Фосфатаза инактивируется при температуре пастеризации не ниже 63 °С с выдержкой 30 мин.

Определение фосфатазы по реакции с 4-аминоантипирином (арбитражный метод)

Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кис­лоты ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Выделившийся при гидролизе свободный фенол в присут­ствии окислителя дает розовое окрашивание с 4-аминоантипирином.

Аппаратура, материалы и реактивы:

• весы лабораторные аналитические;
• весы лабораторные технические;
• пробирки стеклянные по ГОСТ 23932, размером 16 х 150 мм;
• пипетки измерительные вместимостью 5 см³ по ГОСТ 29169;
• ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147;
• колба коническая вместимостью 100 см³ по ГОСТ 1770;
• цилиндр стеклянный вместимостью 25 см³ по ГОСТ 1770;
• баня водяная;
• аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х. ч.;
• аммиак водный по ГОСТ 3760, 25%-ный, ч. д. а.;
• фенилфосфорной кислоты динатриевая соль двуводная – по действующей технической документации, утвержденной в уста­новленном порядке;
• 4-аминоантипирин, ч.;
• цинк сернокислый по ГОСТ 4174, х. ч.;
• медь сернокислая по ГОСТ 4165, х. ч.;
• эфир этиловый;
• вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
• воронки стеклянные В 56-80 ХУ-1 ГОСТ 25336,
• колба мерная вместимостью 1000 см³ по ГОСТ 1770;
• фильтры бумажные диаметром 11 см;
• бумага индикаторная универсальная (рН 1–10);
• натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч. или ч. д. а., 1 н. раствор;
• уголь активированный.

Подготовка к анализу. Молоко пастеризованное, сливки для прове­дения анализа дополнительной подготовки не требуют.

Приготовление основного буферного раствора (рН 10 ± 0,2). 40 г хло­ристого аммония (NН₄С1), взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 100–200 см³ дистиллированной воды, добавляют 348 см³ 25%-ного водного аммиака (NH₄ОН) и доводят до 1 дм³ дис­тиллированной водой.

Приготовление субстрата. Приготовление раствора А: 1,25 г дина­триевой соли фенилфосфорной кислоты (С₆Н₅О₄РNa₂), взвешивают с погрешностью на более 0,0002 г, растворяют в 100 см³ основного бу­ферного раствора.

Приготовление раствора Б: 0,8 г 4-аминоантипирина (С₁₁Н₁₁ОN₂NН₂), взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в 900 см³ дистиллированной воды.

Растворы А и Б должны быть бесцветными и храниться в склянках из темного стекла в холодильнике. Срок хранения не более 1 мес. По­желтевшие растворы для работы непригодны.

Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед опреде­лением фосфатазы смешиванием растворов А и Б (1:9). Рабочий рас­твор пригоден для работы в течение 8 ч при хранении его в склянке из темного стекла.

При необходимости динатриевую соль фенилфосфорной кислоты очищают от свободного фенола промыванием этиловым эфиром до полного удаления фенола. Сушить реактив при комнатной темпера­туре под тягой.

Приготовление осадителя системы цинк-медь. 30 г сульфата цин­ка (ZnSО₄ • 7Н₂О) и 6 г сульфата меди (CuSO₄ • 5Н₂O), взвешенных с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды.

Приготовление 1 н. раствора гидроокиси натрия. 40 г кристалличе­ской гидроокиси натрия взвесить с погрешностью не более 0,1 г и рас­творить в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 дм³, доведя объ­ем до метки. Активированный уголь в таблетках растереть в ступке.

Проведение анализа. К 3 см³ молока, сливок добавляют 2 см³ рабо­чего раствора субстрата. Затем перемешивают содержимое пробирки и ставят в водяную баню, нагретую до 40–45 °С на 30 мин. В пробирку, вынутую из водяной бани, добавляют 5 см³ осадителя системы цинк-медь, тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова ставят в водяную баню с температурой 40-45 °С на 10 мин. Вынув пробирку из бани, производят визуальное сравнение содержимого пробирки ис­пытуемого продукта с контрольным опытом.

Контрольным опытом для всех продуктов является аналогичная ре­акция с кипяченым молоком. Если контрольный опыт с кипяченым молоком дает слабо-розовое окрашивание – динатрийфенилфосфат подлежит дополнительной очистке.

Оценка результатов. При отсутствии фермента фосфатазы в молоке окраска содержимого пробирки (раствора, отделившегося от осажден­ного белка) бесцветная, т. е. аналогичная содержимому пробирок кон­трольного опыта. Следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 63 °С.

При наличии фосфатазы в молоке содержимое пробирок (раствор) имеет окрашивание от розового до темно-красного цвета. Следова­тельно, молоко не подвергалось пастеризации или подвергалось па­стеризации при температуре ниже 63 °С, или было смешано с непасте­ризованным молоком.

При оценке реакции учитывается только цвет, но не прозрачность раствора.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление непа­стеризованного молока к пастеризованному: 0,3 % в молоке, сливках.

Определение фосфатазы по реакции с фенолфталеинфосфатом натрия

Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия фермен­том фосфатазой, содержащейся в молоке. Освобождающийся при гид­ролизе фенолфталеин в щелочной среде дает розовое окрашивание.

Аппаратура, материалы и реактивы:

• весы лабораторные аналитические;
• весы лабораторные технические;
• пробирки по ГОСТ 23932;
• пипетки вместимостью 2 и 5 см³ по ГОСТ 29169;
• пипетки вместимостью 5 или 10 см³ с ценой деления 0,1 см³ по ГОСТ 29169;
• капельницы из темного стекла или покрытые черным лаком;
• колбы мерные вместимостью 250 и 500 см³ по ГОСТ 1770;
• колбы конические вместимостью 250 см³ по ГОСТ 1770;
• аммиак водный по ГОСТ 3760, ч. д. а., 1 н. раствор;
• аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х. ч. или ч. д. а., 1 н. раствор;
• смесь буферная аммиачная;
• фенолфталеинфосфат натрия порошкообразный, 10 или 0,1%-ный раствор;
• вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
• пробирки стеклянные по ГОСТ 23932 из бесцветного стекла с на­несенными метками на объем 2 см³;
• пипетки измерительные вместимостью 1 и 2 см³ по ГОСТ 29169;
• пробки резиновые.

Подготовка к анализу. Приготовление аммиачной буферной смеси. 80 см³ 1 н. раствора аммиака смешивают с 20 см³ 1 н. раствора хлори­стого аммония (рН 9,8).

Приготовление 0,1%-ного раствора фенолфталеинфосфата натрия. 0,1 г порошкообразного фенолфталеинфосфата натрия, взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в мерной колбе вмести­мостью 100 см³ с небольшим количеством буферной смеси, затем до­ливают буферную смесь до метки и перемешивают.

Проведение анализа. В пробирку отмеривают анализируемый про­дукт, дистиллированную воду и реактив. Количество анализируемого продукта, дистиллированной воды и реактива должно соответствовать указанному в табл. 33.

Таблица 33

После добавления дистиллированной воды и реактива содержимое пробирки закрывают пробкой и взбалтывают.

Затем пробирку помещают в водяную баню с температурой воды от 40 до 45 °С и определяют окраску содержимого пробирки через 10 мин и через 1 ч.

Оценка результатов. При отсутствии фермента фосфатазы в молоке окраска содержимого пробирки не изменяется. Следовательно, моло­ко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 63 °С. При на­личии фосфатазы в молоке содержимое пробирки приобретает окраску от светло-розовой до ярко-розовой. Следовательно, молоко не подвер­галось пастеризации или подвергалось пастеризации при температуре ниже 63 °С, или было смешано с непастеризованным молоком.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не ме­нее 2 % непастеризованного молока к пастеризованному.

Метод определения кислой фосфатазы

Кислая фосфатаза инактивируется при температуре пастеризации мо­лока и сливок 85 °С с выдержкой не менее 30 мин, 90 °С с выдержкой не менее 5 мин и кипячении; термической обработки сливок 103 °С с выдержкой 15–20 с.

Метод определения кислой фосфатазы предназначен для контроля эффективности термической обработки.

Сущность метода. Метод основан на свойстве кислой фосфатазы ка­тализировать при рН (4,00 ± 0,05) гидролиз динатриевой соли фенил­фосфорной кислоты с образованием фенола и фосфата натрия. Фенол с 4-аминоантипирином при добавлении осадителя системы цинк-медь в условиях щелочной реакции образует окрашенное соединение, изме­няющее интенсивность окраски от слабо-розовой до темно-вишневой (в зависимости от концентрации фенола). По разнице в интенсив­ности окраски опытных и контрольных проб определяют активность кислой фосфатазы (соблюдены ли режимы термической обработки).

Аппаратура, материалы и реактивы:

• анализатор потенциометрический с диапазоном измерения 3-4,5 ед. рН, позволяющий измерить рН с погрешностью ± 0,05, по ГОСТ 19881 или ГОСТ 16454;
• баня водяная с регулируемым подогревом или ультратермостат, обеспечивающие регулирование температуры от 25 до 50 °С, с точностью ±1 °С;
• бюретки 3-1-25-0,1; 3-2-25-0,1; 3-1-50-0,1; 3-2-50-0,1 по ГОСТ 29251.
• весы лабораторные общего назначения, 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104;
• весы лабораторные общего назначения, 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104;
• воронка В-56-80ХС по ГОСТ 25336;
• капельница 2-50 ХС по ГОСТ 25336;
• колбы Кн-2-250-34; 2-250-40; 2-250-50 ХС по ГОСТ 25336;
• колбы 1-50-2; 1-100-2; 1-250-2; 1-500-2; 1-1000-2; 2-100-2; 2-50-2; 2-250-2; 2-500-2; 2-1000-2 по ГОСТ 1770;
• пипетки 4-1-1; 4-1-2; 5-1-1; 5-1-2; 6-1-5: 6-1-10; 7-1-5; 7-1-10 по ГОСТ 29169;
• пробирки П 4-15-14/23, П 2-16-150 ХС по ГОСТ 253364
• секундомер по нормативному документу;
• цилиндры 1-50; 1-100; 1-500; 3-50; 3-100 по ГОСТ 1770;
• штатив для пробирок;
• бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
• фольга алюминиевая для упаковки по ГОСТ 745;
• 4-аминоантипирин, ч.;
• аммиак 25%-ный водный раствор по ГОСТ 3760, ч. д. а.;
• вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
• кислота соляная, 0,1 моль/дм³, фиксанал;
• кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х. ч.;
• медь сернокислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.;
• метиловый оранжевый, индикатор с массовой долей 0,1 %;
• натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х. ч.;
• фенилфосфорной кислоты динатриевая соль 2-водная, ч.;
• цинк сернокислый 7-водный по ГОСТ 4174, ч.

Подготовка к анализу. Приготовление буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 72 см³ ледяной уксусной кисло­ты, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Затем подщелачивают концентрированным раствором гидроокиси натрия до (3,78 ± 0,05) рН.

Приготовление и хранение раствора динатриевой соли фенилфосфор­ной кислоты и 4-аминоантипирина. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят (0,300 ± 0,001) г динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и (0,021 ± 0,001) г 4-аминоантипирина, 80 см³ дистиллиро­ванной воды, содержимое растворяют, добавляют 10 см³ буферного раствора, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед проведением анализа. Реактив хранят в темном месте при температуре (20 ± 5) °С не более 2 ч.

Приготовление осадителя системы цинк-медь. В мерную колбу вме­стимостью 1000 см³ вносят (150,00 ± 0,05) г сернокислого цинка и (30,00 ± 0,05) г сернокислой меди, растворяют в дистиллированной во­де, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление 3 моль/дм³ раствора аммиака и определение его кон­центрации. В мерной колбе вместимостью 1000 см³ разбавляют 333 см³ аммиака с массовой долей 25 % до метки дистиллированной водой. Концентрацию раствора аммиака проверяют 0,2 моль/дм³ раствором соляной кислоты, используя в качестве индикатора раствор с массо­вой долей 0,1 % метилового оранжевого. В коническую колбу вносят 1 см³ исследуемого раствора аммиака, 50 см³ дистиллированной воды, 1–2 капли индикатора, перемешивают и титруют 0,2 моль/дм³ соляной кислотой. Концентрацию аммиака устанавливают по формуле:

К = 0,2 А,

где К – молярная концентрация исследуемого раствора аммиака, моль/дм³; 0,2 – молярная концентрация соляной кислоты, моль/дм³; А – объем израсходованной на титрование соляной кислоты, см³.

Раствор аммиака хранят в плотно закупоренной посуде. Перед взя­тием аммиака содержимое бутылки перемешивают.

Проведение анализа. Приготовление опытной пробы. Исследуемое молоко или сливки вносят по 1 см³ в три пробирки. В одну из проби­рок с молоком или сливками добавляют 10 см³ раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и 4-аминоантипирина, перемешива­ют, помещают в водяную баню или ультратермостат с температурой (36 ± 1) °С. Через одинаковые промежутки времени, например 1 мин, вышеуказанную операцию проводят последовательно с остальными двумя пробирками. Продолжительность выдерживания каждой из трех пробирок в водяной бане или ультратермостате, контролируемая по се­кундомеру, составляет 90 мин. Затем вносят из бюретки вместимостью 25 см³ или отмеривают пипеткой по 1 см³ осадителя системы цинк-медь, 0,6 см³ раствора с концентрацией аммиака 3 моль/дм³ через те же промежутки времени, как и при смешивании с раствором соли фе­нилфосфорной кислоты и 4-аминоантипирина, перемешивают после добавления каждого реактива, фильтруют и выдерживают 60 мин при температуре (20 ± 5) °С.

Приготовление контрольной пробы. Контрольную пробу готовят сле­дующим способом: в три пробирки вносят по 10 см³ раствора динатрие­вой соли фенилфосфорной кислоты и 4-аминоантипирина, выдержи­вают подобно опытным пробам при температуре (36 ± 1) ºС 90 мин. Пробирки вынимают из водяной бани или ультратермостата, добавля­ют по 1 см³ осадителя системы цинк-медь, 1 см³ исследуемых молока или сливок и 0,6 см³ раствора с концентрацией аммиака 3 моль/дм³ (перемешивание выполняют после каждой добавки), фильтруют и вы­держивают 60 мин при температуре (20 ± 5) ºС.

Во избежание попадания в содержимое пробирок постороннего фе­нола пробирки типа П2 закрывают фольгой, перемешивание выполня­ется 2-кратным переворачиванием пробирок на 180° и возвращением их в исходное положение.

Оценка результатов. При полной инактивации кислой фосфатазы в молоке или сливках окраска опытных проб не отличается от окра­ски контрольных проб. Следовательно, молоко и сливки подвергались пастеризации при температуре 85 °С с выдержкой не менее 30 мин, 90 °С с выдержкой не менее 5 мин и кипячению; сливки подвергались термической обработке при температуре 103 °С с выдержкой 15–20 с. В зависимости от активности кислой фосфатазы в молоке и сливках окраска опытных проб изменяет цвет от слабо-розового (но более яр­кого, чем окраска контрольных проб) до темно-вишневого. Следова­тельно, наличие активности кислой фосфатазы свидетельствует о не­соблюдении режимов термической обработки.