Получения чистых культур начинают с выделения колоний на агаровой или в агаровой среде, которая была засеяна разведением испытуемой пробы или культурой.

Выделенную колонию затем пересеивают на неселективную агаровую среду. После термостатирования выделяют изолированную колонию. В случае необходимости повторяют пересев.

Для анаэробных микроорганизмов применяемый приём рассева должен проводиться с условием, что культура будет контактировать с воздухом минимально короткое время.

При прямом рассеве кончиком петли засевают тесными штрихами примерно третью часть поверхности агаровой среды. Стерилизуют и охлаждают петлю. От края засеянной поверхности продолжают другую, более разреженную, серию штрихов, засевая половину свободной площади. Процедуру повторяют на оставшейся поверхности, делая ещё более редкие штрихи, что позволяет получить изолированные колонии.

Метод с использованием жидкости для разведения заключается в суспендиировании клеток в 1-2 см³ жидкости для разведений, растирая посевной материал петлей о стенки пробирки у поверхности жидкости, затем хорошо перемешивают. Захватывают стерильной петлей небольшое количество микробной суспензии и далее осуществляют метод прямого посева.

Термостатирование. Кроме особо оговорённых случаев, переворачивают засеянные чашки Петри, помещают их в термостат и выдерживают при заданной температуре.

Выделение. После термостатирования выделяют с чашки Петри изолированную колонию для последующего рассева или проведения испытания

Заключительные испытания по возможности следует проводить на клетках, полученных из одной изолированной колонии. Если материала из одной колонии недостаточно, предварительно выращивают субкультуру на жидкой среде или на агаровых чашках Петри. После этого субкультура может быть исследована окрашиванием по Граму, постановкой пробы на каталазу, оксидазу (см. гл. 6, 9). В каждом конкретном случае дополнительный набор тестов для идентификации микроорга­низмов предусмотрен методическим документом.

22.3.1. Определение дрожжей и плесневых грибов (ГОСТ 10444.12–88)

Из подготовленной пробы продукта и(или) его разведения отбирают навеску объемом                1±0,1 см³ и высевают параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлаж­денной до температуры 45±1 °С средой Сабуро (рецепт 136). Параллельно с этим ставят контроль, для этого заливают 15– 20 см³ среды в чашку Петри с целью проверки ее стерильности. При установлении промышленной стерильности консервов и выявлении возбудителей порчи в продуктах по 2,0 см³ иссле­дуемого материала допускается высевать параллельно в две пробирки с 5 см³ жидкого солодового сусла (рецепт 137). Посевы термостатируют при 24 °С в течение 5 сут, посевы на чашках Петри термостатируют дном вверх.

Через 3 сут термостатирования предварительно учитывают типичные колонии или появление характерных признаков рос­та на жидких питательных средах.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то оценку предвари­тельных результатов проводят очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторич­ных колоний. Через 5 сут проводят окончательный учет резуль­татов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плес­невых грибов разделяют визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается об­разованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем. Развитие дрожжей в жидкой среде характеризуется появлением мути, запаха брожения и газа. При развитии плесневых грибов на питательных средах появляется мицелий различной окраски.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и(или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов. Для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов проводят микроскопические исследования. Для этого готовят препараты методом раздавленной капли (см. гл. 6). Дрожжи – одноклеточные микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, длиной от 2,5 до 30 мкм и шириной от 2,5 до 10 мкм, часто почкующиеся. Плесневые грибы состоят из нитей-гифов, без перегородок или септированных на клетки, от вегетативных гифов поднимаются спорангиеносцы, несущие плодовые тела.

Результаты обрабатывают и пересчитывают отдельно для дрожжей и плесневых грибов. Количество дрожжей и плесне­вых грибов в 1 г или в 1 см³ продукта вычисляют по формуле.

22.3.2. Определение Clostridium perfringens

Для проведения испытания отбирают объем 4±0,1 см³ под­готовленной пробы продукта, его разведения или разведения культуральной жидкости и высевают параллельно в две чашки Петри глубинным методом, приведенным выше. Посевы зали­вают триптозо-сульфит-циклосериновым (рецепт 140) или сульфит-полимиксин-неомициновым агаром (рецепт 141), са­харным кровяным агаром по Цейсслеру (рецепт 142), агаром Вильсона–Блера (рецепт 143). Содержимое чашек Петри бы­стро, осторожными круговыми движениями перемешивают. После застывания среды чашки подсушивают и заливают той же средой так, чтобы высота второго слоя питательной среды была не менее 4 мм.

Посевы термостатируют при температуре 37±1 °С в течение 18–24 ч в анаэростатах с разрежением 0,6–0,8 атм или в анаэробных условиях.

После окончания термостатирования отбирают те чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. На триптозо-сульфит-циклосериновом агаре, или сульфит-полимиксин-неомициновом агаре, или среде Вильсон–Блера образуют­ся колонии черного цвета с различной интенсивностью окрас­ки, имеющие форму двояковыпуклой линзы, комочка ваты или "самолетика". На сахарном кровяном агаре с антибиотиками (по Цейсслеру) зеленеющие на воздухе колонии окружены одной или двумя зонами гемолиза. Одна полупрозрачная зона гемолиза обусловлена действием лецитиназы. При образовании двух зон гемолиза внутренняя прозрачная зона обусловлена действием гемолизинов, а наружная – действием лецитиназы. Затем подсчитывают количество выросших характерных коло­ний.

Для подтверждения принадлежности характерных колоний к С. perfringens отбирают произвольно не менее пяти колоний и пересевают их в жидкую (вязкую) среду для мезофильных анаэробных микроорганизмов (рецепт 144).

Посевы термостатируют при температуре 37±1 °С в течение 18–24 ч. Культуральную жидкость используют для изучения морфологических и биохимических свойств микроорганизмов.

Из колоний готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. С. perfringens представляет собой грамположительные палочки размером 0,9–1,3; 3,0–9,0 мкм, обычно без спор. Палочки с закругленными концами располагаются в одиночку, попарно, в виде цепочек или штакетообразных скоплений. В спороносных палочках спора расположена субтерминально.

В посевах определяют наличие каталазы. Одновременно культуры высевают:

• — в пробирки с лакмусовым молоком (рецепт 73). Посевы инкубируют при температуре 37±1°С в течение 8–12 ч. С. perfringens вызывает бурную ферментацию лактозы с об­разованием газа, редукцию лакмуса, коагуляцию молока с последующим его свертыванием и образованием губчатого сгустка красновато-сиреневого цвета в верхней части про­бирки и просветлением сыворотки. При инкубации посевов при температуре 45±1 °С С. perfringens вызывает уже через 3–5 ч характерную реакцию ферментации молока;
• — бактериологической петлей уколом в полужидкую питатель­ную среду для изучения подвижности и редукции нитратов. Посев термостатируют при температуре 37±1 °С в течение 24 ч. С. perfringens неподвижен, растет по ходу линии посева, не вызывая помутнения всей среды. После учета подвиж­ности в эту же пробирку вносят реактив на нитриты (ре­цепт 145). Культуры, которые показывают слабую реак­цию на нитриты (т.е. розовый цвет), не учитывают, так как С. perfringens стойко дает сильную и немедленную реакцию (красный цвет);
• — бактериологической петлей уколом в питательную среду (ре­цепт 100) определяют способность ферментации лактозы и разжижения желатина (рецепт 67). Посев термостатируют при температуре 37±1 °С в течение 18–24 ч. О ферментации лактозы свидетельствуют желтое окрашивание среды и вы­деление пузырьков газа в толще среды. После учета фер­ментации лактозы пробирки с посевом выдерживают при температуре 4±2 °С в течение 1 ч. Если среда вновь не застыла, то это свидетельствует о гидролизе желатина. При сохранении вязкости среды пробирку вновь помещают в термостат при температуре 37±1 °С на 24 ч, охлаждают до 4±2°С и дают окончательную оценку способности выделен­ной культуры к гидролизу желатина. С. perfringens фермен­тирует лактозу и, как правило, разжижает желатин.

Подвижность, редукцию нитратов, разжижение желатина можно определять путем посева 6–8-часовой культуры на среду Роберта (рецепт 46). Среду непосредственно перед использо­ванием прогревают 20 мин на кипящей водяной бане, охлаж­дают до застывания в холодильнике. В подготовленную среду посев проводят уколом. Посевы инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 24 ч и после этого помещают на 20 мин в холодильник.                      С. perfringens на среде Роберта образует прямую (вследствие неподвижности клеток) красную (вследствие редукции нитратов и появления нитритов) линию, превращая среду в желеобразное состояние и не затвердевающую при температуре 2–4 °С в холодильнике (вследствие разжижения желатина).

Если при изучении культуральных, морфологических и био­химических свойств микроорганизмов, выделенных из коло­ний, обнаружены неподвижные, грамположительные, каталазоотрицательные, редуцирующие нитраты, ферментирующие лактозу, разжижающие желатин и дающие характерный рост в лакмусовом молоке палочки, то дают заключение о том, что обнаруженные микроорганизмы относятся к С. perfringens.

В случае подтверждения (в 80 % случаев) роста С. perfringens считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке, принадлежат к С. perfringens. В остальных случаях количество С. perfringens определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения морфологических и биохими­ческих свойств. Результаты испытаний пересчитывают на 1 г или 1 см³ продукта.

22.3.3. Определение бактерий рода Salmonella (ГОСТ 30519–97/Р 50480–93)

Неселективное предварительное обогащение. Навеску иссле­дуемого продукта для выявления бактерий рода Salmonella вы­севают в забуференную пептонную воду (рецепт 147). Соотно­шение массы продукта и забуференной пептонной воды 1:9.

При посеве жидких высококислотных продуктов для пред­отвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2. При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах. Доведение рН проводят асептически с применением стериль­ных растворов гидрооксида натрия и соляной кислоты. Посевы инкубируют при температуре 36±1 °С в течение 18–20 ч.

Дальнейший ход анализа по выделению и идентификации бактерий рода Salmonella ведут по той же схеме, используя те же питательные среды и применяя дифференциально-диагнос­тические тесты, которые описаны выше (см. с. 433 и 434).

Серологическое подтверждение принадлежности культур к бак­териям рода Salmonella. Серологическое подтверждение принад­лежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, давшими типичные биохимические реакции. Их предваритель­но пересевают на поверхность мясопептонного агара или среду, приготовленную из сухого питательного агара (рецепт 91).

Определение самоагглютинирующих штаммов. Помещают каплю физиологического раствора (рецепт 31) на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Покачивают осторожно стекло в течение 30–60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью лупы. Если на­блюдается разной степени склеивание бактерий, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией. Эти штаммы бактерий серологической идентификации не подлежат.

Определение наличия О-антигенов. Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают с агглютинирующи­ми адсорбированными поливалентными сальмонеллезными сыворотками основных групп А, В, С, D, Е. При отрицательных результатах с сыворотками основных групп ставят реакцию с сыворотками редких групп. Подготовка сывороток к постанов­ке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в наставлении, прилагаемом к сывороткам.

Агглютинация (наличие О-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомо­генную смесь.

В качестве контроля используют типичный по этим пока­зателям штамм бактерий рода Salmonella.

Культуры, показавшие типичные биохимические и сероло­гические реакции, относят к бактериям рода Salmonella.

22.3.4. Определение Escherichia coli (ГОСТ 30518–97/Р 50474–93)

К бактериям E.coli относят оксидазоотрицательные не обра­зующие спор грамотрицательные палочки, обладающие спо­собностью ферментации лактозы при температуре 44±1 °С, ферментирующие глюкозу и сорбит, дающие положительную реакцию с метил-рот, образующие индол, не образующие ацетоин и не утилизирующие цитрат. Бактерии, не ферментирую­щие сорбит и целлобиозу, но по другим биохимическим при­знакам давшие типичные для E.coli реакции, относят к сорбит-отрицательным штаммам E.coli.

Методика заключается в посеве на агаризованные и жидкие среды, которые инкубируют при температуре 36±1 °С в течение 24–48 ч. Посевы просматривают через 24±3 ч, отмечают нали­чие роста в жидких средах, а окончательный учет проводят через 48±3 ч.

Положительными считают посевы, давшие рост микроорга­низмов в жидких средах с глюкозой и лактозой, проявляющий­ся в помутнении среды, образовании газа, подкислении среды, что выражается в изменении ее цвета.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших в жидких средах, к E.coli делают пересевы на среду Эндо. Посевы инкубируют при температуре 36±1 °С в течение 24±3 ч. Отмечают рост характерных для E.coli колоний – от бледно-розового до темно-красного цвета, часто с металличес­ким блеском.

Для дальнейшего подтверждения принадлежности вырос­ших колоний к E.coli отбирают по три колонии каждого типа для окраски по Граму, определения оксидазы (см. гл. 9).

У оксидазоотрицательных грамотрицательных культур (па­лочки размером 1,1–1,5x2–6 мкм) определяют способность образования индола, ацетоина, сероводорода, утилизации цит­рата, углеводов, ферментации сорбита (см. гл. 9).

У культур, типичных для E.coli по всем изученным призна­кам, но не ферментирующих сорбит, изучают возможность ферментации целлобиозы на среде (рецепты 99, 100). При температуре 36±1 °С в течение 24 ч E.coli не ферментирует целлобиозу, цвет среды не меняется. Для биохимической иден­тификации выявленных бактерий допускается использование тест-систем промышленного производства.

Посевы навески продукта в жидкие среды считают положи­тельными, если хотя бы в одной пробирке будут обнаружены E.coli.

НВЧ E.coli в 1 г (1 см³) продукта определяют по количеству положительных колб (пробирок) по ГОСТ 26670–91. Резуль­таты оценивают по каждой пробе отдельно.

Если при обнаружении типичных колоний в 66 % случаев, т.е. не менее чем в 2 из 3 колоний, подтвержден рост E.coli, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри, принадлежат к E.сoli. В остальных случаях количество E.coli определяют исходя из процентного отношения подтверж­денных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

22.3.5 Определение бактерий Listeria monocytogenes

Сущность метода основана на высеве определенного коли­чества продукта в жидкие селективные среды, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на агаризованных диффе­ренциально-диагностических средах. Принадлежность выде­ленных культур к L.monocytogenes определяется по биохими­ческим, морфологическим и серологическим свойствам.

Селективность сред по отношению к сопутствующей мик­рофлоре обеспечивается включением в их состав хлорида ли­тия, акрифлавина, циклогексимида, налидиксовой кислоты, полимиксина или других антибиотиков. Внесение эскулина и цитрата аммония железа при наличии листерий дает почерне­ние среды за счет гидролиза эскулина в присутствии ионов Fe⁺⁺⁺. Подтверждающие тесты родовой и видовой идентифи­кации включают окраску по Граму, определение подвижности типичных по физиологическим и морфологическим признакам культур, их способности восстанавливать нитраты до нитритов, сбраживать рамнозу, ксилозу и маннит, способности к гидро­лизу эскулина на ГРМ среде с лецитином и активированным углем, а также определение наличия В-гемолиза на кровяном агаре и дифференциацию L. monocytogenes от других гемолизирующих листерий в САМР-тесте с контрольными штаммами S. aureus и R. equi.

Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа проводится в соответствии с действующими нормативно-мето­дическими документами.

Проведение анализа. Подготовленную навеску исследуемого продукта (гомогената) в количестве 25 г (25 см³) вносят в одну из селективных сред для первичного обогащения в количестве 225 см³ (бульон Фрейзера и др., рецепт 149). При необходи­мости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему.

Посевы термостатируют при 37 °С в течение 24±2 ч. При росте листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа аммонийного, наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На других средах почернения не. отмечается. После термостатирования продукта в среде для первичного обогащения 0,1 см³ суспензии пересе­вают в 10 см³ жидкой среды для вторичного обогащения (ре­цепт 150). Посевы термостатируют при температуре 37±1 °С в течение 48 ч. В средах с эскулином отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria.

Из пробирок после термостатирования независимо от нали­чия или отсутствия признаков роста делают пересев по 0,1 см³ на поверхность двух чашек Петри с дифференциально-диа­гностическими средами (рецепты 151, 154). Посевной материал растирают стерильным шпателем. Допускается проводить пере­сев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно под­сушивают.

Посевы термостатируют при температуре 37±1 °С в течение 24-48 ч.

Проведение анализа без этапа вторичного обогащения. При посеве продуктов с низким исходным уровнем микробной кон­таминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде (помутнение, почернение и др.) допускается проводить пересев на чашки с дифференциально-диагностическими средами сра­зу после этапа первичного обогащения.

При отсутствии роста на чашках со средами типа Оксфорд­ского агара (рецепт 152) и PALCAM-агара (рецепт 151) анализ прекращают и дают заключение об отсутствии L.monocytogenes в исследованной пробе продукта (рис. 22.1 – см. вклейку).

При обнаружении характерного роста на чашках отбирают 3–5 колоний для их дальнейшего изучения.

На средах типа PALCAM-агара через 24 ч инкубирования листерий формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, иногда с черным центром, диаметром от 0,5 до 1,0 мм. Через 48 ч колонии диаметром 1,0–2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микро­флора (бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образует желтые колонии за счет ферментации маннита.

На Оксфордском агаре (Oxford agar) листерий, выращенные в течение 24 ч, дают мелкие (1 мм), сероватые, окруженные черным ореолом колонии. Через 48 ч – более темные, около 2 мм в диаметре, с черным ореолом и углубленным центром.

Отобранные изолированные колонии, подозрительные на принадлежность к L. monocytogenes, пересевают на среды: МПА с 1 % глюкозы (рецепт 93 а), триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом TSYEA (рецепт 153) для получения изолированных колоний. Посевы термостатируют при температуре 30 °С в те­чение 24 ч.

Идентификация выделенных культур. Для определения при­надлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria по­лученные на средах чистые культуры окрашивают по Граму, микроскопируют, определяют наличие у. них каталазы, по­движность при двух температурах инкубирования – 22 и 37 °С, способность к ферментации маннита и ставят реакцию нит­рат-редукции.

Обнаружение в посевах грамположительных коротких тон­ких палочек, каталазоположительных, не восстанавливающих нитраты, не утилизирующих маннит, подвижных при 25 °С и неподвижных при 37 °С, указывает на принадлежность выде­ленных культур к роду Listeria.

Для определения вида L. monocytogenes изучают способность к ферментации рамнозы, ксилозы, наличие бета-гемолитичес­кой активности и проводят постановку КАМП-теста (САМР-test, см. гл. 9). Дифференцирующие признаки видов рода Lis­teria указаны в                      табл. 22.2.

L.monocytogenes обладают β-гемолитической активностью (об­разуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).

Постановку САМР-теста проводят для дифференциации L.monocytogenes от других видов листерий, обладающих гемо­литической активностью (см. гл. 9; САМР-тест). L.monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха S. aureus (положительная САМР-реакция) и имеет отсутствие измене­ний зоны гемолиза рядом со штрихом R. equi (отрицательная САМР-реакция).

Для определения лецитиназной активности дно двух чашек Петри со средой ГРМ № 1 (рецепт 154), содержащей желток куриного яйца и активированный уголь (1-я чашка) и желток куриного яйца без активированного угля (2-я чашка), делят на 25 квадратов. Исследуемые клоны и контрольные штаммы лис­терий высевают короткими штрихами по одному на квадрат. Высев каждой исследуемой культуры производят параллельно на обе чашки. Инкубируют 48 ч при 37 °С. Чашки просматри­вают в проходящем свете и устанавливают наличие активности в присутствии и отсутствие активированного угля. Сравнивают с контрольными высевами музейных штаммов. L.ivanovii дает плотную зону помутнения шириной 3–6 мм независимо от присутствия активированного угля. L.monocytogenes дает анало­гичную зону помутнения в присутствии активированного угля и не дает в его отсутствие. Непатогенные виды листерий не дают зоны помутнения.

Результат оценивают по каждой исследованной пробе от­дельно.

Возможно проведение исследования с использованием кондуктометрического анализатора "Бак Трак".

Выявление L. monocytogenes в реакции нарастания титра фага (РНФ) – качественный метод.

При необходимости для выявления L. monocytogenes в пи­щевых продуктах может быть использована реакция нараста­ния титра фага (РНФ) (как качественный метод). Реакция нарастания титра фага – быстрый специфический метод обна­ружения листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в исследуемом материале без выделения его культуры.

РНФ основана на свойстве индикаторного бактериофага строго специфично размножаться в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага сопровождается увеличе­нием количества его частиц и повышением титра.

РНФ может быть использована в качестве дополнительного, ориентировочного метода для обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах.