Бактериофаги – вирусы бактерий, широко распространенные в природе, выделяют из воды, почвы, сточных вод, клинического материала от больных (гной, фекалии и др.). Бактериофаги найдены почти у всех видов бактерий. Их активность при определенных условиях проявляется в виде лизиса (разрушения) своих хозяев.
Бактериофаги обладают специфичностью действия в отношении своих хозяев – бактериальных клеток, так как не могут инфицировать более сложные организмы из-за кардинальных различий в коде внутримолекулярных механизмов и различий в строении клеточных оболочек.
Становление бактериофагии как отдельного направления вирусологии уходит своими корнями еще в XIX в. В 1896 г. Э. Хавкин обнаружил антимикробную активность водных образцов из рек Индии. Эти препараты, предварительно пропущенные через бактериальные фильтры, ингибировали рост культуры холерного вибриона. В 1898 г. Н.Ф. Гамалея и соавт. наблюдали растворение культуры возбудителя сибирской язвы под действием фильтрата этого микроорганизма и назвали его (фильтрат) бактериолизином. В 1915 г. Эдвард Творт описал агент, проходящий через бактериальный фильтр и вызывающий лизис стафилококковых бактерий, а в 1917 г. независимо от него Феликс Д’Эррель – феномен литического действия фильтрата испражнений переболевшего дизентерией, что выразилось в просветлении бульонной культуры и образовании "стерильных пятен" на агаровой культуре возбудителя. Он назвал это явление бактериофагией, а литический агент, способный размножаться на гомологичных бактериях, – бактериофагом (от лат. phagos – пожирающий бактерии). В книге "Бактериофаги" (1922) Д'Эррель рассмотрел природу фага, методы его выделения. Вся его дальнейшая деятельность была посвящена изучению бактериофагов, их использованию в лечении инфекционных заболеваний. В настоящее время бактериофаги применяют в медицине для диагностики, лечения и профилактики инфекционных заболеваний.
Неоценима роль бактериофагов в качестве моделей генетических и биохимических исследований, начатых в 30-е годы прошлого столетия. За несколько десятилетий изучения систем фаг–клетка были сформулированы основные принципы современной молекулярной биологии.
Химический состав. Основными компонентами бактериофагов являются белки (50–60 %) и нуклеиновые кислоты (40– 50 %), представленные либо ДНК, либо РНК. Следует отметить, что в состав бактериальных вирусов могут входить как одноцепочечные, так и двухцепочечные ДНК и РНК. Некоторые фаги содержат липиды и другие минорные компоненты (гликопротеины, низкомолекулярные сахара, полисахариды, полиамины).
Морфология бактериофагов. С момента открытия явления бактериофагии вопрос о структурной организации бактериальных вирусов долгое время оставался открытым. Интенсивное развитие этого направления началось после внедрения электронной микроскопии в практику вирусологических исследований.
В 1943 г. Руска опубликовал первые электронные микрофотографии нескольких бактериофагов, в дальнейшем были усовершенствованы методики приготовления вирусных препаратов и их контрастирования для изучения под электронными микроскопами, которые в свою очередь модернизировались год от года. К настоящему времени известно несколько сотен публикаций, где представлены данные о морфологии различных фагов. Обобщение этих результатов позволило все известные бактериальные вирусы разделить на так называемые морфотипы (рис. 11.1). Эта классификационная схема учитывает как строение фаговой частицы, так и особенности ее химического состава.
Рис. 11.1. Морфотипы бактериальных вирусов (приведено с дополнениями из работы: Re-anney D.C., Ackermann H.W. // Adv. Vir. Res. - 1982. - Vol. 27. - P. 205).
Рис. 11.2. Бактериофаги различных морфотипов.
а – фаг Т6 E.coli; б – фаг STPZ S.pyogenes; в – фаг РР-33 B.malley; г – фаг О4 Ps. aeruginosa; д – фаг О3 Ps. aeruginosa;
е – фаг FP-1 Y.pestis; ж – фаг MS-2, адсорбированный на фрагменте фимбрии E.coli.
Контрастирование 1 % раствором ура-нилацетата. х 200 000.
На рис. 11.2 представлены электронные микрофотографии бактериальных вирусов различных морфотипов. Бактериофаги одного морфотипа могут значительно отличаться друг от друга по строению отдельных дискретных структурных элементов, например сложноустроенные фаги с сокращающимися хвостовыми отростками. На рис. 11.3 дана схема строения фага Т2. На электронной микрофотографии (рис. 11.4) можно видеть несколько структурных компонентов хвостового отростка бактериального вируса Т2: чехол, стержень, базальную пластинку и хвостовые фибриллы.
Резистентность фагов к инактивирующим агентам. Большинство известных бактериальных вирусов сохраняют активность при рН от 3 до 9, выдерживают давление в несколько тысяч атмосфер и могут длительно (3–5 лет) храниться в лиофилизи-рованном состоянии. Вместе с тем фаги инактивируются при 60 °С в течение 30–60 мин. Облучение ультрафиолетовыми лучами приводит к быстрой гибели бактериофагов.
Все бактериальные вирусы резистентны к протеолитическим ферментам и нуклеазам. Бактериофаги, не содержащие липидов, устойчивы к хлороформу. Ферментные яды (азид натрия, динитрофенол, флорид) не инактивируют фаги. Эти агенты иногда добавляют к фаговым препаратам для предотвращения их контаминации бактериями и грибами.
Специфичность взаимодействия фагов с бактериями. Для бактериофагов характерна строгая специфичность, что может выражаться в способности лизировать бактерии только одного вида – видовая специфичность, либо внутри вида – типовая специфичность.
Рис. 11.3. Строение фага Т2 Е.соlі.
1 – головка; 2 – ДНК; 3 – стержень; 4 – чехол;
5 – базальная пластина; 6 – шипы; 7 – хвостовые фибриллы.
Рис. 11.4. Бактериофаг Т2 Е.соlі и структурные элементы его хвостового отростка. Контрастирование 1 % раствором уранилацетата. × 250 000.
Если фаги лизируют бактерии близких видов, входящих в один род, например в род Shigella (возбудители дизентерии), то их называют поливалентными.
По конечному результату взаимодействия с клеткой все фаги можно разделить на вирулентные и умеренные.
Инфицирование чувствительных бактериальных клеток активными фаговыми частицами называют фаговой инфекцией, которая состоит из следующих этапов (на примере Т-четного фага Е.соН, рис. 11.5):
Рис. 11.5. Взаимодействие фага с фагочувствительной бактериальной клеткой.
1 – стадия адсорбции; 2 – стадия инъекции ДНК; 3 – стадия репродукции; 4 – вегетативная стадия; 5 – стадия лизиса бактериальной клетки и выхода зрелых фаговых частиц.
- стадия адсорбции – при наличии соответствующих рецепторов на поверхности бактериальной клетки (фагочувствительный штамм) фаг фиксируется с помощью нитей отростка. На микрофотографиях (рис. 11.6) показана адсорбция бактериальных вирусов на бактериях-хозяевах;
- стадия инъекции фаговой нуклеиновой кислоты внутрь бактерии – шипы базальной пластинки примыкают к бактериальной клетке, с ферментами отростка нарушается ее целостность, чехол стержня сокращается, и через канал стержня нуклеиновая кислота фага впрыскивается внутрь клетки. Пустая белковая оболочка остается снаружи;
- затем следует стадия репродукции нуклеиновой кислоты и белков фага за счет внутренних структур бактерии;
- нуклеиновая кислота фага перепрограммирует обмен веществ бактерии на репродукцию фаговых частиц (вегетативный фаг) – вегетативная стадия;
- последним этапом фаговой инфекции является стадия лизиса клетки и выхода зрелых фаговых частиц, готовых к новому заражению. Их количество варьирует от нескольких частиц до нескольких сотен в зависимости от вида фага. Далее этот литический процесс, характерный для вирулентных фагов, повторяется с новыми, повторяется
с новыми и новыми бактериальными клетками. Визуально в жидкой питательной среде это проявляется в виде просветления бульонной культуры вплоть до полной прозрачности, на плотной питательной среде – в виде прозрачных пятен – фаговых колоний, которые могут сливаться в зону сплошного лизиса (рис. 11.7).
Рис. 11.6. Адсорбция фаговых частиц на поверхности клеток.
а – фаги Fp-1 на клетке Y. pestis.× 30 000; б – фаги FP-2 на поверхности клетки возбудителя чумы, × 90 000; в – взаимодействие фагов О4 с клеткой Ps. aeruginosa, × 70 000; г – адсорбция фага MTPN-2 на поверхности клетки возбудителя туберкулеза, × 60 000.
Контрастирование 1 % раствором уранилацетата.
Умеренные фаги, инфицируя бактериальную клетку, встраивают свою нуклеиновую кислоту в генетический материал бактерии, репродуцируясь синхронно с ним в процессе деления клетки. В результате новые бактериальные клетки несут в себе неактивную форму фага – профаг, такое состояние бактерии называют лизогенным. Лизогенные бактериальные штаммы устойчивы к повторному заражению этим фагом. При воздействии на лизогенные штаммы УФ-излучением и некоторыми химическими веществами профаг может перейти в вирулентную форму и лизировать бактериальную клетку.
Рис. 11.7. Фаголизис бактериального штамма на плотной питательной среде.
Лизогенизация часто сопровождается изменением свойств бактерии. Пример – переход нетоксигенного штамма возбуди теля дифтерии в токсигенный. Следует отметить, что этот феномен наблюдали только в экспериментальных условиях, но не в природе. Изменение характеристик бактериального штамма под влиянием профага называют фаговой конверсией.
На практике это может играть негативную роль, например на микробиологических производствах при лизогенности штаммов – продуцентов вакцин, антибиотиков; при производстве препаратов нормофлоры; в молочной промышленности – при производстве кисломолочных продуктов и сыров.