Многие сложные дифференциально-диагностические мето­ды окраски, например окраску по Граму, определение кисло­тоустойчивости, специфический метод окраски Леффлера и некоторые другие, можно рассматривать как один из первых этапов идентификации микроорганизма.

Дифференциальные методы окраски предусматривают сле­дующие процедуры:

• подготовленный к окраске фиксированный мазок окраши­вается первично тем красителем, которым надеются вы­явить предполагаемый возбудитель болезни;
• первичное окрашивание распространяется на все микроор­ганизмы, находящиеся в мазке. Поэтому вслед за ним сле­дует протрава мазка химическим соединением, конкретным в каждом отдельном случае – кислотами, спиртом, щелоча­ми, фенолом и пр., целью которой является обесцвечивание всех находящихся в мазке микроорганизмов, кроме искомых потенциальных возбудителей предполагаемого заболевания;
• после протравы следует вторичное дополнительное окрашивание краской контрастного цвета. Предыдущая протрава способствует прикреплению краски к обесцвеченным кле­точным компонентам, и в дополнительный цвет окрашива­ются практически все находящиеся в мазке микроорганизмы, кроме возбудителя болезни, для обнаружения которого применяется конкретный метод обесцвечивания, не влия­ющий на искомого возбудителя.

6.4.1. Дифференциальная окраска по методу Грама

В конце XIX столетия датский бактериолог Ханс Христиан Грам предложил метод дифференциальной окраски, разделив­ший большую часть известных патогенных бактерий на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные микроорганизмы содержат в клеточной стенке большое количество тейхоевых и липотейхоевых кислот, связанных с пептидогликанами и образующих многослойную волокнистую структуру.

Поэтому при окраске по Граму эти микроорганизмы удер­живают комплекс первичного красителя трифенилметиловой группы (генциан-, метил-, кристаллвиолет).

Грамотрицательные бактерии снаружи покрыты одним сло­ем пептидогликана, связанного с цитоплазматической мембра­ной посредством липопротеина, наружная мембрана состоит из липополисахаридов, фосфолипидов и белков. Из-за более Высокого содержания липидов клеточные стенки грамотрицательных бактерий имеют повышенную проницаемость и при Обесцвечивании спиртом первичный фиолетовый комплекс красителя легко удаляется через поры клеточной стенки, после чего бактерии приобретают цвет дополнительной окраски: ярко-малиновый при применении фуксина или желто-розовый – сафранина.

Таким образом, отношение к окраске по Граму определяет­ся структурой клеточной стенки микроба.

Спектр окрашивания по Граму включает подавляющее боль­шинство видов бактерий, имеющих то или иное значение в патологии человека. Исключение составляют плохо окраши­вающиеся Leptospira, не окрашивающиеся Treponema, Myco­plasma, L-формы бактерий, у которых отсутствует клеточная стенка, а также очень мелкие внутриклеточные паразиты Chla­midia и Rickettsia.

6.4.1.1. Методика окраски бактерий по Граму

• • На мазок, фиксированный над пламенем горелки, кладут фильтровальную бумагу и наливают избыток основного кра­сителя – карболового кристаллвиолета (рецепт 14). Прокрашивание продолжается 1–2 мин;
• снимают бумагу, сливают остаток красителя и, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя (рецепт 34) на 1–2 мин до почернения препарата;
• раствор Люголя сливают. Предметное стекло для обесцве­чивания мазка погружают несколько раз в стаканчик со спиртом. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиоле­товый цвет струйки жидкости;
• препарат тщательно промывают водопроводной водой;
• докрашивают водно-спиртовым раствором фуксина (рецепт 16) в течение 2 мин.

Результаты окраски. Грамположительные бактерии окраши­ваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окрас­ку, приобретают ярко-малиновый цвет.

В настоящее время более широкое применение в практике бактериологических исследований находит видоизмененный спо­соб окраски Грама по Синеву.

Основной краситель в виде раствора заменяют фильтроваль­ной бумагой, пропитанной 1 % спиртовым раствором кристал­лического фиолетового (см. технику приготовления красящей бумаги по Синеву, рецепт 26). На препарат помещают крася­щую бумажку и наносят на нее 2–3 капли воды. Окрашивание идет в течение 1–2 мин. Затем бумажку снимают и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым способом.

6.4.1.2. Окраска нейссерий по Граму в модификации Г. П. Калины

• На предметное обезжиренное стекло наносят каплю воды, в ней суспендируют культуру. Добавляют каплю спиртового раствора бриллиантовой зелени (рецепт 19) и размазывают тонким слоем. Диаметр мазка примерно 1,0 см;
• после подсыхания препарат фиксируют над пламенем;
• на фиксированный мазок наливают основной реактив (ре­цепт 20) на 1,5–2,0 мин;
• по истечении указанного времени краску сливают и стекло в наклонном положении промывают вначале водой, затем спиртом (до отхождения облачков краски) и снова водой;
• промытый препарат докрашивают водным раствором фук­сина в течение 2 мин, окончательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Результаты микроскопии. При микроскопии грамотрицательные бактерии выглядят ярко-розовыми, грамположитель­ные – зеленовато-черными или темно-фиолетовыми. Жела­тельно для контроля на отдельном стекле делать мазок куль­туры стафилококка и кишечной палочки.

6.4.1.3. КОН-тест для уточнения сомнительных результатов окраски по Граму

Обычно оценка результатов окраски по Граму не представляет ценностей. Однако в отдельных случаях грамположи­тельные микроорганизмы, например спороносные палочки, приобретают грамотрицательную окраску, тогда как некоторые штаммы грамотрицательных бактерий родов Acinetobacter и Moraxella имеют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, вследствие чего выглядят как грамположительные.

Для уточнения таких сомнительных результатов японский ученый Е. Куи в 1938 г. предложил КОН-тест (тест Грегерсена).

В основе этого теста лежит способность клеточных стенок Грамположительных бактерий, в отличие от грамотрицательных, сохранять целостность при воздействии на них гидроксида калия (КОН).

Для постановки этого теста петлю суточной агаровой куль­туры испытуемого штамма суспендируют на предметном стекле в капле 3 % раствора КОН.

При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, через несколько секунд жидкость а капле приобретает слизистую консистенцию, и при отрыве петли предметного стекла слизистые нити тянутся на 0,5– 2,0 см. Учет результатов пробы рекомендуется проводить на темном фоне.

Приобретение грамотрицательными бактериями слизистой Консистенции при обработке их гидроксидом калия связывают с выходом из клеток ДНК, представляющей собой вязкий Компонент.

6.4.2. Окраска по Романовскому-Гимзе

Рассматриваемый способ относится к сложным методам окраски. Применяют его главным образом при окраске маз­ков-отпечатков из органов, мазков крови, после фиксации в жидком фиксаторе Корнуа или Никифорова. Краситель Рома­новского–Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды (pH 7,0–7,2) прибавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского–Гимзы (рецепт 28).

Приготовленный раствор тотчас наливают на предметное стекло с окрашиваемым препаратом, или стекло погружают в стаканчик с красителем. Через 1 ч краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Краситель Рома­новского–Гимзы, имеющий в растворе сине-фиолетовый цвет, окрашивает протоплазму форменных элементов ткани в голу­бовато-синий цвет, а ядра клеток, так же, как и микробные тела, – в фиолетово-красный цвет (рис. 6.4 – см. вклейку).

6.4.3.        Обнаружение менингококка в "толстой капле" крови при подозрении на менингококкемию

На середину предметного обезжиренного стекла наносят толстую каплю крови диаметром 1,0 см. Стекло оставляют в горизонтальном положении до полного подсыхания крови. Препарат окрашивают водным раствором метиленового синего в течение 2–3 мин (без предварительной фиксации!). После этого осторожно смывают краску водой. Мазок подсушивают на воздухе.

При микроскопии на голубом фоне видны темно-синие ядра лейкоцитов, а между ними – единичные и парные клетки кокков темно-синего цвета.

6.4.4.        Окраска кислотоустойчивых микобактерий

Кислотоустойчивыми называют микробы, которые, будучи окрашенными карболовым фуксином, не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот.

Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Это свойство обусловлено нали­чием в клеточной стенке и цитоплазме кислотоустойчивых бактерий длинных цепочек жирных миколовой, туберкулостеариновой и других кислот с 50–100 атомами, которые делают клеточную стенку микроорганизма непроницаемой для кристаллвиолета и других красителей. Поэтому, чтобы обеспечить проникновение краски в клеточную стенку этих бактерий, при­ходится применять более концентрированные растворы красок в подогретом состоянии с добавлением детергентов и удлине­нием сроков окраски. После того как краска введена в клетку, ее нельзя обесцветить обычными кислотными и спиртовыми растворителями.

Для окрашивания кислотоустойчивых бактерий применяют обычно метод Циля–Нильсена или некоторые его модифика­ции.

6.4.4.1. Окраска по методу Циля–Нильсена

• Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3–5 мин раствором карболового фуксина Циля (рецепт 17) или окрашенной фуксином бумажкой с подо­греванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения;
• дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток красителя, препарат промывают водой;
• окрашенный препарат обесцвечивают 5 % раствором серной кислоты в течение 3–5 с или 95 % этиловым спиртом, содержащим 3 % по объему хлористоводородной кислоты (НСl), несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом;
• после обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщатель­но промывают препарат водой;
• докрашивают дополнительно метиленовым синим Леффле­ра 3–5 мин (рецепт 9);
• окрашенный препарат промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов по методу Циля–Нильсена кисло­тоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново-красный цвет и не обесцвечиваются кислотой.

Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты обесцвечиваются и приоб­ретают цвет дополнительного красителя.

6.4.4.2. Окраска по Бунге–Траутенроту

• Стекло с нанесенным на него мазком для извлечения жир­ных кислот опускают на 3 ч в абсолютный спирт;
• по истечении указанного срока стекло вынимают из спирта и погружают на 15 мин в 1N хромовую кислоту;
• промывают водой;
• окрашивают при подогревании карболовым фуксином (ре­цепт 17);
• в течение 3 мин обесцвечивают 10 % серной кислотой;
• докрашивают в течение 5 мин насыщенным спиртовым раствором метиленового синего (рецепт 7).

Метод Бунге–Траутенрота применяется для окрашивания осадка мочи при дифференциации М.tuberculosis, окрашенных в малиновый цвет, от менее кислотоустойчивых М.smagmatis, приобретающих синий цвет дополнительной краски.