Стерилизация кипячением. Кипячение является наиболее простым и легкодоступным способом стерилизации, пригодным для устранения вегетативной формы микробов. Для уничтожения спороносной микрофлоры оно неприемлемо.
Стерилизацию кипячением проводят в стерилизаторе. В него наливают холодную дистиллированную воду, так как водопроводная вода образует накипь. Стеклянные предметы погружают в холодную, металлические предметы – в горячую воду с добавлением соды. Стерилизуемые предметы кипятят на слабом огне. По окончании кипячения воду сливают, инструменты берут стерильным пинцетом, который кипятят вместе с остальными предметами.
Стерилизация прокаливанием. Бактериологические петли, сделанные из платиновой или нихромовой проволоки, стерилизуют в пламени спиртовой или газовой горелки. Такой способ стерилизации получил название прокаливания или фламбирования.
Петлю в горизонтальном положении вносят в нижнюю, наиболее холодную часть пламени, чтобы не произошло разбрызгивания находящегося на ней сжигаемого инфицированного материала. После того как он сгорит, петлю переводят в вертикальное положение, накаливают докрасна вначале нижнюю, а затем верхнюю часть проволоки и прожигают петле-держатель. Прокаливание в целом занимает 5–7 с.
Стерилизацию сухим жаром проводят в так называемых воздушных стерилизаторах – ВС (прежнее название – сухожаровая печь или печь Пастера).
Современная промышленность выпускает несколько модификаций ВС, основным различием которых является принцип устройства периодического и непрерывного действия. По форме они могут быть горизонтальными, вертикальными, круглыми, стационарными и переносными. Тем не менее каждый ВС состоит из корпуса, в котором расположены нагревательные элементы, стерилизационной (рабочей) камеры с решетчатыми полками для размещения на них стерилизуемых объектов.
Заданную температуру в рабочей камере поддерживают с помощью специальных терморегуляторов с пультом управления, который регулирует режим обработки изделий в зависимости от заданной температуры: 180 °С – 60 мин; 160 °С – 150 мин, после чего нагревательные элементы автоматически отключаются.
Упакованные соответствующим образом подлежащие стерилизации изделия загружают так, чтобы они лежали поперек пазов полок, не перекрывая продувочные окна и решетки вентиляции. Объемные изделия кладут на верхнюю металлическую решетку, чтобы они не препятствовали потоку горячего воздуха.
Правильная загрузка стерилизуемого материала в том количестве, которое допускает свободную подачу воздуха к нему, обеспечивает равномерное распределение горячего воздуха во всем объеме камеры.
Преимущества сухожарового метода стерилизации заключаются в том, что при его применении не наблюдается коррозии металлов и инструментов, не повреждаются стеклянные поверхности, равномерно нагреваются все объекты.
К недостаткам метода относится продолжительность цикла стерилизации, составляющая 2–4 ч в зависимости от объема стерилизационной камеры, количества стерилизуемых объектов и заданной температуры.
Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Наиболее часто используемым методом стерилизации является стерилизация паром под давлением в паровом стерилизаторе (автоклав).
При паровом методе стерилизации стерилизующим средством является насыщенный пар с давлением в стерилизационной камере 0,5–2,1 кгс/см2 и соответствующей температурой 110-135 °С.
Паровой стерилизатор состоит из двух котлов, вставленных друг в друга, конуса и герметически закрывающейся крышки. В зависимости от конструкции различают паровые стерилизаторы со встроенным или внешним парогенератором.
Из множества отечественных паровых стерилизаторов наиболее широко распространены в лабораториях страны вертикальные электрические автоклавы ВК-75 и ГК-100, выпускаемые Тюменским заводом медицинского оборудования. Поскольку они являются приборами повышенной опасности, их установка и эксплуатация должны строго подчиняться правилам техники безопасности, обеспечиваться регулярным техническим обслуживанием с ежегодной проверкой и клеймением манометра.
При работе с паровым стерилизатором очень большое значение имеет строгое соблюдение правил эксплуатации аппарата, имеющихся в паспорте прибора. Поэтому к работе на паровых стерилизаторах допускаются только лица, прошедшие специальное обучение, выдержавшие испытания перед квалификационной комиссией и получившие соответствующее удостоверение на право работы с паровым стерилизатором определенного образца.
Принципы этих правил являются общими для всех моделей паровых стерилизаторов, различия заключаются только в технике их исполнения, поэтому они могут быть освещены в нескольких основных положениях.
- Стерилизационную камеру парового стерилизатора загружают стерилизуемым материалом.
- Водопаровое пространство (между котлами) заполняют водой до отметки на водомерной трубке.
- Плотно закрывают крышку стерилизатора.
Для удаления воздуха из стерилизационной камеры используют различные приемы. В некоторых современных паровых стерилизаторах для этой цели предусмотрены вакуумные насосы, создающие высокий вакуум (вакуумные автоклавы).
Если паровой стерилизатор не имеет специального устройства для снижения давления, то, как в старых конструкциях, в начале работы воздух вытесняют, устанавливая автоклав на режим "текучего пара" (с открытым выпускным краном). При закипании воды из выпускного воздушного крана начинает выходить вытесняемый паром воздух, вначале отдельными порциями, затем непрерывной струей, что означает полное вытеснение из стерилизационной камеры воздуха. После этого кран закрывают, и в котле начинается постепенное повышение давления.
- • Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. После этого интенсивность подогрева уменьшается, для того чтобы давление в паровом стерилизаторе оставалось в течение нужного времени на одном уровне (табл. 4.4).
Таблица 4.4. Соотношение показаний манометра и температуры кипения воды
Показания манометра, кгс/см2 |
Температура кипения воды, °С |
Показания манометра, кгс/см2 |
Температура кипения воды, °С |
0 |
100 |
0,7 |
116 |
0,2 |
105 |
0,8 |
117 |
0,4 |
110 |
1 |
121 |
0,5 |
112 |
1,5 |
127 |
0,6 |
114 |
2 |
134 |
- По окончании срока стерилизации прекращают подогревание и продолжают наблюдать за стрелкой манометра, пока стрелка не упадет до нуля.
- Открывают пароотводный кран для выхода остатков пара и воды.
- После снижения давления в стерилизационной камере до нуля, открывают крышку стерилизатора и приступают к разгрузке стерилизационной камеры.
Температура и продолжительность стерилизации определяются качеством стерилизуемого материала и свойствами тех микроорганизмов, которыми он заражен (табл. 4.5).
Таблица 4.5. Режимы стерилизации, наиболее часто употребляемые в лабораторной практике
Объект |
Давление (кгс/см2) |
Температура (°С) |
Время (мин) |
Нормативный документ |
Изделия из коррозиестойкого металла, стекла, текстильных материалов, резины |
2±0,2 |
132 |
20±2 |
ОСТ 42-21-2-85 |
Изделия из резины, латекса и отдельных полимерных материалов |
1,1±0,2 |
120 |
45±3 |
ОСТ 42-21-2-85 |
Бактериальные культуры неспорообразующих бактерий I–II групп опасности |
1,5±0,2 |
126 |
60 |
СП 1.2.011-94 |
То же для спорообразующих бактерий |
2,0 |
132 |
90 |
СП 1.2.011-94 |
Питательные среды, растворы |
0,5-1,1 |
110–120 |
15-30 |
В соответствии с рецептами сред и растворов |
Примечание. Таблица из книги: Медицинские лабораторные технологии/Справочник. – СПб.: Интермедика, 2002.
Контроль температуры в стерилизационных камерах паровых и воздушных стерилизаторов осуществляется большей частью с помощью порошкообразных химических веществ – индикаторов, имеющих определенную температуру плавления (табл. 4.6). Запаянные ампулы с порошками, смешанными с небольшим количеством краски, помещаются в камеру со стерилизуемым материалом. Количество тестов и схемы расположения зависят от формы и размеров стерилизационной камеры.
Таблица 4.6. Показатели температуры плавления порошков-индикаторов
Химическое вещество – индикатор |
Температура, °С |
Примечание |
Бензонафтол |
110 |
На 100 г порошка-индикатора прибавляют 0,01 г сафранина, 0,005 г фуксина или метиленового синего |
Антипирин |
115 |
|
Серный цвет |
115 |
|
Резорцин чистый |
116 |
|
Бензойная кислота |
121 |
При достижении в камере определенной температуры порошки плавятся, образуя сплавы, окрашенные в цвет добавленной краски.
Недостаток химических тестов состоит в том, что цвет индикатора появляется даже при кратковременном воздействии температуры плавления на соответствующий химический индикатор.
Научно-производственной фирмой "ВИНАР" (Россия) создана комплексная система контроля критических параметров паровой (время, температура, насыщенный пар) и воздушной (время, температура) стерилизации, как в камере стерилизатора, так и внутри стерилизуемых упаковок и изделий.
Основой системы являются химические индикаторы. Они наносятся на прямоугольную полоску бумаги и представляют собой две цветные метки – индикаторную и эталон сравнения. Цвет индикаторной метки необратимо меняется при соблюдении требуемых условий стерилизации, приобретая темно-фиолетовый цвет (паровая стерилизация) или коричневый цвет (воздушная стерилизация) (рис. 4.1, а, б – см. вклейку).
Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в паровом стерилизаторе при незавинченной крышке и открытом выпускном кране.
Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды имеется кран). Крышка аппарата имеет вмонтированный в центре термометр и несколько небольших отверстий для выхода пара.
Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить наибольшую возможность контакта с паром.
Началом стерилизации считается время закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру.
В текучепаровом аппарате стерилизуют главным образом питательные среды, свойства которых изменяются при температуре выше 100 °С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при 100 °С не обеспечивает полного обеспложивания стерилизуемого объекта.
Такой метод стерилизации получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 мин ежедневно в течение 3 дней.
В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.
Тиндализация – дробная стерилизация с применением температуры ниже 100 °С, предложена Тиндалем.
Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу, при 60–65 °С в течение 5 дней или при 70–80 °С в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при 25–37 °С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают, при последующих прогреваниях.
В микробиологических лабораториях тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, свойства которых изменяются под действием высокой температуры, например жидкостей, содержащих в своем составе белок.
Механическая фильтрация с помощью бактериальных фильтров. Мембранные ультрафильтры из органического вещества нитроклетчатки представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.
Бактериальные фильтры различаются между собой величиной пор и обозначаются порядковым номером (табл. 4.7).
Таблица 4.7. Бактериальные фильтры
Номер фильтра |
Средний диаметр пор, мкм |
1 |
0,3 |
2 |
0,5 |
3 |
0,7 |
4 |
0,9 |
5 |
1,2 |
Непосредственно перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50–60 °С, чтобы предупредить их скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 мин, меняя 2–3 раза воду. Простерилизованные фильтры осторожно, чтобы избежать их повреждения, вынимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.
Мембранные фильтры используют для фильтрации жидкостей в специальном фильтровальном приборе (Зейтца или Рублевской водопроводной станции). Каждый из указанных выше приборов состоит из двух частей: верхней части, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней – опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или керамической пластинки, на которые помещают мембранный фильтр (рис. 4.2).
Рис. 4.2. Прибор Зейтца с воронкой.
Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой укрепляется в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена.
В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов (в приборе Зейтца) или специального металлического кольца с двумя пазами, надетого на шейку воронки (в приборе Рублевской водопроводной станции).
Перед началом фильтрации места соединения разных частей установки для создания герметичности заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной резиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному насосу. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, создающий вакуум в колбе Бунзена.
В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микробы остаются на поверхности фильтра.