Еще одним направлением диагностического применения люминесцентной микроскопии является реакция иммунофлюоресценции. Эта реакция, как и любая серологическая реак­ция, основана на выявлении комплекса антиген–антитело, которое в этом случае производится с помощью люминесцент­ной микроскопии. Преимуществами этой реакции являются ее высокая чувствительность (выявляются отдельные микробные клетки, несущие определенный антиген), возможность наблю­дения локализации антигена в клетке, а также возможность обнаружения искомого антигена в присутствии других антиге­нов. Этот метод может быть использован также для обнаруже­ния антител. Суть метода заключается в том, что к молекуле антитела химическим путем (ковалентно) присоединяется флюорохром, который позволяет обнаружить антитело по его свечению при люминесцентной микроскопии.

В качестве таких флюорохромов чаще всего используют флюоресцеин, светящийся ярко-зеленым, и различные соеди­нения родамина, обладающего красной флюоресценцией. Флюо-рохромы, вернее, их соединения, реагирующие с молекулой белка (изотиоцианат флюоресцеина, тетраметилродамин изо-тиоцианат, сульфородамиц и др.), присоединяются к иммуно­глобулинам.

Было разработано несколько модификаций иммунофлюоресцентного метода, однако для диагностики обычно применяют прямой и непрямой методы. В прямом методе флюорохром присоединяют к антителам против искомого антигена. Прак­тически постановка прямого метода заключается в следующем: фиксированный мазок на обычном предметном стекле (или на стекле со специальными луночками) из исследуемого материа­ла помещают во влажную камеру, наносят меченную флюорохромом сыворотку, инкубируют, отмывают забуференным (рН 7,2–7,4) изотоническим раствором натрия хлорида, ополаски­вают дистиллированной водой, высушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Бактерии, несущие на поверх­ности антиген, реагирующий с содержащимися в сыворотке антителами, ярко светятся на темном фоне. Особенностью специфического свечения является флюоресценция в виде обо­дки вокруг бактериальной клетки. При исследовании материа­ла, с которым могут неспецифически связываться белки антисыворотки, меченной флюоресцеином, применяют контрасти­рование фона, добавляя к антисыворотке альбумин, меченный родамином, или синьку Эванса, обладающую красным свече­нием. Непрямой метод отличается от прямого тем, что он является двухэтапным. На фиксированный препарат наносят обычную, немеченую антисыворотку, инкубируют, отмывают и подсушивают. Затем на этот препарат наносят меченную флюорохромом антисыворотку, содержащую антитела против Иммуноглобулинов того вида животного, от которого была Получена специфическая сыворотка. Например, если специфи­ческая сыворотка против искомого антигена была получена иммунизацией кролика, то в качестве второй (люминесцирующей) сыворотки используют иммунную сыворотку против им­муноглобулинов кролика. Эту сыворотку получают иммуниза­цией глобулинами кролика других животных (козы, ослы). Таким же способом можно получить другие антивидовые сыворотки, в том числе к иммуноглобулинам человека. Благодаря этому непрямой метод может быть использован для обнаруже­ния не только антигенов, но и антител. Этот метод успешно применяется в диагностических целях при различных инфек­циях (микоплазмозы, хламидиоз, сифилис и др.) для обнару­жения антигенов и антител. В частности, при сифилисе эта реакция позволяет обнаружить специфические антитрепонемные антитела. С этой целью готовят мазок из трепонемного антигена. На этот мазок наносят сыворотку больного, затем флюоресцирующую сыворотку к иммуноглобулину человека. Если в сыворотке больного присутствуют антитела к нанесенно­му на мазок антигену, то при просмотре этих препаратов в люминесцентном микроскопе наблюдается яркое свечение. Яр­кость свечения обычно оценивают субъективно                            (от + до ++++).