3.14. Методы определения белка

Для молока сырого кислотностью не выше 20 °Т существуют следующие методы измерения массовой доли белка: колориметрический, рефрактометрический и формольного титрования, а также метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю.

Отбор проб и подготовка их к испытаниям – по ГОСТ 13928. Консервирование проб не допускается.

Колориметрический метод

Колориметрический метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислый краситель, образуя с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора, которая уменьшается пропорционально массовой доле белка.

Аппаратура, материалы и реактивы:

весы лабораторные 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104;
центрифуга для измерения массовой доли жира молока по нормативно-технической документации;
колориметр фотоэлектрический лабораторный со светофильтром для выделения спектральной области 590 нм с кюветами рабочей длины 10 мм или спектрофотометр с выделяемой длиной волны 590 нм;
анализатор потенциометрический с ценой деления 0,05 ед. рН с диапазоном измерения 2-3 ед. рН;
термометр ртутный стеклянный с диапазоном измерения 0–100 °С, с ценой деления 0,5 или 1,0 °С, с пределом допустимой погрешности ± 1 °С по ГОСТ 28498;
пробки резиновые конусные № 16 или 19 по нормативно-технической документации;
штатив для пробирок;
фильтры бумажные;
пробирки П1, П2, П4-25 по ГОСТ 25336;
воронки В или ВФ по ГОСТ 25336;
пипетки 1-2-1, 2-2-1, 4-2-1, 5-2-1, 2-2-20 по ГОСТ 29169;
колбы 1-2-50, 1-2-200, 1-2-500, 1-2-2000, 2-2-50, 2-2-200, 2-2-500, 2-2-2000 по ГОСТ 1770;
бутыль темного стекла вместимостью 2000 см³ по нормативно-технической документации;
краситель «Амидо-черный 10 Б» (1-амино-2,7-бис(n-нитрофенилазо)-8-оксинафталин-3,6-дисульфокислоты динатриевая соль) по ТУ 6-09-05-557, ч. д. а.;
кислота лимонная по ГОСТ 3652, х. ч. или ч. д. а.;
натрий ортофосфат двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, х. ч. или ч. д. а. или натрий ортофосфат двузамещенный, х. ч. или ч. д. а.;
кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч. или ч. д. а.;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч. или ч. д. а.;
вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

Подготовка к измерениям. Приготовление буферного раствора. Взвешивают 31,70 г лимонной кислоты и 8,40 г ортофосфата натрия. Результат взвешивания записывают с округлением до 2-го десятичного знака. Реактивы помещают в колбу вместимостью 500 см³ и добавляют в нее 400 см³ воды. Колбу нагревают до температуры выше 70 °С. Затем содержимое колбы перемешивают до полного растворения веществ и охлаждают до температуры (20 ± 2) °С.

Приготовление раствора красителя. Навеску 4,60 г красителя, взвешенного с отсчетом до 0,01 г, помещают в колбу вместимостью 500 см³и добавляют в нее 200 см³ воды. Колбу нагревают до температуры не выше 70 °С и затем перемешивают содержимое ее до растворения красителя.

Раствор отфильтровывают через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см³. Фильтр промывают водой до удаления следов красителя. В эту же колбу переносят буферный раствор.

Содержимое колбы охлаждают до температуры (20 ± 2) °С. Колбу доливают водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают ее содержимое путем переворачивания колбы не менее шести раз.

Раствор должен иметь (2,3 ± 0,1) ед. рН. Если рН раствора не соответствует данному значению, исправляют его добавлением концентрированной серной кислоты или гидроокиси натрия. Раствор, разбавленный в 50 раз, должен иметь оптическую плотность (0,82 ± 0,02) на длине волны 590 нм в кювете с рабочей длиной 10 мм. Если оптическая плотность раствора не соответствует данному значению, то исправляют ее добавлением буферного раствора или раствора красителя. Раствор следует использовать только после 12 ч выдержки.

Раствор должны хранить в холодильнике в бутыли из темного стекла не более 4 мес, еженедельно проверяя и исправляя значения рН и оптической плотности.

Проведение измерений. В стеклянную пробирку помещают пипеткой 1 см³ молока, приливают 20 см³ раствора красителя и, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают ее содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз. Следует избегать встряхивания, так как при этом образуется трудноразрушимая пена.

Помещают пробирку в центрифугу и центрифугируют при частоте вращения 25 с^-1 (1500 об/мин) в течение 10 мин или при частоте вращения 16 с^-1 (1000 об/мин) – в течение 20 мин.

Отбирают пипеткой 1 см³ надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, доливают колбу до метки водой и содержимое перемешивают. Аналогичным способом разбавляют рабочий раствор красителя в 50 раз.

Измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленному содержимому мерной колбы.

После каждых 24 наблюдений кювету промывают буферным раствором.

Обработка результатов. Массовую долю белка X, %, вычисляют по формуле:

Х = 7,78D - 1,34,

где D – измеренная оптическая плотность, ед. оптич. плотности; 7,78 – эмпирический коэффициент, %/ед. оптич. плотности; 1,34 – эмпирический коэффициент, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений в диапазоне массовой доли белка 2,5–4,0 % составляет ± 0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,80 и расхождении между двумя параллельными измерениями не более 0,013 единиц оптической плотности или не более 0,1 % массовой доли белка.

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов вычислений двух параллельных наблюдений, округляя результат до второго десятичного знака. При расхождении между результатами измерений, полученными в разных лабораториях более чем на 0,1 % массовой доли белка, измерение проводят по ГОСТ 23327.

Рефрактометрический метод

Рефрактометрический метод основан на измерении показателей преломления молока и безбелковой молочной сыворотки, полученной из того же образца молока, разность между которыми прямо пропорциональна массовой доле белка в молоке.

Аппаратура, материалы и реактивы:

комплект для измерения массовой доли белка, состоящий из: рефрактометра (рис. 8) со шкалой массовой доли белка в диапазоне 0–15 %, ценой деления 0,1 %; водяной бани закрытого типа для флаконов;
центрифуга для измерения массовой доли жира в молоке по нормативно-технической документации;
электроплитка номинальной мощностью 1000 Вт по ГОСТ 14919;
колбы 1-1000-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770;
пипетки 1-2-1, 2-2-1, 2-2-5, 4-2-1, 5-2-1 по ГОСТ 29169;
флаконы из стеклянной трубки для лекарственных средств, типа ФО, вместимостью 10 см³ по ТУ 64–2–10;
пробки резиновые по нормативно-технической документации;
кальций хлористый 2-водный по ТУ 6-09-5077;
вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Подготовка к измерениям. Навеску 40,0 г хлористого кальция помещают в колбу вместимостью 1000 см³, приливают к ней 500 см³ воды и перемешивают до полного растворения соли. Содержимое колбы нагревают до температуры (20 ± 2) °С и доводят водой до метки.

Проведение измерений. Наливают в 3 флакона по 5 см³ молока, добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками, и содержимое их перемешивают путем переворачивания флаконов.

ris 8

Рис. 8. Рефрактометр ИРФ-454: 1, 13 – направляющие; 2 – блок рефрактометрический; 3, 7, 9, 12, – штуцера; 4 – крючок; 5 – шкала; 6 – нониус; 8 – рукоятка; 10– шарнир; 11, 15 – зеркала, 14 – заслонка

Помещают флаконы в водяную баню, наливая в баню воду так, чтобы ее уровень достигал половины высоты флаконов. Баню закрывают, помещают на электроплитку, доводят воду в бане до кипения и кипятят не менее 10 мин. Не открывая бани, сливают горячую воду через отверстия в крышке, наливают в баню холодную воду и выдерживают в ней не менее 2 мин.

Открывают баню, извлекают флаконы и разрушают белковый сгусток путем энергичного встряхивания флаконов.

Флаконы помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 мин. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят на измерительную призму рефрактометра 1-2 капли. Закрывают измерительную призму осветительной.

Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Для улучшения резкости границы измерение проводят через 1 мин после нанесения сыворотки на призму, так как за это время из пробы удаляется воздух и лучше смачивается поверхность осветительной призмы.

Проводят по шкале «Белок» не менее 3 наблюдений. Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают ее водой и вытирают фильтровальной бумагой.

Помещают на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и проводят по шкале «Белок» не менее 5 наблюдений, так как резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки.

Вычисляют среднеарифметические результаты наблюдений для сыворотки и молока.

Обработка результатов. Массовую долю белка в молоке X₁, %, вычисляют по формуле:

X₁= X₂- X₃,

где Х₂ – среднеарифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для молока, %; Х₃ – среднеарифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для сыворотки, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений составляет ± 0,1 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,80 и расхождении между двумя параллельными определениями не более 0,1 % массовой доли белка.

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных вычислений массовой доли белка, округляя результат до второго десятичного знака.

При расхождении между результатами измерений, полученными в разных лабораториях более чем на 0,1% массовой доли белка, измерение проводят по ГОСТ 23327.

Метод формольного титрования

Метод применяют при условии согласия с поставщиком.

Метод формольного титрования основан на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.

Аппаратура, материалы и реактивы:

анализатор потенциометрический с диапазоном измерения от 4 до 10 ед. рН с ценой деления 0,05 ед. рН;
блок автоматического титрования, аппаратурно-совместимый с потенциометрическим титратором и имеющий дозатор раствора (бюретку) вместимостью не менее 5 см³ с ценой деления не более 0,05 см³;
секундомер механический типа СОПир 3-го класса;
колбы 1-1000-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770;
пипетки 2-2-5, 2-2-20 по ГОСТ 29169;
воронки ВК по ГОСТ 25336;
стаканы В-1-50, В-2-50 по ГОСТ 25336;
натрия гидроокись, стандарт-титр по ТУ 6-09-2540, раствор с молярной концентрацией 0,1 моль/дм³;
формальдегид, водный раствор с массовой долей формальдегида 30% по ГФ СССР, № 619;
вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Определение поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формального титрования. Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формального титрования и по ГОСТ 23327.

Измерения проводят на средней пробе молока, полученной путем смешивания равных по массе образцов молока, полученных от разных хозяйств. При этом средняя проба должна быть образована не менее чем от 75 % всех хозяйств – сдатчиков молока.

Измерения как по ГОСТ 23327, так и методом формольного титрования проводят в шести повторностях.

Поправку Х₄, %, вычисляют по формуле:

Х₄=Х₅- Х₆,

где X₅ – среднеарифметическое значение массовой доли белка, полученное по ГОСТ 23327, %; Х₆ – среднеарифметическое значение массовой доли белка, полученное формольным титрованием, %.

Определение поправки проводят не реже одного раза в декаду.

Проведение измерений. В стакан помещают 20 см³ молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Включают кнопку «Пуск» блока автоматического титрования, а спустя 2–3 с – кнопку «Выдержка». Раствор гидроксида натрия при этом начинает поступать из дозатора блока в стакан с молоком, нейтрализуя последнее. По достижении точки эквивалентности (рН = 9) и истечении времени выдержки (30 с) процесс нейтрализации автоматически прекращается, а на панели блока автоматического титрования зажигается сигнал «Конец». После этого отключают кнопки «Пуск» и «Выдержка», определяют количество раствора щелочи, затраченной на нейтрализацию молока до внесения формальдегида, и вносят в стакан 5 см³ формальдегида.

По истечении 2–2,5 мин вновь включают кнопки «Пуск» и «Выдержка». По окончании процесса определяют общее количество раствора, затраченного на нейтрализацию.

Параллельно проводят контрольный опыт по нейтрализации смеси 20 см³ воды и 5 см³ раствора формальдегида.

Обработка результатов. Массовую долю белка Х₁, %, вычисляют по формуле

X₁= (V₁- V₂- V₃) x 0,96 + X₄

где V₂ – общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см³; V₁ – количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида, см³; V₃ – количество раствора, израсходованное на контрольный опыт, см³; 0,96 – эмпирический коэффициент, %/см³; X₄ – поправка к результату измерения массовой доли белка, %.

Предел допустимой погрешности результата измерений в диапазоне массовой доли белка 2,2–4,0 % составляет ± 0,15 % массовой доли белка при доверительной вероятности 0,80 и расхождении между двумя параллельными измерениями не более 0,2% массовой доли белка.

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных вычислений, округляя результат до второго десятичного знака.

При расхождении между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях более чем на 0,15 % массовой доли белка, измерение проводят по ГОСТ 23327.

Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка

Область применения. Метод Кьельдаля основан на минерализации пробы молока концентрированной серной кислотой в присутствии окислителя, инертной соли – сульфата калия и катализатора – сульфата меди. При этом аминогруппы белка превращаются в сульфат аммония, растворенный в серной кислоте.

Массовую долю азота в этом растворе измеряют одним из следующих способов:

химическим – путем подщелачивания раствора, дистилляции аммиака с водяным паром, поглощения его раствором борной кислоты и титрования последнего раствором соляной кислоты с индикацией точки эквивалентности по изменению окраски индикатора (ручное титрование) или с помощью потенциометрического анализатора (ручное или автоматическое титрование);
электрохимическим – путем автоматического кулонометрического титрования аммиака непосредственно в минерализованной пробе.

Массовую долю белка определяют, умножая полученный результат на соответствующий коэффициент.

ris 9

Рис. 9. Общий вид установки для потенциометрического титрования:
1 – иономер; 2 – блок автоматического титрования; 3 – электромагнитный клапан; 4 – штатив; 5 – мешалка;
6 – втулка резиновая; 7 – держатель электродов; 8 – измерительный электрод; 9 – вспомогательный электрод;
10 – дозирующая трубка; 11 – одноходовой кран; 12– трубка резиновая d = 2 мм; 13 – трубка резиновая d = 4,5 мм;
14 – зажим; 15–тройник; 16– активатор мешалки; 17–хомутик; 18 – пружина

Нормативные ссылки. В настоящем разделе использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования;
ГОСТ 1770 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия;
ГОСТ 2603 Ацетон. Технические условия;
ГОСТ 3118 Кислота соляная. Технические условия;
ГОСТ 3622 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию;
ГОСТ 4145 Калий сернокислый. Технические условия;
ГОСТ 4160 Калий бромистый. Технические условия;
ГОСТ 4165 Медь (II) сернокислая 5-водная. Технические условия;
ГОСТ 4204 Кислота серная. Технические условия;
ГОСТ 4221 Калий углекислый. Технические условия;
ГОСТ 4328 Натрия гидроокись. Технические условия;
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия;
ГОСТ 9147 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия;
ГОСТ 9656 Кислота борная. Технические условия;
ГОСТ 10929 Водорода перекись. Технические условия;
ГОСТ 14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные шкафы бытовые. Общие технические условия;
ГОСТ 19908 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия;
ГОСТ 20490 Калий марганцевокислый. Технические условия;
ГОСТ 24104 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия;
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные, стеклянные. Типы, основные параметры и размеры;
ГОСТ 26809 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора проб и подготовка проб к анализу;
ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний;
ГОСТ 29228 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования;
РМГ 29 Государственная система обеспечения единства измерений. Метрология. Основные термины и определения.

Методы отбора проб. Методы отбора проб и подготовка их к анализу – по ГОСТ 13928, ГОСТ 3622 и ГОСТ 26809.

Аппаратура, материалы и реактивы. Для измерений применяют следующие аппаратуру, материалы и реактивы.

весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104;
весы лабораторные 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104;
анализатор потенциометрический с диапазоном измерения 0-12 ед. рН с ценой деления ,0,05 ед.рН;
блок автоматического титрования, аппаратурно-совместимый с потенциометрическим анализатором и имеющий дозатор раствора – бюретку вместимостью не менее 5 см³ с ценой деления не более 0,02 см³, а также магнитную мешалку;
автоматический кулонометрический титратор общего назначения с диапазоном измерения 0,1-0,4 Кл и ценой деления не более 0,005 Кл или автоматический кулонометрический титратор для измерения массовой доли общего азота с диапазоном измерения 0–1 % азота и ценой деления не более 0,01 % азот;
термометр ртутный стеклянный с диапазоном измерения 0–40 °С с ценой деления 0,1°С по ГОСТ 28498;
плитка электрическая мощностью 1000 Вт по ГОСТ 14919;
блок с гнездами алюминиевый для пробирок или колб Кьельдаля (рис.10);
шкаф вытяжной;
приспособление для отвода кислотных паров, выделяющихся при минерализации (рис. 11);
колбы Кьельдаля 2-100-ТС по ГОСТ 25336; .
пробирки кварцевые типа БП по ГОСТ 19908 или пробирки из термостойкого стекла (рис. 12);
холодильник ХШ-3-200 по ГОСТ 25336;
каплеуловитель лабораторный стеклянный по ГОСТ 25336 или каплеуловитель согласно рис. 13 (из термически стойкого стекла, а также может быть из полиметилметакрилата и коррозионностойких сортов стали);
колбы мерные 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2, 1-2000-2 или 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2, 2-2000-2 по ГОСТ 1770;
цилиндры мерные 1-10-1, 1-50-1, 1-100-1, 1-1000-1 или 1-10-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-1000-2, или 3-50-1, 3-100-1, 3-1000-1 или 3-50-2, 3-100-2, 3-1000-2 по ГОСТ 1770;
пипетки 8-2-0,1 или 8-2-0,2 по ГОСТ 29228;
пипетки 6-1-10 или 6-2-10 по ГОСТ 29228;
бюретки 1-2-5-0,02 или 2-2-5-0,02, или 6-2-5-0,02, или 7-2-10-002 по ГОСТ 29228;
колбы конические Кн-2-250-34ТХС, Кн-2-1000-42-ТХС, Кн-2-2000-50-ТС по ГОСТ 25336;
стаканы В-1-50 ТС, В-1-100 ТС, В-1-250 ТС или В-2-50 ТС, В-2-100 ТС, В-2-250 ТС по ГОСТ 25336;

Сосуд	D₁	Число гнезд
Пробирка	45°	5
Колба Кьельдаля	67°	4

ris 10

Рис. 10. Алюминиевый блок с гнездами для пробирок или колб Кьельдаля:
1 – алюминиевый блок; 2 – теплоизоляция (асбест или асбоцемент);
3 – цилиндрический алюминиевый экран;
4 – гнездо для пробирки или колбы Кьельдаля

ris 11

Рис. 11. Приспособление для отвода кислотных паров:
1 – пробирка или колба Кьельдаля; 2 – стеклянный колпак;
3 – трубка из резины или фторопласта-4

ris 12

Рис. 12. Пробирка из стекла ТС

ris 13

Рис. 13. Каплеуловитель

стаканчики СВ-14/8 по ГОСТ 25336;
воронки делительные ВД-2-25 ХС по ГОСТ 25336;
воронки В-36-80 ХС по ГОСТ 25336;
ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147;
отрезки стеклянных трубок длиной 2–3 см, диаметром 0,5 см;
кислота серная концентрированная, плотностью 1,83–1,84 г/см³по ГОСТ 4204;
кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор концентрацией 0,1 моль/дм³;
кислота соляная стандарт-титр по НД;
кислота борная по ГОСТ 9656;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
калия бромид по ГОСТ 4160;
калия карбонат по ГОСТ 4221;
калия гидрокарбонат по ГОСТ 4143;
калия сульфат по ГОСТ 4145;
калия перманганат по ГОСТ 20490;
медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165;
перекись водорода по ГОСТ 10929, раствор с массовой долей 30%;
ацетон по ГОСТ 2603;
вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
метиленовый голубой по НД или аналогичный производства Индии;
бриллиантовый зеленый по НД;
метиловый красный по НД;
бромкрезоловый зеленый по НД.

Все реактивы должны быть чистыми для анализа или химически чистыми.

Допускается применение других средств измерения с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

Подготовка к измерениям. Приготовление раствора гидроокиси натрия. Растворяют 400 г гидроокиси натрия в 600 см³ дистиллированной воды.

Приготовленные смеси солей. Смешивают 100 г сульфата калия с 0,4 г сернокислой меди, смесь измельчают в ступке.

Приготовление раствора индикаторов. Растворяют в 100 см³ ацетона: для получения метиленового голубого – 0,075 г метилового красного и 0,200 г метиленового голубого; бромкрезолового зеленого – 0,045 г метилового красного и 0,200 г бромкрезолового зеленого; бриллиантового зеленого – 0,045 г метилового красного и 0,010 г бриллиантового зеленого.

Приготовление раствора для поглощения аммиака. Для измерения массовой доли азота с индикацией точки эквивалентности с помощью потенциометрического анализатора растворяют в 1000 см³ горячей дистиллированной воды 40 г борной кислоты.

Для измерения массовой доли азота с индикацией точки эквивалентности по изменению окраски индикатора в 1000 см³ раствора борной кислоты вносят 25 см³ одного из индикаторных растворов.

Приготовление раствора соляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм³. В соответствии с инструкцией к стандарт-титру вносят содержимое двух ампул стандарт-титра соляной кислоты в мерную колбу вместимостью 1000 см³, доводят дистиллированной водой объем до метки и перемешивают.

Приготовление анодного раствора. В мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 100 г бромида калия, 240 г гидрокарбоната калия и 22 г карбоната калия, приливают 800 см³ дистиллированной воды и перемешивают до растворения. Объем раствора доводят до метки водой и перемешивают.

Приготовление нейтрализующего раствора. В мерную колбу вместимостью 1 дм³ помещают 100 г бромида калия и 200 г гидроокиси натрия, приливают около 800 см³ дистиллированной воды и перемешивают до растворения. Объем раствора доводят до метки водой и перемешивают.

Химический способ измерения массовой доли азота

Проведение измерений. 1. В колбу Кьельдаля или пробирку помещают несколько отрезков стеклянных трубок и 10 г смеси солей.

В стаканчик для взвешивания отмеряют 1 см³ продукта, крышку закрывают и взвешивают. Продукт переливают в колбу Кьельдаля или пробирку. Пустой стаканчик с крышкой вновь взвешивают и по разнице между массой стаканчика с молоком и массой пустого стаканчика устанавливают массу взятого продукта.

В колбу Кьельдаля или пробирку добавляют 10 см³ серной кислоты и 10 см³ перекиси водорода или 0,5 г перманганата калия.

Колбу Кьельдаля или пробирку помещают в гнездо алюминиевого блока на электроплитке. Устанавливают регулятор нагрева плитки в среднее положение.

После прекращения бурного вспенивания содержимого колбы или пробирки (приблизительно через 10 мин после начала нагревания) устанавливают регулятор нагрева плитки в положение, соответствующее максимуму. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной и бесцветной или слегка голубоватой.

Колбу Кьельдаля или пробирку с полученным минерализатом охлаждают на воздухе до комнатной температуры.
Измерение массовой доли общего азота химическим способом с индикацией точки эквивалентности по изменению окраски индикатора проводят в следующей последовательности.

В колбу Кьельдаля или пробирку с минерализатом добавляют 20 см³дистиллированной воды и тщательно перемешивают круговым движением до растворения осадка.

Собирают перегонный аппарат (рис. 14). Включают электроплитку под колбой-парообразователем, открывают зажим на линии отвода пара в канализацию и закрывают зажим на линии подачи пара в колбу Кьельдаля. Нагревают воду в колбе-парообразователе до кипения. Колбу Кьельдаля или пробирку присоединяют к перегонному аппарату.

ris 14

Рис. 14. Прибор для отгонки аммиака:
1 – плитка электрическая;, 2–колба коническая вместимостью 2000 см³;
3– воронка делительная; 4 – каплеуловитель; 5 – пробирка кварцевая;
6–холодильник; 7 – колба коническая вместимостью 250 см³

4. В коническую колбу вместимостью 250 см³ отмеривают мерным цилиндром 20 см³ смеси раствора борной кислоты с раствором индикатора.

Устанавливают коническую колбу на поз. 7 так, чтобы конец трубки холодильника находился ниже верхнего уровня смеси растворов в колбе.

5. Отмеряют мерным цилиндром 50 см³ раствора гидроокиси натрия и осторожно, не допуская выбросов, переливают его через делительную воронку в колбу Кьельдаля или пробирку. Кран воронки сразу закрывают. Закрывают зажим на линии отвода пара и открывают зажим на линии подачи пара из колбы-парообразователя в колбу Кьельдаля
или пробирку.

Перегонку ведут до достижения объема конденсата 90–120 см³ (время перегонки – 5–10 мин). Температура воды на выходе из холодильника не должна превышать 25 °С.

6. Содержимое конической колбы с раствором индикатора, борной кислотой и конденсатом титруют раствором соляной кислоты концентрацией 0,2 моль/дм³ до изменения цвета, указанного в табл. 37.

Проводят отсчет объема кислоты, затраченного на титрование содержимого колбы.

При измерении массовой доли общего азота химическим способом с индикацией точки эквивалентности с помощью потенциометрического анализатора (ручное титрование) проводят операции в соответствии п. 1, 2, 3.

7. В химический стакан вместимостью 250 см³ отмеривают мерным цилиндром 20 см³ раствора борной кислоты и устанавливают стакан на поз. 7 так, чтобы конец трубки холодильника находился ниже верхнего уровня раствора в стакане.

8. Дозировку, подачу раствора гидроокиси натрия в колбу Кьельдаля и перегонку осуществляют в соответствии с п. 5.

Таблица 37.
Изменение цвета раствора при титровании с различными индикаторами

Индикатор	Цвет раствора
Индикатор	исходный	в точке эквивалентности	при избытке титранта
Метиленовый голубой	Зеленый	Серый	Фиолетовый
Бромкрезоловый зеленый и бриллиантовый зеленый	Зеленый	Серо-желтый	Красный

Химический стакан снимают с поз. 7 и погружают в него электроды потенциометрического анализатора с раствором борной кислоты и конденсатом и титруют содержимое стакана раствором соляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм³ до достижения рН = 5,4.

Проводят отсчет объема кислоты, затраченного на титрование содержимого стакана.

Автоматическое титрование. При измерении массовой доли азота химическим способом с автоматическим титрованием последовательно выполняют указания пунктов 1, 2, 3, 4, 5, 7.

Подключают блок автоматического титрования к потенциометрическому анализатору согласно инструкции, прилагаемой к блоку. Подключают блок и анализатор к сети и прогревают в течение 10 мин.

Заполняют дозатор блока автоматического титрования раствором соляной кислоты концентрации 0,2 моль/дм³.

Настраивают потенциометрический анализатор на диапазон, включающий значение рН = 5,4. Настраивают блок автоматического титрования на точку эквивалентности, равную 5,4, и устанавливают на блоке значение рН = 10,4, начиная с которого подача соляной кислоты должна вестись по каплям.

Устанавливают время выдержки после окончания титрования – 15 с.

В химический стакан со смесью конденсата и раствором борной кислоты помещают стержень магнитной мешалки. Включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора и сливную трубку дозатора блока автоматического титрования в содержимое химического стакана.

Включают кнопку «Пуск» блока автоматического титрования, а спустя 2–3 с – кнопку «Выдержка». Раствор соляной кислоты при этом начинает поступать из дозатора блока в стакан с конденсатом, нейтрализуя последний.

По достижении точки эквивалентности и истечении времени выдержки 15 с процесс нейтрализации автоматически прекращается, а на панели блока автоматического титрования зажигается сигнал «Конец». После этого отключают все кнопки. Фиксируют объем раствора кислоты, затраченного на нейтрализацию.

Электрохимический способ

Для измерения массовой доли общего азота электрохимическим способом проводят операции, предусмотренные в п. 1.2.

Подготовку кулонометрического титратора к работе проводят согласно инструкции, прилагаемой к прибору.

Минерализат после охлаждения количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, объем раствора доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

В измерительную ячейку титратора, заполненную анодным раствором, вносят 0,2 см³ нейтрализующего раствора, а затем – 0,1 см³раствора минерализата и включают кнопку «Пуск» автоматического титрования (некоторые модификации кулонометрического титратора начинают титрование автоматически после внесения раствора минерализата).

Процесс титрования аммиака проводят автоматически. По окончании процесса прибор отключается. Показания цифрового индикатора соответствуют значению массы общего азота в пробе или значению количества электричества, затраченного на окисление аммиака (в зависимости от модификации прибора).

Периодически, не реже двух раз в день и при замене хотя бы одного из реактивов, необходимо проводить контрольное измерение, используя вместо продукта 1 см³ дистиллированной воды. Количество повторов контрольного измерения должно быть не менее 5.

При появлении одного из значений, отличающегося от нуля, проводят замену реактивов и повторное контрольное измерение.

Обработка результатов измерений

Массовую долю общего азота X, %, при химическом способе измерения вычисляют по формуле

общего азота X

где V₁ – объем кислоты, затраченный на титрование, см³; V₂ – объем кислоты, затраченный на титрование при контрольном измерении, см³; С – концентрация соляной кислоты, моль/дм³; М – масса навески продукта, г; 1,4 – коэффициент пересчета объема кислоты в массовую долю общего азота, (% ∙ г ∙ дм³)/(моль ∙ см³).

Массовую долю белка Y, %, определяют по формуле

Y = 6,38X,

где 6,38 – масса молочного белка, эквивалентная единице массы общего азота.

Массовую долю общего азота X, %, при электрохимическом способе измерения вычисляют по формуле, приведенной в паспорте на прибор.

В табл. 38 приведены метрологические характеристики методик измерения массовой доли общего азота и определения массовой доли белка, где установлены: границы абсолютной погрешности измерений при доверительной вероятности Р = 0,95; сходимость по РМГ 29; воспроизводимость по РМГ 29.

Таблица 38.
Метрологические характеристики измерения массовой доли общего азота и определения массовой доли белка
(в процентах)

Способ измерения	Границы абсолютной погрешности измерений		Сходимость, не более		Воспроизводимость, не более
	массовых долей:
	азота	белка	азота	белка	азота	белка
Химический	±0,009	±0,06	0,013	0,08	0,026-0,30	0,16
Электрохимический	±0,013	±0,08	0,015	0,11	–	0,22

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до второго знака после запятой.

Требования техники безопасности

Лаборатория, в которой измеряют массовую долю общего азота, должна иметь приточно-вытяжную вентиляцию в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021.

Работу с реактивами проводят в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных защитных средств.