Глубинный метод посева в плотные среды. Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры 45±0,5 °С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4–5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязнила крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

Поверхностный метод посева на плотные среды. Среду наливают в чашку Петри и после застывания подсушивают. Для удаления влаги с поверхности среды чашки открывают, пере­ворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин при 48-50 °С.

На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разве­дение навески и равномерно растирают по поверхности шпа­телем – изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Метод посева в жидкие среды. В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведения навески. При определении количества микроорганизмов пита­тельные среды засевают продуктом и(или) разведениями наве­сок так, чтобы последовательно выдерживалась заданная крат­ность количества посевного материала.

Метод мембранных фильтров. Мембранные фильтры приме­няют для анализа легко фильтруемых жидких продуктов или продуктов, дающих растворы с высоким осмотическим давле­нием. При фильтрации раствора с высоким осмотическим дав­лением раствор предварительно разводят дистиллированной или пептонной водой в соотношении, позволяющем легко профильтровать разведенные растворы.

Жидкий продукт, содержащий небольшое число взвешен­ных частиц, фильтруют в два этапа. Для освобождения от частиц его фильтруют через фильтр со средним диаметром пор 4 мкм, а затем – через фильтр, диаметр и размеры пор кото­рого выбраны в соответствии с группой или видом выявляемых микроорганизмов. Оба фильтра культивируют в аналогичных условиях.

После осаждения микроорганизмов на фильтре из растворов с высоким осмотическим давлением или из растворов, содер­жащих антимикробные вещества, его промывают дистиллиро­ванной водой или пептонно-солевым раствором.

Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. Немедленно после окончания фильтра­ции фильтр переносят на плотные или в жидкие питательные среды. На плотную среду фильтр накладывают нижней сторо­ной так, чтобы она полностью соприкасалась с поверхностью среды. Посевы термостатируют в условиях, благоприятных для роста определяемых микроорганизмов.

Обработка результатов. После термостатирования, установ­ленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний на каждой чашке, содержащей менее 300 колоний (или менее другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

В некоторых случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, в присутствии инвазивных микроорганизмов). Эти случаи рассматриваются в соответствующих стандартах на кон­кретные методы испытаний.

Пример метода расчета (общий случай). Для получения до­стоверных результатов при подсчете количества колоний необ­ходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 15 колоний. Количество микроорганизмов N в 1 г (см³) пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле

где ΣС – сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний; V– объем посевного материа­ла, внесенного в каждую чашку, см³; n₁ – количество отобран­ных для подсчета чашек в первом разведении; n₂ – количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении; d – коэффициент разбавления, соответствующий первому разведе­нию.

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Для этого, если последняя цифра меньше 5, предшествующую цифру не изменяют; если последняя цифра равна или более 5, предшествующую увеличивают на единицу. Округление прово­дят поэтапно до получения двух значащих цифр.

За результат принимают количество микроорганизмов в 1 см³ (жидкие продукты) или в 1 г (прочие продукты), выраженное в виде числа от 1,1 до 9,9, умноженного на 10 в соответствую­щей степени.

ПРИМЕР.

Округление результата дает 19 000, или 1,9·10⁴ микроорга­низмов в грамме продукта.

Метод расчета при проведении идентификации. Если исполь­зуемый метод требует идентификации, определенное количе­ство колоний (обычно 5) пересевают с каждой чашки, ото­бранной для подсчета колоний. После идентификации рассчи­тывают для каждой чашки количество идентифицированных микроорганизмов а по формуле

где А – количество колоний, отобранных для идентификации; b – количество колоний, соответствующих критериям иденти­фикации; С – общее количество колоний.

Результат вычисления округляют до целого числа.

Количество N идентифицированных микроорганизмов, присутствующих в 1 г (см³) испытуемой пробы, рассчитывают как средневзвешенное значение, заменив ΣС на Σa.

ПРИМЕР.

Прямой подсчет жидкого продукта дал следующие резуль­таты:

• в первом выбранном разведении (10^-3) в двух чашках вы­явлено соответственно 66 и 80 колоний;
• во втором выбранном разведении (10^-4) – 4 и 7 колоний.

Результаты идентификации:

• из чашки с 66 колониями для идентификации отобрано 8 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следо­вательно, а = 50;
• из чашки с 80 колониями отобрано 9 колоний, из которых 6 соответствовали критериям; следовательно, а = 53;
• из чашки с 7 колониями отобрано 5 колоний, из которых 4 соответствовали критериям; следовательно, а = 6;
• из чашки с 4 колониями все 4 идентифицированы положи­тельно; следовательно а = 4.

Таким образом, количество обнаруженных в пробе микро­организмов составляет 5,1·10⁴                    в 1 см³.

Приближенные оценки количества микроорганизмов.

Если в каждой из двух чашек содержится менее 15 колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то рассчитывают среднее ариф­метическое у колоний, подсчитанных на этих чашках.

Результат выражают следующим образом:

• для жидких продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 см³ N_E= Υ,
• для прочих продуктов – приближенное количество микро­организмов в 1 г N_g = Υ/d, где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Если две чашки не содержат колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то результаты выражают следующим образом:

• менее 1 микроорганизма в 1 см³ (жидкие продукты);
• менее 1/d микроорганизмов в 1 г (прочие продукты), где d – коэффициент разбавления исходной суспензии.

Метод подсчета с использованием жидкой среды. Метод наи­более вероятного числа (НВЧ). Возможны два способа посева.

В наиболее часто используемом способе, называемом "симмет­ричным", применяется одинаковое количество пробирок в каж­дом разведении, объемы соседних разведений обычно соотно­сятся как 1:10. Этот способ используют, если нужно определить не только превышение определенных предельных норм, но и количество присутствующих микроорганизмов.

Используют также способ, называемый "асимметричным", который предусматривает разное количество пробирок в от­дельных разведениях.

В действующих стандартах рассматривается только "сим­метричный" способ с десятикратными разведениями.

В зависимости от требуемой точности результатов засевают необходимое количество флаконов или пробирок одним и тем же разведением (например, три, пять или десять). Как правило, применяемые методы требуют трех пробирок или флаконов на разведение.

Значения индекса НВЧ для приемлемых сочетаний находят по табл. 22.1. С помощью индекса НВЧ определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов С_S в заданном объеме V_S по Формуле

где М – индекс НВЧ, взятый из табл. 22.1 для базового разве­дения V_0; F – число, обратное коэффициенту разбавления ис­ходной пробы. Это разведение (1,0) использовано в табл. 22.1 как базовое разведение (обычно F = 10,100 и т.д.); V_S – задан­ный объем, выбранный для выражения содержания микроор­ганизмов; V₀ - объем, использованный для посева базового разведения.

Если наименьшее разведение из отобранных соответствует пробирке, приготовленной из среды двойной концентрации (посев 10 см³), индекс НВС, взятый из табл. 22.1, делят на 10.

Если НВЧ меньше 0,3 микроорганизма в 1 см³ (жидкие продукты) или в 1 г (другие продукты) и если была использо­вана методика, предназначенная для малых количеств микро­организмов, результаты должны выражаться следующим обра­зом: менее                                    1 микроорганизма в 1 см³ для жидких продуктов или 1 г для прочих продуктов.

ПРИМЕР.

Для твердого продукта установлен индекс НВС, равный 24; первая выбранная пробирка соответствует посеву 1 см³ исход­ной суспензии (F = 10), отсюда С_S в 1 г составляет

Метод обнаружения. Метод обнаружения – это метод, который определяет наличие или отсутствие микроорганизмов в заданном объеме продукта. Если не установлено иное вы конкретных стандартах на методы испытаний, количество Р испытываемого продукта смешивают (жидкие продукты) или гомогенизируют (прочее продукты) с 9 см³ или 1 г элективной либо селективной среды. Все среды применяют в расплавленном виде. После термостатирования на поверхности селективной агаровой среды получают несколько изолированных колоний (обычно пять) и подвергают их идентификации.

Иногда имеет смысл использовать для тех же целей две или более элективные или селективные жидкие среды, а также две или более селективные агаровые среды. Если обнаружен микроорганизм, то указывают, в какой навеске исследуемого продукта.