Отбор проб молока и молочных продуктов проводят по ГОСТ 26809 и ГОСТ 13928.

Пероксидаза инактивируется при температуре пастеризации не ниже 80 °С с выдержкой 20–30 с.

Метод определения пероксидазы по реакции с солянокислым пара-фенилендиамином

Сущность метода. Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазы, содержащейся в молоке и молочных продук­тах.

Освобождающийся при разложении перекиси водорода активный кислород окисляет пара-фенилендиамин, образуя соединение синего цвета.

Аппаратура, материалы и реактивы:

• весы лабораторные аналитические;
• весы лабораторные технические;
• пробирки по ГОСТ 23932;
• пипетки вместимостью 2 и 5 см³ по ГОСТ 29169;
• пипетки вместимостью 5 или 10 см³ с ценой деления 0,1 см³ по ГОСТ 29169;
• капельницы из темного стекла или покрытые черным лаком;
• колбы мерные вместимостью 250 и 500 см³ по ГОСТ 1770;
• колбы конические вместимостью 250 см³ по ГОСТ 1770;
• баня водяная с нагревательным прибором;
• пара-фенилендиамин солянокислый, 2%-ный водный раствор. Раствор нестойкий, его следует хранить в склянке из темного стекла с плотно закрытой пробкой, в темном прохладном месте;
• кислота лимонная кристаллическая по ГОСТ 3652, х. ч. или ч. д. а.;
• кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч., концентрированная;
• калий марганцовокислый по ГОСТ 20490, 0,1 н. раствор;
• перекись водорода «медицинская» по ГОСТ 10929, 0,5%-ный раствор;
• вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
• натрий фосфорнокислый двузамещенный кристаллический по ГОСТ 11773; х. ч. или ч. д. а.

Подготовка к анализу. Проверка пригодности 2%-ного раствора со­лянокислого пара-фенилендиамина.

При применении 2%-ного раствора солянокислого пара-фенилендиамина, хранившегося более 1–2 дней, следует проверить его пригод­ность. Для этого в пробирке нужно вскипятить 5 см³ молока, охладить, прилить 2,5 см³ буферной смеси, перемешать и поместить на 3–5 мин в водяную баню с температурой воды (35 ± 2) °С. Затем прибавить 6 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода и 3 капли раствора солянокислого пара-фенилендиамина, перемешать и снова поместить в водяную баню. Появление темно-синей или серовато-синей окраски указывает на непригодность раствора.

Приготовление буферной смеси. 97 г двузамещенного фосфорнокис­лого натрия и 0,65 г лимонной кислоты, взвешенных с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 см³, доливают до метки и перемешивают. Буферную смесь следует сохранять в склянке из темного стекла с плотно закры­той пробкой.

Определение содержания перекиси водорода в концентрированном рас­творе. 3–4 г концентрированной перекиси водорода, взвешенной с по­грешностью не более 0,01 г, переносят без потерь в мерную колбу вме­стимостью 250 см³, доводят водой до метки и перемешивают. 10 см³ приготовленного раствора переносят в коническую колбу вместимо­стью 250 см³, добавляют 50 см³ воды, 10 см³ разбавленной серной кис­лоты (1:4) и содержимое титруют 0,1 н. раствором марганцовокисло­го калия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Параллельно проводят контрольный опыт в тех же условиях, с тем же количеством реактивов и воды (без перекиси водорода).

Массовую долю перекиси водорода X, %, вычисляют по формуле:

где V – количество точно 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, израсходованное на титрование раствора перекиси водорода, см³; V₁ – количество точно 0,1 н. раствора марганцовокислого калия, из­расходованное на контрольное титрование, см³; 0,0017 – количество перекиси водорода, соответствующее 1 см³ точно 0,1 н. раствора мар­ганцовокислого калия, г; т – навеска перекиси водорода, г.

Приготовление 0,5%-ного раствора перекиси водорода. Для приго­товления 0,5%-ного раствора перекиси водорода имеющийся концен­трированный раствор, в зависимости от содержания в нем перекиси водорода, разводят водой, предварительно прокипяченной и охлаж­денной. Раствор быстро разлагается, поэтому его следует приготовлять в небольшом количестве.

Растворы следует сохранять в склянке из темного стекла в прохлад­ном месте.

Проведение анализа. В пробирку отмеривают или отвешивают ана­лизируемый продукт и дистиллированную воду. Количество дистил­лированной воды и анализируемого продукта должно соответствовать указанному в табл. 32.

 Таблица 32

Затем в пробирку с указанным количеством продукта и воды при­ливают 2,5 см³ буферной смеси, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают в водяную баню с температурой воды (35 ± 2) °С, где выдерживают 3–5 мин, чтобы содержимое пробирки приняло эту температуру. Затем добавляют 6 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода и 3 капли раствора пара-фенилендиамина солянокислого, перемешивают вращательными движениями содержимое пробирки после добавления каждого реактива. После этого снова помещают пробирку в водяную баню и наблюдают изменение окраски жидкости.

Оценка результатов. При отсутствии фермента пероксидазы в моло­ке цвет содержимого пробирки не изменяется. Следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 80 °С.

При наличии пероксидазы в молоке содержимое пробирок приобретает темно-синее окрашивание. Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5 % непастеризованного молока к пастеризованному.               

 Определение пероксидазы по реакции с йодистокалиевым крахмалом

Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой, содержащейся в молоке. Освобождающийся при разложении перекиси водорода активный кислород окисляет йодистый калий, освобождая йод, образующий с крахмалом соединение синего цвета.

Аппаратура, материалы и реактивы:

• весы лабораторные аналитические;
• весы лабораторные технические;
• пробирки по ГОСТ 23932;
• пипетки вместимостью 2 и 5 см³ по ГОСТ 29169;
• пипетки вместимостью 5 или 10 см³ с ценой деления 0,1 см³ по ГОСТ 29169;
• капельницы из темного стекла или покрытые черным лаком;
• колбы мерные вместимостью 250 и 500 см³ по ГОСТ 1770;
• колбы конические вместимостью 250 см³ по ГОСТ 1770;
• перекись водорода «медицинская» по ГОСТ 10929, 0,5%-ный раствор;
• крахмал картофельный по ГОСТ 7699;
• калий йодистый по ГОСТ 4232, х. ч. или ч. д. а.;
• вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
• воронки стеклянные В-56-80 ХУ-1 по ГОСТ 25336;
• фильтры бумажные диаметром 11 см.

Подготовка к анализу. Приготовление 0,5%-ного раствора перекиси водорода. Для приготовления 0,5%-ного раствора перекиси водорода имеющийся концентрированный раствор, в зависимости от содержа­ния в нем перекиси водорода, разводят водой, предварительно про­кипяченной и охлажденной. Раствор быстро разлагается, поэтому его следует приготовлять в небольшом количестве.

Приготовление йодистокалиевого крахмала. 3 г крахмала взвешива­ют с погрешностью не более 0,01 г и смешивают с 5–10 см³ дистилли­рованной холодной воды до получения однородной массы. Отдельно в колбе доводят до кипения 100 см³ дистиллированной воды и при не­прерывном помешивании приливают воду к разведенному крахмалу, не допуская образования комков. Полученный раствор доводят до ки­пения. После охлаждения к раствору крахмала прибавляют 3 г йодисто­го калия, перемешивая до растворения кристаллов йодистого калия.

Раствор йодистокалиевого крахмала является нестойким реактивом, поэтому приготовлять его следует в небольшом количестве и сохранять в темном прохладном месте не более двух дней.

Проверка пригодности раствора йодистокалиевого крахмала. Для определения пригодности раствора йодистокалиевого крахмала, хра­нившегося более двух дней, перед употреблением его необходимо про­верить. Для этого в пробирке нужно вскипятить 5 см³ молока, охла­дить, прилить 5 капель раствора йодистокалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода и перемешать. Появление темно-синей или серовато-синей окраски указывает на непригодность раствора.

Допускается вместо йодистокалиевого крахмала применять отдель­но приготовленный 1%-ный раствор крахмала и 10%-ный раствор йодистого калия.

Проведение анализа. В пробирку с указанным количеством продук­та и воды приливают 5 капель раствора йодистокалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода, вращательными движениями перемешивают содержимое пробирки после добавления каждого реактива. Затем определяют наличие пероксидазы по измене­нию окраски.

Если применяют отдельно раствор крахмала и йодистого калия, то поступают следующим образом: в каждую пробирку с продуктами, подготовленными, как указано ранее, приливают 0,5 см³ 1%-ного рас­твора крахмала, 2 капли 10%-ного раствора йодистого калия и 5 ка­пель 0,5%-ного раствора перекиси водорода, перемешивают содержи­мое пробирок после добавления каждого реактива, затем определяют наличие пероксидазы по изменению окраски.

Оценка результатов. При отсутствии фермента пероксидазы в моло­ке и молочных продуктах цвет содержимого пробирки не изменится. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастери­зации при температуре не ниже 80 °С.

При наличии пероксидазы в молоке, сливках содержимое пробирок приобретет темно-синее окрашивание. Следовательно, молоко не под­вергалось пастеризации или подвергалось пастеризации при темпера­туре ниже 80 °С, или было смешано с непастеризованным молоком. Появление окраски в пробирках более чем через 2 мин после добав­ления йодистокалиевого крахмала и перекиси водорода не указывает на отсутствие пастеризации, так как может вызываться разложением реактивов.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не ме­нее 5 % непастеризованного молока к пастеризованному.