В процессе физиологической жизнедеятельности микроорганизмов-прокариот осуществляется непрерывный обмен веществ микробной клетки с естественной или искусственной средой обитания (окружающая среда, организм человека и животных, питательные среды). Основные физиологические функции клетки заключаются в питании, дыхании, росте и размножении. Совокупность взаимосвязанных реакций синтеза и распада веществ – анаболизма (конструктивного обмена) и катаболизма (энергетического обмена) составляют основу метаболизма микроорганизмов. В процессе метаболизма происходят также реакции промежуточного обмена – амфиболизма. Конечные продукты, образующиеся в ходе метаболизма, называются метаболитами, а промежуточные – амфиболитами.
В ходе анаболизма происходит синтез сложных макромолекул из более простых, а также образование или обновление клеточных структур. При катаболизме, наоборот, сложные высокомолекулярные органические соединения расщепляются на составляющие низкомолекулярные вещества. Все реакции конструктивного обмена относятся к восстановительным и сопряжены с использованием химической энергии, аккумулированной в фосфатных связях и других богатых энергией соединениях. Реакции энергетического обмена – окислительные и сопровождаются выделением энергии. Источниками энергии могут быть органические и неорганические субстраты, свет.
Метаболические реакции условно делятся на первичные и вторичные. Первичные метаболические реакции способствуют образованию и расщеплению белков, их предшественников, оснований, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и т.д. Вторичные метаболические реакции связаны с образованием веществ, несущественных для функционирования микробной клетки. Соответственно, метаболиты подразделяют на первичные (ферменты, антигены, другие белки) и вторичные (антибиотики, бактериоцины, токсины, гормоны и т.д.). Образующиеся метаболиты могут иметь эндогенную локализацию (эндометаболиты) или выделяться экзогенно (экзометаболиты).
Реакции первичного обмена связаны с периодом активного роста и размножения микробных клеток, а реакции вторичного обмена – с замедлением скорости размножения клеток или с их деструкцией.
9.1.1. Питание микроорганизмов
Микроорганизмы характеризуются разной способностью использовать органические и неорганические источники питания и энергии. Чем больше готовых соединений получает микроорганизм, тем ниже его способность к биосинтезу основных клеточных макромолекул. Для питания прокариотической клетки используются углерод, азот, кислород, водород, фосфор- и серосодержащие вещества, а также потребляются ионы К, Са, Na, Mg, Fe, другие элементы и микроэлементы (Мо, Zn, Cu, Co, Ni и т.д.). Наиболее важными из этих веществ являются углерод и азот, входящие в состав многих органических биополимеров клетки. По характеру усвоения углерода и азота определяют типы питания микроорганизмов.
По способности усваивать углерод бактерии подразделяют на две группы: аутотрофов (от греческого autos – сам, trophe – питание), потребляющих в качестве единственного источника СО2 (например, почвенные бактерии), и гетеротрофов (от греч. heteros – другой), усваивающих углерод органических соединений (гексозы, иногда – пентозы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты и т.д.). Некоторые представители прокариот потребляют восстановленные углеродные соединения. Например, углеводороды могут утилизировать Соrynebacterium, Pseudomonas, Mycobacterium.
По способности усваивать азот, необходимый для синтеза аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, микроорганизмы делят на аминоаутотрофов, использующих для синтеза белка молекулярный азот воздуха (например, азотобактер, клубеньковые бактерии, актиномицеты, цианобактерии), и аминогетеротрофов, использующих азот органических соединений (белки, аминокислоты, мочевина и др.), расщепляя их с выделением аммиака. Большинство бактерий потребляют азот в восстановленной форме (соли аммония – NH4+ и аммиака – NH3), например некоторые энтеробактерии, Staphylococcus saprophytics и др. Ряд бактерий усваивают азот аммонийных солей (нитратов и нитритов) в присутствии аминокислот и пуринов (Proteus, Salmonella, Shigella, Vibrio и др.). Ассимиляции азота аминогетеротрофами могут способствовать факторы роста (Yersinia, Corynebacterium, Mycobacterium и др.).
Прихотливые микроорганизмы нуждаются в сложных по своему составу питательных средах (Bartonella, Listeria, Haemophilus, Francisella и др.).
Органотрофы разделяют на сапрофитов (от греч. sapros – гнилой, phyton – растение) и паразитов (от греч. parasitos – нахлебник). К сапрофитам относится наибольшая часть существующих бактерии. Паразиты (около 0,1 % видов бактерий) существуют за счет органических веществ живых клеток. Различают облигатных (риккетсии, вирусы и др.) и факультативных паразитов (возбудители менингита, гонореи, сибирской язвы, пневмонии, дизентерии, коклюша, туберкулеза). Однако не всегда между ними, а также сапрофитами, можно сделать четкое разделение, так как в зависимости от условий обитания патогенные бактерии могут существовать в природе как сапрофит и способны вызвать заболевания у человека и животных.
Органические соединения, не синтезируемые многими прокариотами, но необходимые для их жизнедеятельности и получаемые из среды, называют факторами роста (например, витамины, аминокислоты, пурины, пиримидины и др.). Прихотливые бактерии, нуждающиеся в каком-либо из факторов роста, относят к ауксотрофам. Ауксотрофность может возникать вследствие мутаций в геноме. Микробы, способные самостоятельно синтезировать факторы роста, называют прототрофами. Прототрофов, от которых возникли ауксотрофные варианты, называют культурой "дикого типа". Потребности бактерий в факторах роста существенно различаются. Так, молочнокислые бактерии являются ауксотрофами по многим аминокислотам, пуринам, пиримидинам, витаминам. Штаммы E.coli оказываются ауксотрофными, как правило, по какому-то одному фактору роста. Очень часто микробы ауксотрофны по аминокислотам. Для Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, Bacillus anthracis фактором роста является глутаминовая кислота. Haemophilus influenzae требует для выращивания гемин (компонент цитохрома, Х-фактор) и коэнзим (V-фактор) фермента дегидрогеназы. Ауксотрофность в отношении витаминов, особенно группы В, входящих как кофакторы в ферменты, выявлена у многих микроорганизмов. Так, ауксотрофность к витамину В5 (никотинамид) наблюдается у Shigella, В тиамине (В1) нуждаются Brucella, Leuconostoc, в витамине Н (биотин) нуждается Candida, в пантотеновой кислоте – Cl.tetani.
Ростовыми факторами являются также витамин В2 (рибофлавин), входящий в дыхательные ферменты – дегидрогеназы, витамин В6, содержащийся в трансаминазах и декарбоксилазах. Для Streptococcus pneumoniae, N. gonorrhoeae, Shigella ростовым фактором оказалась также парааминобензойная кислота, необходимая для образования аминокислот (серии, гистидин, тирозин, метионин) и пуриновых оснований. Многие бактерии нуждаются в фолиевой кислоте (Enterococcus faecalis и др.). Особенностью микоплазм является ауксотрофность к веществам, необходимым для биосинтеза мембранных структур (стерины, жирные кислоты с длинной углеродной цепью, глицерин).
Ростовые факторы требуются бактериям в очень низких концентрациях. Для оптимального роста ауксотрофных бактерий достаточно 20–50 мкг/мл аминокислот, 10–20 мкг/мл пуринов и пиримидинов, от 0,2 до 50 мкг/мл витаминов. Ростовые факторы для добавления к питательным средам могут быть получены в виде экстрактов из дрожжей, печени и сердца животных, яиц, семян, проростков зерновых, а также препаратов крови и др.
По источникам энергии микроорганизмы разделяют на фототрофов, использующих солнечный свет, и хемотрофов, получающих энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.
По признаку донорства электронов бактерии делят на литотрофов (от греч. litos – камень), способных использовать неорганические соединения в качестве доноров электронов (Н2, СО2, NH3, H2S, Fe2+ и т.д.), и органотрофов, использующих органические вещества. Некоторые микроорганизмы от одного типа питания могут переходить к другому типу.
С учетом использования различных источников получения углерода, азота, энергии и электронов охарактеризованы четыре основных типа метаболизма прокариотических микроорганизмов: фотолитоаутотрофы (используют СO2, свет, неорганические соединения), фотоорганотрофы (используют СO2, свет, органические соединения), хемолитоаутотрофы (используют СO2, неорганические вещества и их окисление) и хемоорганогетеротрофы (используют органические соединения и их окисление).
9.1.2. Транспорт питательных веществ в клетку
Клеточная стенка микроорганизмов хорошо проницаема для экзогенных субстратов, молекулярная масса которых менее 600 Да, и задерживает высокомолекулярные соединения (например, декстраны). Для транспорта питательных веществ через следующий барьер – цитоплазматическую мембрану, помимо диффузии, необходима специальная система переноса. При этом важную роль играет структура клеточной мембраны, включающей липидные и белковые молекулы, которые расположены в определенном порядке. Заряженные группы этих молекул ориентированы концами к поверхности мембраны. От заряда поверхностных коллоидных структур зависит поступление минеральных солей, диссоциирующих на ионы. Противоположно заряженные частицы легче проникают через цитоплазматическую мембрану. Транспорт веществ через клеточную мембрану происходит несколькими способами.
- Пассивная диффузия. Вещества с низкой молекулярной массой и определенной степенью липофильности проникают через мембрану медленно, без затрат энергии, по градиенту концентрации для неэлектролитов и градиенту электрических потенциалов для ионов (от большей концентрации к меньшей). Таким способом поступают вода, ингибиторы, яды и другие субстанции.
- Облегченная диффузия. Транспорт веществ извне осуществляется от более высокой концентрации к меньшей без затрат энергии, с участием субстрат-специфического мембранного белка со свойствами экзофермента – пермеазы (транслоказы). Синтез пермеаз, локализующихся на цитоплазматической мембране, индуцируется субстратом. Пермеаза катализирует присоединение транспортируемых веществ к своему активному центру и проводит его с наружной поверхности мембраны на внутреннюю. Затем она освобождается от вещества и вновь вступает во взаимодействие с субстратом.
- Активный транспорт. Перенос осуществляется с затратами метаболической энергии, а также с участием субстрат-специфических транспортных белков. Поступление веществ может происходить против градиента концентрации, т.е. от меньшей концентрации к большей. Перенос молекулы питательного субстрата осуществляется без ее изменения с участием пермеаз.
- Транслокация химической группы. Транспорт осуществляется с затратами энергии. При переносе с помощью фосфо-трансферазной системы молекула трансформируется, например фосфорилируется. Этот вид транспорта известен для кар-богидратов (глюкозы, фруктозы, зланнитола и родственных им соединений). На транспорт веществ микроорганизм расходует значительное количество вырабатываемой энергии, поскольку на перенос одной молекулы субстрата расходуется одна молекула АТФ (аденозинтрифосфат).
Чаще всего выход вещества из микробной клетки осуществляется путем пассивной или облегченной диффузии.
9.1.3. Дыхание бактерий. Энергетический метаболизм
Совокупность биохимических процессов, при которых высвобождается энергия, обеспечивается жизнедеятельность бактерий, называется дыханием (биологическое окисление). В процессе окисления окисляемый субстрат отдает электроны (донор), а восстанавливаемое вещество получает их (акцептор). Высвобождающаяся энергия используется клеткой через АДФ (аденозиндифосфат) и АТФ (аденозинтрифосфат). В бактериальных клетках эти процессы проходят в мезосомах (аналогах митохондрий у высших организмов). Окислению подвергаются углеводы (в первую очередь глюкоза), спирты, органические кислоты, жиры и т.д. У большей части аэробных бактерий, использующих органические субстраты, аэробное окисление связано с окислением пировиноградной кислоты по циклу трикарбоновых кислот (цикл Кребса). При этом окисление органического субстрата проходит с отщеплением водорода и его переносом на фермент, а также с обеспечением клетки промежуточными продуктами цикла трикарбоновых кислот. Некоторые микробы прлучают энергию из минеральных соединений, например железобактерии получают энергию при окислении железа (Fе2+ → Fе3+). Энергия используется для фиксации СО2. Бактерии, утилизирующие серу, обеспечивают клетки энергией при окислении серосодержащих соединений. Наибольшая часть прокариот снабжается энергией путем дегидрогенирования.
По типу дыхания микроорганизмы подразделяют на несколько групп.
Облигатные (строгие) анаэробы. Рост и развитие в среде происходят при отсутствии свободного кислорода. Дыхание осуществляется посредством анаэробного дегидрирования (ферментации субстрата). Кофермент дегидрогеназы – никотинамид-адениндинуклеотид (НАД) отнимает водород от субстрата. При этом образуется НАД∙Н2, от которого водород передается следующему коферменту дегидрогеназы – флавинаденозиндинук-леотиду (ФАД), превращающемуся в ФАД∙Н2. Конечными акцепторами электронов при "анаэробном дыхании" могут быть сульфаты, нитраты, нитриты, сера, Fе3+. Если конечным акцептором водорода является органический субстрат (пируват, лактат и др.), этот процесс называют брожением. По выходу конечного продукта различают реакции типов брожения: спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, пропионовокислое и т.д.
Анаэробное расщепление одной молекулы глюкозы (брожение) осуществляется следующим образом:
С6Н12О6 → 2С2Н5ОН + 2СO2 + 31,2 ккал.
Присутствие кислорода в среде губительно для анаэробов, так как конечным продуктом окисления органического субстрата является перекись водорода. Анаэробы не синтезируют каталазу, разлагающую перекись водорода, и поэтому гибнут.
К облигатным анаэробам относятся клостридии (возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма и др.).
Облигатные (строгие) аэробы. Рост и развитие происходит в атмосфере кислорода (около 20 %). Облигатные аэробы используют дыхание для получения энергии, которую клетка запасает в виде АТФ. Реакции окисления осуществляются путем аэробного дегидрирования с участием молекулярного кислорода и образованием значительного количества энергии. Перенос электронов происходит с помощью цитохромов а, b, с, являющихся белковым комплексом молекул с железосодержащей химической группой – гемом. Атом железа в геме попеременно окисляется до Fe3+ (отдает электрон) и восстанавливается до Fe2+ (присоединяет электрон). Через систему цитохромов электрон передается цитохромоксидазе. При этом кислород воздуха связывает электрон и водород среды, образуются вода и перекись водорода.
В аэробных условиях окисление глюкозы осуществляется следующим образом:
С6Н12O6 + 6O2 → 6СO2 + 6Н2O + 688,5 ккал.
При аэробном расщеплении одной молекулы глюкозы выделяется примерно в 22 раза больше энергии, чем при анаэробном.
К облигатным аэробам принадлежат туберкулезная палочка, бруцеллы и др. Они растут на поверхности жидких и плотных питательных сред.
Микроаэрофилы. Бактерии требуют для своей жизнедеятельности существенно меньшего количества кислорода. Некоторые из них ("капнофильные микроорганизмы" от греч. kapnos – дым, philos – любящий) хорошо растут при повышенном содержании СO2. Высокие концентрации свободного кислорода воздуха задерживают рост микроаэрофилов. К микроаэрофилам относятся лептоспиры, боррелии, актиномицеты и др.
Факультативные анаэробы. Размножение может происходить как при наличии, так и в отсутствие молекулярного кислорода. К факультативным анаэробам относится большинство патогенных, условно-патогенных и сапрофитных бактерий (эшерихии, брюшнотифозная, паратифозная, дизентерийная бактерии, стрептококки и т.д.). Факультативные анаэробы одновременно могут осуществлять как аэробное окисление, так и брожение (гликолиз), конечным продуктом которого является молочная кислота. Например, Escherichia coli в углеводной среде вначале ведет себя как анаэроб, затем растет как анаэроб, окисляя продукты брожения, например молочную кислоту, до СO2 и воды.
9.1.4. Ферменты микроорганизмов
Ферменты являются высокомолекулярными биологически активными веществами белковой природы, синтезируемыми микробной клеткой. Наименование фермента составляется из названия субстрата с добавлением суффикса "аза" (сахароза – сахараза, лактоза – лактаза и т.д.).
Молекулярная масса ферментов варьирует от нескольких тысяч до сотен тысяч килодальтон. Ферментные белки могут быть простыми, построенными из полипептидных цепей, и сложными (многокомпонентными; как правило, это гликопротеины). Трипсин, пепсин, уреаза, лизоцим, фосфатаза и др. являются простыми белками, а рибонуклеаза, карбоксипепти-даза, амилаза и др. – сложными. Сложные ферментные белки состоят из нескольких частей. Белковый компонент называется апоферментом. Одна из составных частей называется коферментом (если это лабильный диссоциирующий компонент) или простетической группой (если связь с белковым ингредиентом прочная). Коферментами могут быть витамины или комплексно соединенные с белком металлы, например Fe в каталазе, пероксидазе, Zn в угольной ангидразе, Ca в щелочной протеазе, Сu в полифенолоксидазе, Мo в нитратредуктазе. Помимо этого, имеются вещества, не входящие в состав фермента, но активизирующие его функции, называемые кофакторами (вещества, ионы металлов).
Для ферментов характерна высокая специфичность в отношении субстрата. Специфичность обеспечивается активным центром (каталитическим сайтом фермента), построенным из группы аминокислот путем его связи с субстратом в нескольких точках. В активных центрах фермента часто выявляют гистидин, серии, тирозин. В отличие от катализаторов химической природы ферменты катализируют только одну реакцию. Так, лактаза расщепляет только лактозу, сахараза – сахарозу и т.д.
Ферменты объединены в 6 основных классов:
Оксидоредуктазы – участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, осуществляя перенос электронов или атомов водорода от донора к акцептору. К ним относят дегидрогеназы, оксидазы (цитохромоксидаза, катал аза, пероксидаза и др.).
Трансферазы – катализируют процессы межмолекулярного переноса химических элементов. К ним относят фосфотранс-феразу, аденозинтрифосфатазу и др.
Гидролазы – катализируют гидролитическое расщепление пептидных, эфирных, гликозидных и других связей. К ним относят эстеразы (фосфатаза, ДНКаза, РНКаза и др.), карбогидразы (расщепляющие углеводы, например β-галактозидаза), протеазы (аминопептидазы, протеиназы, трипсин и др.), амидазы (уреаза, аргиназа и др.).
Лиазы – катализаторы реакции с присоединением по двойным связям и обратных реакций с отрывом этих групп. К ним относят декарбоксилазы, дезаминазы, альдолазу, фумаразу и т.д.
Изомеразы – катализируют процессы изомеризации при внутренней конверсии разных изомеров (геометрических изомеров, изомеров оптических, изомеров положения). К ним относят глюкозо-6-фосфатизомеразу, рацемазу и др.
Лигазы (синтетазы) – катализируют связывание между собой молекул в реакциях расщепления пирофосфатной связи, например в молекуле АТФ. К ним относят глутаминсинтетазу, аспарагинсинтетазу, карбоксилазу и др.
Ферменты различаются по своей активности, которую измеряют в МЕ – международных единицах. 1 МЕ соответствует количеству фермента, превращающего 1 микромоль субстрата В течение 1 мин. Активность ферментов зависит от температуры среды, рН, магнитного поля, других ферментов и т.д. Оптимальная величина рН для многих ферментов около 7,2–7,4. Оптимальная температура в пределах 37–50°С. Ферменты, локализующиеся внутри клетки (в протоплазме, цитоплазматической мембране), называют эндоферментами (пептидаза и др.), а внеклеточно – экзоферментами (гидролазы, пермеазы и т.д.). Ферменты, постоянно образуемые в бактерии в определенной концентрации, независимо от веществ субстрата называют конститутивными. Эти ферменты связаны в основном с клеточным обменом (протеазы, уреаза, липаза, карбогидраза). Индуцибельными называют ферменты, интенсивность синтеза которых резко увеличивается при наличии субстрата β-лактамаза, разрушающая пенициллин, β-галактозидаза, амилаза, расщепляющая крахмал, нитратредуктаза и т.д.).
Известна катаболитная репрессия синтеза ферментов ("глюкозный эффект"), которую наблюдают в тех случаях, когда в питательной среде содержится, помимо глюкозы или фруктозы, другой источник углерода (лактоза, арабиноза, галактоза, сорбитол, глицерол, ацетат и др.). Пока глюкоза присутствует в среде, не происходит синтеза фермента для утилизации других карбогидратов.
Важное место в процессах метаболизма отводится аллостерическим ферментам. Эти ферменты активно регулируют потребности в конечных продуктах (регуляция "конечным продуктом"). Например, избыточное количество конечного продукта будет подавлять активность первого фермента, участвующего в биосинтезе продукта.
Помимо ферментов обмена веществ, патогенные микробы синтезируют "ферменты агрессии", относящиеся к факторам патогенности. Например, гиалуронидаза, расщепляющая межклеточное вещество соединительной ткани, продуцируется стрептококками и др.; фибринолизин растворяет фибрин, продуцируется гемолитическим стрептококком серогруппы А, патогенными стафилококками, клостридиями и др.; плазмокоагулаза коагулирует плазму, образуется патогенными стафилококками и другими патогенами; гемолизин разрушает гемоглобин крови, образуется стрептококками, стафилококками, энтерококками и др.; лецитиназа С – фермент-токсин, синтезируется многими патогенными бактериями; нейрамидаза разрушает связи в полисахаридах и углеводных компонентах сложных белковых соединений, образуется холерным вибрионом, дифтерийной палочкой, стрептококками и др.; лизоцим (мурами-даза) продуцируется некоторыми микроорганизмами, разрушает клеточные стенки бактерий.
Ферментный набор микробной клетки, подобно другим свойствам, всегда постоянен и контролируется геномом.