахарный агар; резуль­тат учитывают, как описано выше. Тест на цитохромоксидазу (–).

Род Serratia. Прямые палочки 0,5–0,8×0,9–2,0 мкм. Обычно под­вижные (перитрих). Некоторые виды образуют розово-красный водонерастворимый пигмент продигнозин. Распространены повсеместно (вода, почва, растения). S. marcescens вызывает оппортуни­стические инфекции – септицемию, инфекции мочевых путей, мастит у коров.

Род Shigella. Прямые палочки, неподвижны. По морфологическим признакам не отличаются от других представителей сем. Enterobacte­riaceae. Вызывают дизентерию и другие шигеллезы – заболевания, передающиеся с водой и пищей, распространенные среди приматов, включая человека.

Род Yersinia. Прямые палочки 0,5–0,8×1–3 мкм, приобретающие иногда сферическую форму. Подвижные (перитрих) или неподвижные (Y. pestis). Подвижность и метаболизм зависят от температуры. Температурные пределы роста – 0–39 °С, для Y. pestis – до 45 °С; оптимум роста 28–30 °С; оптимум pH 6,9-7,2. Широко распространены в природе, паразиты животных и человека.

  1. pestis – возбудитель чумы, особо опасной карантинной инфекции.
  2. enterocolitica и подобные ей бактерии часто обнаруживаются в почве, воде, пище­вых продуктах и выделяются от животных, пато­генны для человека. Источник заражения человека – контаминированные пищевые продукты, нехлорированная вода, экскременты животных. Микроорганизм способен размножаться в условиях холо­дильника, что повышает роль пищевых продуктов в распространении инфекции.

Род Vibrio. Палочки, прямые или имеющие один ригидный завиток. Подвижны, при росте на жидкой среде образуют полярный жгутик. Вы­зывают холеру и холероподобные заболевания. Источник инфекции – вода, пищевые продукты.

5.4.5. Грамположительные кокки

У большинства организмов этой группы клетки сферические, иногда овальные, всегда четко грамположительные, неподвижные.

Род Enterococcus. Род Enterococcus представлен видами, ранее отно­симыми к роду Streptococcus (S. faecalis, S.faecium, S. avium, S. gallinarium и др.).

Клетки сферические или овальные 0,6–2×6–2,5 мкм в парах или (в жидкой среде) коротких цепочках. Факультативные анаэробы. Сбраживают разнообразные углеводы с образованием лактата. Нужда­ются в сложных питательных средах. Каталазоотри­ца­тельные. Растут в пределах температуры 10–45 °С, оптимальная температура 37 °С. Ра­стут при pH 9,6, концентрации NaCl 6,5 %, желчи – 40 %. Как правило, относятся к сероло­гической группе Lancefield D. Широко распростра­нены в природе, обитают в кишечнике позвоночных, иногда вызывают пиогенные инфекции.

Все виды и варианты энтерококков признаны санитарно-показательными микроорга­низмами и отвечают предъявляемым к ним требованиям. Это постоянные обитатели кишечника несмотря на то, что их количество меньше, чем Е. coli; они не способны размножаться во внешней среде (точнее могут размножаться при содержании органи­ческих веществ 375 мкг/л и температуре равной 20 °С и выше). Не про­являют выраженной изменчивости во внешней среде, что облегчает их распознавание и не имеют аналогов во внешней среде. Отмирают во внешней среде значительно раньше, чем Е. coli, поэтому всегда сви­детельствуют о свежем фекальном загрязнении. Самым главным до­стоинством является их устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям. Они устойчивы к нагреванию до 65 °С в течение 30 мин, что делает их показателем качества режима пасте­ризации. Энтерококки устойчивы к высоким концентрациям NaCl (6,5–17 %), что позво­ляет использовать их при анализе морской воды. Энтерококки устойчивы в диапа­зоне рН 3–12, что можно использовать при анализе стоков кис­лого и щелочного характера.

В настоящее время количественная энтерококкометрия принята международным стандартом по воде как дополнительный показатель фекального загрязнения, а при выявлении атипичных – главным ме­тодом выявления фекального загрязнения.

Род Staphylococcus. Повсеместно распространенные микроорганиз­мы, чувствительны к нагреванию и действию биоцидов. Поэтому их присутствие в помещении свидетельствует о плохом санитарном со­стоянии.

Стафилококки образуют клетки диаметром 0,5–1,5 мкм, располага­ются в мазках одиночно, парами или гроздьями. Факультативные анаэ­робы, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, чувствительны к действию лизостафина, но не лизоцима, растут на средах с 5–10 % NaCl. На плотных средах образуют мутные, круглые колонии желтого, кремового или оранжевого цвета. На жидких средах вызывают помут­нения и рыхлый осадок. Разжижают желатин, образуют H2S. Восста­навливают нитраты до нитритов.

Staphylococcus aureus вызывает разнообразные гнойно-септические инфекции и пищевые отравления. S.aureus коагулирует плазму, что яв­ляется критерием для иденти­фикации этого вида.

Род Streptococcus. Клетки сферические или овальные, диаметром 0,5–2,0 мкм, при росте в жидкой среде в парах или цепочками. Фа­культативные анаэробы. Нуждаются для роста в богатых питательных средах, иногда 5 % СO2. При брожении образуют лактат, но не газ. Ка­талазоотрицательные. Вызывают гемолиз эритроцитов. Паразиты мле­копита­ющих. Некоторые виды патогенны для человека и животных. Выделяют 17 серогрупп стрептококков. Основными возбудителями заболеваний человека являются стрептококки группы А, большинство штаммов которых относится к виду S. pyogenes.

5.4.6. Грамположительные палочки, образующие эндоспоры

Род Bacillus. Грамположительные прямые палочки 0,6–2,0×0,6–2,5 мкм с закруглен­ными или обрубленными концами, часто в парах или цепочках, перитрихи. Эндоспоры овальные или цилиндрические, чув­ствительны к неблагоприятным воздействиям. Катала­зо­поло­жительные. Обнаруживаются в разнообразных местообитаниях. Некоторые виды патогенны для человека и животных.

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы. Основной источник инфекции – больные животные, которые заражаются при поедании инфицированного корма.

Bacillus cereus вызывает спорадические случаи пищевых отравлений у человека. Морфологически сходна с В. anthracis, но обладает подвиж­ностью.

Род Clostridium. Грамположительные подвижные (перитрихи) или неподвижные палочки, образуют округлые или овальные эндоспоры, придающие клетке веретено­образную форму. Вызывают маслянокислое брожение, восстанавливают сульфаты до сульфитов. Строгие анаэробы или аэротолерантные. Виды рода Clostridium обитают в почве, на дне водоемов, в кишечнике человека и животных. Некоторые виды патоген­ны, вызывают травматические клостродиозы (газовая гангрена, столб­няк), и энтеральные клостродиозы (пищевая токсикоинфекция и др.). Род включает более 80 видов, при различных заболеваниях выделяют около 20 видов. Cl. perfringens и Cl. sporogenes относят к санитарно-показательным организмам. Их присутствие во внешней среде (вода, почва) свидетельствует о фекальном загрязнении.

Сl. perfringens обнаруживается в кишечнике 25–35 % здоровых лиц. При опреде­ленных условиях вызывают газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции. По способ­ности образовывать 4 главных токсина вид разделяют на 6 сероваров. Основной возбу­дитель заболеваний че­ловека – С. perfringens типа А (С. welchii). Вегетативные клетки – непод­вижные короткие палочки с обрубленными концами 0,6–2,0×0,6–2,5 мкм. Под влиянием факторов внешней среды морфология может ва­рьироваться. In vitro образуют капсулы. Споры крупные, овальные, расположены центрально или субтерминально. Морфология колоний значительно варьируется в зависимости от условий выращивания.

Clostridium botulinum – возбудитель ботулизма, тяжелого заболева­ния. Обуслов­ленного нейротоксическим действием ботулинического токсина. Естественный резервуар инфекции – почва, придонный ил. Заболевание обычно возникает при использовании пищевых про­дуктов, в которых микроорганизм развивается в анаэробных условия, чаще всего – в консервах. По антигенному типу токсины подразделяют на группы, Сl. botulinum дифференцируется на группы на основании культуральных и биохимических свойств.

Вегетативные клетки – палочки с закругленными концами 4–8×0,6–0,8 мкм. Пере­трихи. Эндоспоры располагаются терминально и суб­терминально. Строгие анаэробы. Молодые культуры по Граму окра­шиваются положительно, 4–5 суточные – отрицательно. На кровяном агаре с глюкозой колонии мелкие, сероватые или желтоватые, мутные, линзообразной формы с зоной гемолиза; на печеночном агаре колонии звездчатые полиморфные; на желатине – сероватые, окруженные зоной разжиженного желатина.

Возбудитель выявляют в пищевых продуктах и клиническом мате­риале.

5.4.7. Дрожжи и плесневые грибы

Грибы – многочисленная группа эукариотических микроорганиз­мов, различающихся по своей морфологии и физиологии. В основном сапротрофы, некоторые виды вызывают заболевания человека и жи­вотных (микозы). Поселяясь на разнообразных продуктах – пищевом и лекарственном сырье, пищевых продуктах, кормах, лекарственных препаратах они вызывают их порчу и могут выделять в среду опасные микотоксины. Контакт с мате­ри­алом, инфицированном грибами, мо­жет привести к развитию заболеваний, в том числе аллергических.

По морфологии клеток различают дрожжи, клетки которых имеют округлую или овальную форму и размножаются почкованием, и плесне­вые (мицелиальные) грибы, которые растут в виде длинных ветвящихся нитей.

Для выявления грибов используют методы микроскопии и выде­ления культуры на питательных средах. Для идентификации грибов исследуют их морфологические и биохимические особенности, при­меняют методы ПЦР и гибридизации ДНК.